全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 31(5)：584～ 587 2011年 9月
DOI：10．3969／j．issn．1000—3142．201 1．05．006
应用 RAPD和 ISSR标记对 24份花生
栽培种材料进行遗传多样性分析
闫苗苗1，魏光成 ，谭秀华1，王传堂
(1．滨州医学院，山东 烟台 264003；2 山东省花生研究所，山东 青岛 266i00)
摘 要 ：利用 RAPD引物和 ISSR引物分 析我国 24份花生栽培种材料的遗传多样性 。结 果表 明：所选 的
RAPD引物和 ISSR引物 中分别有 13条引物和 1O条引物扩增出了清晰并可重复的条带 ，共扩增l出 123条带
和 87条带 ，平均每条引物扩增出 9．5条带和 8．7条带，其中多态性带分别 占条带总数的 47．15 和 57．47 ，
平均每条引物扩增出 4．7条和 5．7条多态性带 。在此基础上，根据 Nei—Li系数采用 UPGMA法进行了聚类
分析 ，可将 24份花生材料分成 4类 ：四粒红、汕油 523、冀花 2号、花育 16和粤油 7号等 5个品种聚为一类；花
育 2O、中花 8号聚为一类 ；黑花生单独为一类 ；其余 的花生聚为一类。RAPD和 ISSR标记能够揭示花生栽培
种的遗传多样性 ，在种质鉴定和遗传作图等方面具有一定应用潜力。
关键词：花生；RAPD；ISSR；聚类分析 ；遗传多样性
中图分类号：Q943 文献标识码 ：A 文章编号：1000—3142(2011)05—0584—04
revealed by RAPD／ISSR profiling
YAN Miao—MaioI。WEI Guang-Cheng ，TAN Xiu—Hua ，WANG Chuan-Tang
(1．Binzhou Medical Colege，Yantai 264003，China 2．Shandong Peanut Research Institute，Qingdao 266100，China)
Abstract：Genetic diversity in 24 accessions of cultivated peanut materials from China was evaluated based on RAPD／
ISSR profiling．Of the RAPD primers and ISSR primers tested，13 and 10 primers produced a total of 123 and 87 re—
peatable．clear and readable bands。among which 47．15 and 57．47 were polymorphic，respectively．On average，a
primer resulted in 9．5 and 8．7 bands，of which 4．7 and 5．7 were polymorphic．A dendrogram was constructed using
UPGMA algorithm based on Nei and Li’S similarity coefficient．which divided the 24 peanut materials into 4 groups．
Silihong，Sanyou 523，Jihua 2，Huayu 16 and Yueyou 7 were in one group．Huyu 2O and Zhonghua 8 clustered togeth—
er．Heihuasheng formed a separated group，and the rest peanut materials tested fell in a group．RAPD and ISSR are
useful for the genetic diversity studies of the cultivated peanut，and have potential in characterization of peanut germ
plasm and gene mapping．
Key words：peanut；RAPD；ISSR；cluster analysis；genetic diversity
作为世界上主要 的经济作物 ，花生栽培种是重
要 的食用植物油和优质蛋 白质来源(张梅等 ，2009)。
遗传标记技术是花生种质鉴定、遗传多样性分析以
及标记辅助育种不可或缺的重要手段 。然而 ，花生
栽培种遗传基础狭窄 ，细胞学标记 、生化标记极为缺
