全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 28(6)：790— 794 20O8年 11月
沼气池宏基因组文库中未培养微生物
I]}一葡萄糖苷酶基因的克隆与鉴定
唐咸来1，2，车志群1，3，4，李双喜 ，3，4，蒋建林1，3，4，
罗奉奉 ，3，4，武 波 ，3，4
(1．广西大学 生命科学与技术学院 ，南宁 530005；2．广西壮族 自治区科学技术厅 ，南宁 530005 3．广西亚热带
生物资源保护利用重点实验室，南宁 530005；4．微生物及植物遗传工程教育部重点实验室，南宁 530005)
摘 要：以间接提取法提取了沼气池样 品的微生物宏基因组 DNA，用柯斯质粒载体 pWEB：TNC构建了一个
含三万个克隆的沼气池宏基因组文库，对文库中的克隆随机分析表明，该文库的外源片段平均长度为40 kb，
文库的总容量为 1_2×106 kb。对其中的一个在七叶苷平板上显色的阳性克隆 pGXN100进行进一步亚克隆、
测序和序列分析。结果表明，pGXN100上有一个全长为 1 863 bp的 ORF，编码 621个氨基酸组成的蛋 白质。
将该基因命名为Unglul00。与产气克雷伯菌属的一个 B一葡萄糖苷酶基因AN292在核苷酸和氨基酸水平上
分别有 76 和85％的同源性，利用SMART软件进行预测表明，Unglul00可能是PTS中p一葡萄糖苷酶特异
性的转运蛋 白组件。 ’
关键词：沼气池；宏基因组文库；7-葡萄糖苷酶
中图分类号 ：Q943．2 文献标识码 ：A 文章编号：1000—3142(2OO8)O6—0790—05
Cloning and idientifcation of l ●’ n gucosidase gene 0=【
uncultured nncroor~anlsms[rom bioRas diRester · l ● ● n l ■ 1■
TANG Xian-Lai 一，CHE Zhi—Qun ，0”，LI Shuang-Xi ，0一，
JIANG Jian-Lin1，3一，LUO Feng-Feng ，3一，WU Bo ，3，4
(1．Colege of Li Science and Biotechnology，Guangxi University，Nanning 530005，China；2．The Science and
Technology Department of Guangxi，Nanning 530005，China；3．Guangxi Key Laboratory of Subtropical
Bio-resource Conservation and Utilization，Nanning 530005，China；4．Key Laboratory of Education
Ministry for Microbial and Plant Genetic Engineering，Nanning 530005，China)
Abstract：The metagenomic DNA of uncultured microorganisms from biogas digester was extracted by indirect ex—
traction，end—blunted and ligated with cosmid vector of pWEB：TNC．A metagenomic library containing 30 000 clones
was constructed，the stochastic Analysis of the library indicated that：the average size of the foreign DNA fragments
was 40 kb and the capacity of the DNA cloned in the library was 1．2×10 kb．One of the positive clones pGXN100
that show black hydrolysis circles in Esculin plates was subcloned，sequenced and analysed．The results showed that
the putative~glucanase gene had a 1 863 bp ORF，encoding a protein with 620 amino acids sharing 76 and 85％ i—
dentity with another~-glucanase gene AN292 for DNA and protein levels respectively．The structure functional do—
main analysis of Unglul00 using SMART software showed it maybe one of beta—-glucoside specific PTS system trans’-
port proteins．
Key words：biogas digester；metagenome；~glucosidase
