全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 29(1)：7O一 73 2O09年 1月
甘薯和花生胰蛋白酶抑制剂的初步研究
田 军 ，苏 昌茂0，周先碗0
(1．中国科学院 研究生院，北京 1∞049；2．北京大学 生命科学学院，北京 1o0871；3．高等教育出版社，北京 1[)(]o29)
摘 要 ：许多植物蛋白制成品均含有抑制动物消化的蛋白酶抑制剂。目前 已从某些豆类及蔬菜种子中分离
出多种对胰蛋白酶具有抑制作用的活性物质。该实验以花生 、甘薯等为原料 ，通过 DEAE—Sepharose 4B FF阴
离子交换柱层析分离胰蛋白酶抑制剂，以 一苯甲酰一L一精氨酸乙酯(BAEE)为底物测定其对胰蛋白酶的抑制
活性；将具有抑制活性的组分通过 SDs—PAGE测定蛋白质相对分子质量(Mr)；以聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电
泳测定蛋白质等电点(pI)。结果显示 ，甘薯中至少有 4种胰蛋白酶抑制剂组分，相对分子质量为 2O～25 kD、
等电点在 pH5．O～6．6之间；花生中至少有三种胰蛋白酶抑制剂组分，相对分子质量为 3O～7O kD、等电点在
pH5．O～5．8之 间 。
关键词 ：胰蛋白酶抑制剂 ；等电聚焦电泳；底物
中图分类号 ：Q945 文献标识码：A 文章编号：1O()(j一3142(2∞9)O1一OO7O—O4
Preliminary study 0n the trypsin inhibit0I．S
in the sweet p0tat0 and peanut
TIAN Jun] ，SU Chang—Ma02．ZHOU Xia Wan2
r]．f ，“ ““ Ll z ， s z 。 ￡^ ( ^2 7 r q L．／ ， 7 ／S(“’，? t ．1h l_1ng l 0()04 9，C1ina；2．S‘， ，J。 。／’， ，厂f Sc 7 Jf， ．
P 足z7 zg “ ，I3eljlT1g]oO871．(、 m； ．H z ，￡ rEc／ ＆f f】”PH ，Be ng 1|j(]O29．( l1】a)
Abstract：The prOtease inhibitor inhibiting animal digestion exists in many plant products． ow，trypsin inhibiLors
have been isolated and purified from the beans and vegetab1 e seeds． In this work，trypsin inhibitors were extracted and
purified from peanut and sweet p0tato by DEA巨 Sepharose 4B FF c0lumn．Then the inhibition activities of the tryp—
sin inhibitors were deterInined using the BAEE as substrates．The re1ative m()lecL1lar weight(Mr)and isoelectric p0int
(pI)of trypsin inhibnors were determined by the SDSrPAGE and is0e1ectric focusing electrophoresis respectively．The
results sh。wed that there were at 1east four c。mp。nents of the trypsin inhibitors in the sweet p。tat0es．Ⅳ[r was ab。ut
2O一25 kD，p1 was between 5．O一6．6 and there were at Ieast three components of trypsin inh．bitors in the peanuts，