乏 ，包括 SSR、AFLP、SRAP等多种 标记虽 已有报
道，仍难以满足精细作图的需要。
在众多标记方法 中，RAPD标 记与 ISSR标记
收稿 日期 ：2010 08—26 修 回日期 ：2011-03—07
基金项目：山东省 自然科学基金(Y2008D11)[Supported by the Natural Science Foundation of Shandong Province(Yg008D11)]
作者简介 ：闫苗苗(1981一)，女，山东蓬莱市人，硕士研究生，讲师，(Email)yanmm81@163．com。
通讯作者(Author for c0rresp0ndence，E-mail：weiguangcheng2oo4@126．corn)
5期 闫苗苗等：应用 RAPD和 ISSR标记对 24份花生栽培种材料进行遗传多样性分析 585
由于不需要预知基因组序列信息 、操作简单 ，在多种
植物上得到了应用 ，并取得了理想效果 。但花生上
的 RAPD相关报道较少 ，利用 ISSR标记对我 国花
生进行研究未见报道。本研究 旨在探讨 RAPD和
ISSR在花生栽培种上的应用效果，并在此基础上 明
确我国 24份花生栽培种材料的遗传多样性水平。
1 材料和方法
1．1材料
实验所用的 24个花生品种(表 1)均购 自山东
农科院花生研 究所 。挑选种粒饱满 的 20粒花生种
子，自来水浸泡 ，25℃恒温培养箱 中培养 2～3 d，待
其发芽后移栽人花盆中。待其长出7～8片叶时便可
取叶提取总 DNA。所选用的 RAPD引物为从 A，C，
K(Operon Technologies)套引物中挑选出的 10碱
基引物 ；选用 的 ISSR引物 为不列 颠哥伦 比亚大学
(UBC)生物技术实验室设计 的引物 ，这些引物大部
分是 16或 17个碱基，均由上海生工合成(表 2
表 1 实验所用花生品种
Table 1 Peanut cultivars used in the study
1．2方法
1．2．1供 试花 生基 因组 DNA 的提取 采用改 良
CTAB法提取花生基因组 DNA(梁雪莲等，2007；胡
维新 ，2003)。
1．2．2 RAPD引物 筛选及其检测 以花育 16和中
花 8号这两个材料的模板 DNA对 6O条 RAPD引
物进行筛选，共筛选出条带清晰、多态性理想的引物
13个(表 2)。RAPD反应体系的最佳条件是利用
L (5 )正交表来探索得到的：每 2O L体系中含有
1O×Buffer 2．0 L，2．5 mmol·L- MgC12 2．0 L，
10 mmol·L～dNTP 0．5 L，10 mmol·L 引物
1．0 L，100 ng· L DNA模板 0．8 L，5 U ·
Taq酶 0．4 L，去离子水 13．3 L；热循环程序为：
起始解链 94℃ 3 rain，然后 94℃ 30 S。37℃ 45 S
和 72℃ 1 rain，40个循环，最后 72℃延伸 10 rain。
扩展产物用 2％琼脂糖凝胶电泳检测 ，然后用 EB染
色，凝胶成像系统中观察并拍照。
表 2 PCR扩增结果
Table 2 PCR amplification results
引物编号及序列
Primer code
and sequence
总条 多态性
带数 条带数
Tota1 Polymorphic
bands bands
S29 GGGTAACGCC
S3 l CAATCGCCGT
S37 GACCGCTTGT
S39 CAAACGTCGG
$40 GTTGCGATCC
$63 GGGGGTCTTT
$69 CTCACCGTCC
S75 GACGGATCAG
S369 CCCTACCGAC
S370 GTGCAACGTG
S374 CCCGCTACAC
$375 CTCCTGCCAA
S376 GAGCGTCGAA
UBC845(CT)8RG
UBC848(CA)8RG
UBC855(AC)8YT
UBC856(AC)8YA
UBC857(AC)8YG
UBC859(TG)8RC
UBC840(GA)8YT
UBC825(AC)8T
UBC835(AG)8YTO
UBC818(CA)8G
5O．O
42．9
50．O
45．5
42．9
5O．O
50．0
50．O
46．2
45．5
58．3
28．6
44．4
100．0
85．0
88．0
20．O
67．O
44．O
56．0
25．0
33．0
25．O
1．2．3 ISSR引物筛选及其检测 以花育 16和中花
8号这两个材料 的模板 DNA对 5O条 ISSR引物进
行筛选，共筛选出条带清晰、多态性理想的引物 13
个(表 2)。ISSR(李文表等，2006)反应体系经过优
化和筛选后其最佳的条件是：25 L扩增反应体系
中含有 10×Buffer 2．5 L，2．5 mmol·L～MgCI2
2．2 L，10 mmol ·L- dNTP 0．9 L，10 mmol ·
L- 引物 1．2 L，100 ng · L- 模板 DNA 1．5 t*L，
5 U · L Taq酶 0．3 L，去离子水 16．4 L。热
循环程序为：起始解链 94℃ 7 rain，然后 94℃ 3O
S。52℃ 45 S和 72。C 2 rain，40个循环 ，最后 72℃
延伸 10 min。扩展产物用 2 琼脂糖凝胶电泳检
测，然后用 EB染色，凝胶成像系统中观察并拍照。
一一一
4 3 5 5 3 3 5 6 6 5 7 2 4 9 U 7 1 6 4 5 2 3 2
8 7 n 7 6 u 7 9 9 8 5 9 9 9 8 9 8
586 广 西 植 物 31卷
图 1 花生的 DNA电泳图
Fig．1 E1ectrophoresis of DNA extracted from peanut
1．2．4统计分析方 法 用 BiolD软件估计每条片
段的分子大小。当有条带出现时记作 1，没有条带
出现时记作 0。应用 NTSYS 2．0可 以计算这个物
种的遗传相似度 。GS=2N ／(N +N，)，N 表示基
因型间共有条带的数 目，运用 MVSP(Multi—variate
statistical package)统计软件 ，根据 Nei—Li系数 ，进
行 UPGMA法聚类分析 。
2 结果与分析
2．1 DNA 提取 结果
花生基 因组 DNA 琼脂 糖凝 胶 上 电泳结 果显
示 ，电泳条带为清晰、整齐均匀 的一条带 ，背景清晰
(图 1)。用 Eppendorf BioPhotometer测得 ，oD260／
OD 。的值在 1．8左右 ，说 明纯度较好 。
2．2 RAPD和 ISSR图谱分析
所选的 17条 RAPD引物 和 13条 ISSR引物
中，分别有 13条和 1O条 引物各扩增出清晰并可重
复的 123条带和 87条带 ，平均每条引物扩增 出 9．5
条带和 8．7条带，其 中多态性带 58条和 50条 ，占条
带总数的 47．15 和 57．47 ，平均每条引物扩增出
4．7条和 5．7条多态性带 (图 2～3)。这些可重复的
清晰明亮 的条带就是所要研究的产物 (表 2)。
图 2 24份种质DNA的RAPD图谱(引物 s39)
Fig．2 RAPD-PCR amplification of DNA from 24 peanut germplasms using primer$39
M．引物 ；1-24．24个花生品种的泳道 。下同。
M．Marker；1-24．Lanes of 24 cultivars．The same below．
2．3基于 RAPD和 ISSR指纹图谱的遗传和聚类分析
依据 Nei—Li系数将供试 的 24个 品种的花生聚
为 4类 ，其中黑花生单独成一类 ，它与其它三类的遗
传相似性 系数仅有 0．40。花育 20和中花 8号聚为
一 类，其 GS值为 0．75，四粒红、汕油 523、冀花 2
号 、花育 16和粤油 7号五个品种 聚为一类 ，其 中四
粒红与其它 四个品种的 GS值只有 0．65，这五个 品
种聚为一类且 GS值 较低 ，说明来 自不 同地理 区域
的品种其相似性较小。其它 16个品种聚为一类。
供试材料 的 Nei-Li系数分析结果表明，相似系
数 GS变异较大 ，在 0．27(13号和 17号)到 0．92(花
育 17和 白沙 1016)之间，平均 GS值为 0．65。24份
样品中，黑花生 和其 他 23份样 品的相 似性系数 最
小 ，说 明黑 花生和其他 品种 花生 的亲缘 关系最远 。
其它三类的 GS值在 0．65(四粒红和其它4个品种)
到 0．92(花育 17和白沙 1016)之间，GS值变异也较
大 ，这说明所研究的这 23份花生栽培种材料 中存在
较丰富 的遗 传 多 样 性 。这 一 结 论 与 张 建 成 等 ，
(2005)利用 SRAP技术所得的结论基本一致。
3 讨论
3．1基因组总 DNA提取
DNA的提取是植物分子生物学研究的重要技
5期 闫苗苗等：应用 RAPD和 ISSR标记对 24份花生栽培种材料进行遗传多样性分析 587
图 3 24份种质 DNA的 ISSR图谱(引物 S39)
Fig．3 ISSR—PCR amplification of DNA from 24 peanut germplasms using primer S3 9