Mr was ab0ut 3O一7OkD，D1 was between 5．O一 5．8．
Key words：trypsin inhibitor；isoeIecu_ic f()cusing electrophores|s；substrate
胰蛋 白酶抑制剂是一种丝氨酸蛋 白酶抑制剂 ，
胰蛋白酶抑制剂在工业和医学上有用途很广 ，因此
开展对胰蛋 白酶抑制剂的研究具有一定的实际意义
和应用前景(Gumbmann等，l986；Trol等，1987；
Malkowicz等，2OO3；万善霞等，2∞3)。据文献报
道，在花生中有一种称之为 2S蛋白组分，对胰蛋白
酶具有抑制作用，此外，还对 a一淀粉酶有一定的抑
制作用，但对胰凝乳蛋白酶和胃蛋白酶无抑制作用。
该蛋白可能是以二聚体形式存在，氨基酸分析发现
它富含 Cys，属于 Bowman—Birk胰蛋 白酶抑制剂类
(BBI)。花生蛋 白是 目前广泛利 用的植物蛋 白，为
了避免在花生蛋白制品中残留的蛋白酶抑制剂对产
品质量造成的影响，可采用巯基还原剂在较低温度
下钝化其抑制活性(Tixier，1968；杨晓泉等，1998)。
收稿日期：2。c8一O4—29 修回日期：2。。8—11—30
作者简介：田军(1966一)，女，北京市人 ，在职硕士 ，副编审．生物化学与分子生物学专业．主要从事生物学教材及专著的编辑工作，(E—mal1)tianjun
@hep．com．cn。
1期 田军等 ：甘薯和花生胰蛋白酶抑制剂的初步研究 71
在甘薯贮藏过程中会产生一种对胰蛋白酶具有抑制
作用的物质 ，性质与大豆胰蛋 白酶抑制剂相似，称之
为甘薯贮藏蛋白。研究表明它是一类多基因家族编
码的蛋白，有两个亚基因家族 ，分别为 Sporamin A，
Sporamin B。它们在氨基酸组成、多肽图谱和免疫
特性上都非常相似。它们 的氨基酸序列与 大豆 中
Kunitz型胰蛋 白酶抑制剂相似。大豆胰蛋 白酶抑
制剂具有一定抗癌作用，甘薯胰蛋白酶抑制剂是否
有同样作用还有待进一步 的研究(文一等，20O3；程
龙军等 ，2OO1)。
本实验以花生、甘薯为材料，通过 DEAE—Seph—
arose 4B FF阴离子交换柱层析分离蛋白酶抑制剂 。
以BAEE为底物测定其对胰蛋白酶的抑制活性；通
过 SDs—PA( E测定蛋白相对分子质量和聚丙烯酰
胺凝胶等电聚焦 电泳测定蛋 白质 的 pI。以此对 花
生和甘薯中存在的胰蛋白酶抑制剂的基本性质进行
初步研究。
1 实验材料
1．1仪器
紫外检测仪(LKB BROMMA 2l38)，紫外一可
见分光光度计 (He iso ，UNICAM)，电泳 仪
(EPS60O，Pharmacia)，旋 转蒸发 仪 (Svc1()()H，Sa—
vant)，离心机 (Beckman J一3OI，Beckman)，电子天平
(Adventrure AR5 l2O，OHAUS Corp．)。
1．2试剂及材料
阴离子交换层 析介质：DEAE—Sepharose 4B
Fast F1ow(Pharmacia)；丙烯酰胺 (Merck)，载体两
性电解质 (pH2． 一1O．5，Pharmacia)， 一苯 甲酰一L一
精胺酸乙酯(简称 BAEE，国产)，甘薯(sweet p。ta—
to，Ipomoea batatas Lam．)，花生 (peanut，Arachis
hypogaea L．)。
2 实验方法
2．1胰蛋白酶抑制剂的提取与分离
2．1．1甘薯胰蛋白酶抑制剂的提取与分离 (1)甘
薯胰蛋白酶抑制剂粗提液的制备：甘薯，洗净去皮，
取 l96 g，切成条状，在 5O mmol／L pH7．5 Tris一乙
酸缓冲液(含 1 mmo1／I EDTA，1 抗坏血酸)中匀
浆，以8 OOO r／min离心2O min，上清液再以25 0O0
r／min离心 3O min，收集上清液。(2)DEAE—Sepha—
rose 4B FF阴离子交换层 析：取一支 lO cm×2．5
cm的层析柱，装入 4O mL DEAE—Sepharose 4B FF