0．4 O．5 0．6 0．7 0．8 0．9
Nei＆ Li‘s Coefficient
白沙101
花育17
花育19
鲁花11
花育22
四粒红
汕油523
冀花2号
花育 6
粤油7号
图 4 24份花生种质遗传关系树状图
Fig．4 UPGMA cluster analysis for
24 peanut germplasms
术环节之一，高质量的 DNA是分子实验重复性和
可靠性 的保证 。本 实验 在胡 维新 (胡维新 ，2003)
CTAB法的基础上稍做修改，提取的 DNA质量较
高 ，oD 。／OD28。大于 1．8，oD 。／OD2 大于 2．0，适
合于 PCR等分子生物学研究。在实验中遇到的主
要问题是部分品种 DNA在提取时褐化或蛋 白质含
量较高 。植物含有较多的酚类物质容易褐化 ，为防
止褐化解 决 的办法 是加 入适量 的聚维酮 (PVP)，
PVP与多酚结合形成复合物，从而可有效避免多酚
类化合物介导的 DNA降解；研磨全过程应尽量在
冰浴环境 中，并加快研磨速度 。个别 品种蛋 白质含
量较高，可用氯仿 ：异戊醇(24：1)再抽提一次，效
果较理想 。本实验室 用的提取缓 冲液 中的 CTAB
是一种 阳离子去污剂，它能与核酸形成复合物，这些
复合物在低盐溶液 中会因溶解度 的降低而沉淀 ，而
在高盐溶液中可解离，从而使 DNA和多糖分开，再
用乙醇 沉 淀 DNA 而 除 去 CTAB，不 妨 碍所 提 取
DNA的质量。
3．2 RAPD和 ISSR分析在花生上的应用效果
RAPD和 ISSR技术作为一种操作简单的分子
标记技术在植物种质资源研究中已得到了广泛应用
(何华勤等，2004；Qian等，2001；王利群等，2009；周
延清等，2004；Galvfin等，2003；He等，2006；Bhat
等 ，1999；Raina等 ，2001)，但 在花生上的相关报道
较少 。本研究证 实，RAPD和 ISSR标记能 够揭示
花生栽培种的遗传多样性，在种质鉴定和遗传作图
等方面具有一定应用潜力。
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锰 趔 幛
生如
潮 勰 生 堋 花育花城∞育育花花花义黑花中恭吐花略花中豫红兴
5期 夏国华等：高野山龙头草——中国唇形科植物新记录 583
稀 ，仅节上略密。叶片揉碎后有恶臭味 ，纸质 ，心形
至卵状心形 ，长 2．8～4．5 cm，宽 2～3．5 cm，通常以
生于茎 中部 的叶较大 ，先端急尖至短 渐尖 ，基 部心
形 ，边缘具圆齿 ，上面被稀疏糙伏毛 ，下面被稀疏柔
毛 ，叶脉隆起 ，背面紫色，具下凹腺点 ；叶柄长 0．5～
3．5 cm，以茎中部者较长，向顶端渐短，两侧边缘具
稀疏长柔毛。花通常成对着生于茎上部 2～3(～7)
节叶腋，苞片披针形至钻形，边缘具齿；花梗长 2～6
mm，被柔毛，近基部或中部具 1对苞片，苞片钻形 ，
具细齿 。花萼 在 花 时筒状 ，口部微 张 ，长 12～ 14
mm，具 15脉 ，外 面被微柔 毛，二唇形 ，上唇 3裂 略
高 ，下唇 2裂 ，裂 片卵状三角形 ，顶端渐尖 ，具缘毛。
花冠淡红色至紫红色 ，长约 3．8 cm，冠筒管状 ，中部
以上逐渐扩大，脉上具长柔毛，余被稀疏短柔毛；檐
部二唇形，上唇直立，2浅裂，下唇增大，前伸，中裂
片舌状 ，具有紫红色斑块 ，顶端 2浅裂，侧裂片较小 ，
长圆形，长为中裂片长的 1／3，上唇及下唇内侧均无
毛 ；雄蕊 4，不伸 出花冠，1对着生于上唇近喉部 ，略
短 ，另 1对着生于侧裂片下部花冠管中部 ，略长；花
丝微扁 ，无毛 ；花药 2室，无毛，淡紫红色 ，成熟后贯
通成 l室；子房 4裂，被毛；花柱细长，仅柱头伸出花
冠；柱头 2裂 ，淡紫红色；花盘杯状 ，裂片不明显 ，前
方呈指状膨大。小坚果长椭圆形，黑色，具纵肋 ，长
约 3 mm。花期 3～6月 ，果期 6～7月 。
产于浙江桐庐 县、泰顺县 、龙泉市 和福建将 乐
县 、光泽县 ，生于海拔 500～1 400 m较 阴湿 的竹林
和阔叶林下。2009—05—15，李根有、张芬耀等，桐庐，
500 m；2009—07—23，李根有 、马丹丹等 L0968，凤 阳
山，1 400 m；李根有 、陈征海等，泰顺乌岩岭 ，L0908，
1 000 m(ZJFC)；夏国华、李根有等 20110617，松阳
箬寮 ，680 m。
致谢 感谢福建新日鲜集团有限公司陈新艳同
志提供 高野山龙 头草在福建的分布资料。
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