层析介质。用 5O0 mI 1 mol／L NaCl～O．1 mo1／L
NaOH溶液再生 ，5O mmol／L pH7．5 Tris一乙酸缓冲
液平衡，紫外检测仪绘出基线稳定。然后取 2OO mL
甘薯提取液上柱吸附，以同一缓 冲液平衡至基线稳
定。用 O～O．5 mol／L NaCl溶液线性梯度洗脱 ，收
集洗脱峰。
2．1．2花生胰蛋 白酶抑制剂的提取与分离 (1)花
生胰蛋白酶抑制剂粗提液的制备：5O g花生仁洗
净 ，50 mm01／L乙酸溶液 中浸泡过夜后去表皮，置
于 25 mmol／L，pH8．O Tris—HCl缓冲液中匀浆，然
后以 25 OOO r／min离心 3O min，收集上清液。(2)
DEAE—Sepharose 4B FF阴离子交换层析分离方法
与甘薯制备方法相同。
2．2 SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳
分离胶浓度为 15 ，浓缩胶浓度为 5 (郝福英
等，2004)。
2．3聚丙烯酰胺等电聚焦电泳
凝胶浓度为 7．5 ，交联度 C一3 ，两性电解
质的浓度为 2．5 。阳极 电极液 ：1 mol／L磷酸；阴
极电极液：0．5 mol／L NaOH(郝福英等，2OO4)。
2．4胰蛋白酶抑制活性测定
以 一苯甲酰一L一精氨酸乙酯(BAEE)为底物，测
定对胰蛋白酶的抑制活性。在 1．5 mL BAEE底物
缓冲液 (O．O5 mol／L CaCl2，O．O5 mo1／L pH8．0
Tris—HC1)中，加入胰蛋 白酶 8 g和蛋 白酶抑制剂
1O g，混匀后 ，室 温放置 2 min以上 ，再加入 1．5
mL 2 mmol／L BAEE底物混匀，立即在紫外分光光
度计 253 nm处测定吸光值，每 3O s读取一个数据，
以吸光值为纵坐标，时间为横坐标绘出活性曲线(郝
福英等，20O4)。
2．5 F0lin一酚法测定蛋白酶抑制剂浓度
以牛血清蛋白为标准蛋白。
3 实验结果
3．1甘薯胰蛋白酶抑制剂分离与活性测定结果
(1)将甘薯提取液通过 DEAE—Sepharose 4B
FF阴离子交换柱层析分离，获得 4个洗脱峰。层析
结果见图l。(2)经DEAE—Sephar0se 4B FF阴离子
交换柱层析从甘薯提取液中分离的 4个洗脱峰，选
择其中含量较高的 3个洗脱峰，分别测定其对胰蛋
72 广 西 植 物 29卷
白酶的抑制活性 ，测定结果 见表 l。
1．0
0
U
罱Q8
D
宝Q6
D
《
Q4
米
Q2
0
1 OO 20O 3O0 400 5O0 60O 7O0
体积 V0lume(mL)
图 1 甘薯提取液 DEAE—sepharose 4B
FF阴离子交换柱层析分离 图
Fig．1 DEAE—Sepharose 4B FF chromatographic
separation pr。fi1e of the sweet p。tato extracts
平衡液 ：5O mmol／L pH7．5 Tr 乙酸缓冲液；洗脱液 ：
A．5O mmol／L pH7．5 Tris一乙酸缓冲液 25O mL．B．O．5
m01／L Nacl一5O mm0l／L pH7．5 T rjs一乙酸缓冲液。
表 l 甘薯胰蛋白酶抑制剂的抑制活性测定结果
Tab1e l The inhibition activity of e、rery eluting peak
标准胰蛋 白酶活性 standard trypsin 89．1 89．1 89．1
acticity(u／min)
待测组分加入体积 VoIume( I )
待测组分活性 1nh_hition activity(u／mjn)
待测组分剂浓度 Density(mg／mI )
待测组分抑制 比活
activity(u／mg)
SDecIfic inh_hition
1O
8 5
0 933
911．O
1O 1O
23．4 1 9．1
1．583 O．95
1478．2 2O10．5
一 =样 崞
- 7 - ＼
峰二 峰三
_
●
、
100 2O0 300 400 500 6O0 7O0
体积 V0Iume(mL)
图 2 花生蛋白 DEAE—Sepharose 4B
FF阴离子交换柱层析分离图
F．g．2 DEAE—Sepharose 4 B FF chromatographic
separation profi1e of the peanut extracts
平衡液：5O mm01／L 1)H8．O Tm HCl缓冲液。洗脱液：A．5O
mmol／L pH8．0 T“s—HC1缓冲液，25O mL；B．0．5 m0l／L
NaCl一50 mmol／L pH8．O Tns—HCl缓冲液，25O mL。
FF阴离子交换层析分离 ，获得 3个洗脱峰，结果见
图2。(2)经DEAE—Sepharose 4B FF阴离子交换柱
层析从花生提取液中分离的 3个洗脱峰，分别测定
其对胰蛋 白酶的抑制活性，测定结果见表 2。
表 2 花生胰蛋白酶抑制剂抑制活性测定结果
Table 2 The inhibition activity of every eluting peak
3．3蛋白质相对分子质量测定
将对胰蛋 白酶具有抑制活性的蛋白峰通过
sDs—PAGE电泳分析，测定其相对分子质量。结果
甘薯蛋 白峰一、峰二 、峰四的相对分子质量分别为
22．O、23．O、24．O kD；花生蛋白峰一、峰二、峰三的相
对分子质量分别为 7O．O、50．O、3O～5O．O kD(图 3)。
2 3 4 5 6 7 kD
216-2o
45．0
35．0
25．0
18·4
14 4
图 3 SDS—PAGE电泳图谱
Fig．3 SDS—PAGE
加样顺序自左向右：1，2，3，花生蛋白洗脱峰一、峰二、峰三；4，
5，6，甘薯蛋白洗脱峰一、峰二、峰四；7，Marker(自上而下分别
为 116．O、66．2、|15．O、35．O、25．O、18．4、1 4．4 kD)。
3．4蛋白质等电点测定
将对胰蛋白酶具有抑制活性的蛋白峰进行聚丙
烯酰胺凝胶等电聚焦电泳分析，测定其等电点。结
果是甘薯蛋白峰一、峰二、峰四的 p1分别为 5．7、
5．8、5．2；花生蛋白峰一、峰二、峰三的 p1分别为
5．6、4．5、5．O(图 4)。
4 讨论
3．2花生胰蛋白酶抑制剂分离与活性测定结果
(1)将花生提取液通过 DEAE—Sepharose 4B 本实验选择甘薯和花生两种植物作为胰蛋白酶
0 6 2 8 4 0
∞uc∞DJ0∞D《世求
1期 田军等：甘薯和花生胰蛋白酶抑制剂的初步研究 73
抑制剂的研究对象，结果表明在甘薯和花生中均存
在着胰蛋白酶抑制剂 ，但它们对胰蛋 白酶的抑制活
1 2 3 4 5 6 7 pI
9 30
3．50
图 4 聚丙烯酰胺等电聚焦电泳【圣l
Fig．4 Isoelectric focusing electrophoresis patterns
加样顺序自左向右分别是 1，2，3甘薯蛋白峰一、峰=、峰四；4
Marker(自上而下 pI为 9．30，8．65，8．45，8．1 5，7．35，6．55
5．85，一5．2O，4．55，3．5∞ ；5，6，7花生蛋白峰一 、峰二 、峰三。
性有较大的差异，甘薯胰蛋白酶抑制剂的抑制比活
最高可达到2 O¨。O u／mg，而花生胰蛋白酶抑制剂的抑
制比活只有 6OO u／mg。从它们的相对分子质量和等
电点来看也存在一定的差异，甘薯蛋白的相对分子质
量与文献报道的相近；花生蛋白的相对分子质量与文
献报道的平均值l7 KD相差较大，这可能是所采用方
法提取f 1抑制剂是大分子或是聚合体。这说明甘薯
和花生中存在的胰蛋白酶抑制剂不具有同源性。不
同来源的植物材料所存在的胰蛋 白酶抑制剂不仅含
量有差异，而且对胰蛋白酶的抑制活性、相对分子质
量、等电点等性质上也存在着较大的差异。
参考文献：
郝福英 ，周先碗 ，黄玉芝，等．2()C4．生命科学实验技术 M]．北
(上接第 65页 Continue from page 65)
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