收稿日期：2008-06-25 修回日期 ：2008—08一i7
基金项目：广西科技攻关项目(桂科攻033002—5)[Supported by Key Technologies Research and Development Program of Guangxi(033002—5)3
作者简介：唐咸来(1967一)，男，广西灌阳县人，博士，主要从事分子生物学研究，(E—mail)xhang163@163．corn。
6期 唐咸来等：沼气池宏基因组文库中未培养微生物p一葡萄糖苷酶基因的克隆与鉴定 791
纤维素是由 葡萄糖以 1，4糖苷键连接而成
的直链状大分子，是自然界中分布最广、含量最为丰
富的碳水化合物，也是地球上最大量的可再生性天然
资源，但纤维素复杂的内部结构却造成绝大部分难以
被分解利用。纤维素酶(celulase)是一类能协同作用
将纤维素降解生成葡萄糖的一组酶的总称，主要分为
3类：内切葡聚糖酶(endo-1，4-O-D-glucanase，EC3．2．
1．4)、外切葡聚糖酶(exo-1，4-~-D-glucanase，EC3．2．
1．91)、 葡萄糖苷酶(~-glucosidase，EC．3．2．1．21)
(Lynd等，2002)。纤维素的降解是一个复杂过程，其
最大特点是协同作用，内切葡聚糖酶首先随机水解纤
维素内部的13-1，4糖苷键，产生大量带非还原性末端
的小分子纤维素，外切葡聚糖酶从这些非还原性末端
上依次水解 1，4糖苷键，生成纤维二糖及其它低分
子纤维糊精，在 p一葡萄糖苷酶的作用下水解生成葡
萄糖分子(Tomme等，1995)。
沼气是 21世纪生物能源的主要形式之一，而纤
维素酶中的 一葡萄糖苷酶在沼气厌氧发酵过程中具
有催化纤维素类物质水解生成葡萄糖的重要作用，
是纤维素降解的关键限速酶，极大的限制了其降解
效率和产气速率(Anish等，2007)，并且也是一类在
食品 (Belancic等，2003)，农 业 (Verdoucq等，
2004)，医药(Liou等，2006；Sun等，2005)上具有广
泛用途的优势酶。目前国际上对来自于完全厌氧的
环境下的工业沼气池中的p一葡萄糖苷酶的研究暂时
没有。该课题利用土壤宏基因组学技术，首先构建
高容量的来自于农村自用沼气池的未培养微生物宏
基因组文库，集中开发厌氧体系环境下的 p一葡萄糖
苷酶基因资源，同时为进一步利用具有良好的生化
性质的酶基因构建优势基因工程菌奠定基础。
1 材料与方法
1．1材料
1．1．1细菌菌株和质粒 本工作所用细菌菌株和质
粒见表 1。
1．1．2培养基、培养条件和抗生素及其用量 文库
构建使用 LB和LA培养基，B一葡萄糖苷酶的筛选采
用含有 0．1 七叶苷和 0．25 9／6柠檬酸高铁铵的LA
培养基。液体培养 于 37℃摇床震荡培养 (200
rpm)，平板培养于 37℃恒温箱倒置培养。氨苄青
霉素的使用终浓度为 100／*g／mL，氯霉素的使用终
浓度为 12／~g／mL。
1．1．3酶和试剂 限制性内切酶、T4DNA连接酶、
pGEM—Teasy载体等购自Promega公司，文库构建
试剂盒购自Epicentre公司，PVPP、Sephadex G200
和七叶苷等购自sigma公司。其他均为国产分析纯
试剂 。
1．1．4样品 来源于南宁市武鸣县农村自用沼气池。
表 1 供试细菌菌株和质粒
Table 1 Bacterial strains and plasmids used in this study
1．2方 法
1．2．1宏基因组DNA的提取、纯化和回收 能否获
得高质量环境样品中的 DNA是宏基因组文库构建
的关键之一，其提取方法主要分为 2种：直接和间接
提取法，沼气池宏基因组文库总 DNA的提取采用
间接提取法。先采用物理方法将微生物细胞从样品
中分离出来，然后用较温和的方法抽提 DNA，此法
可获得较大片段的DNA(20—2ookb)且纯度较高。
得到的DNA样品过 Sephadex G200(含有 2
PVPP)层析柱进一步出去腐殖酸(Yong等，1993)，
将已经纯化过的DNA样品采用电洗脱法回收大小
适中的片段，已备后续实验用。
1．2．2 16sDNA文库的构建和生物信息学分析 以
沼气池宏基因组 DNA为模板，采用细菌通用引物
5 一AGAGTTTGATCCTGGCTCA一3 (E． li bases
792 广 西 植 物 28卷
8 to 27)和 5 一TACCTTGTTACGACTT-3 (E．coli
bases 1507 to 1492)(Medlin等，1988)，采用常规的
PCR反应体系，扩增细菌的 16S rDNA片段。回收
PCR产物后，以 pMD18一T Vector为载体构建 16S
rDNA文库(蒋建林等，2008)。
1．2．3沼气池宏基因组文库的构建 沼气池宏基因
组文库的构建参照 Epicentre公司 pWEB：TNC
Cosmid Cloning Kit试剂盒产品说明书。回收 3O一
50kb的DNA片段并末端补平后，与cosmid载体连
接、包装、侵染宿主菌 Ep工100，侵染产物涂板后用
于构建文库
1．2．4文库中J3一葡萄糖苷酶活性克隆的筛选 将文
库克隆点板到含 0．1 七叶苷和 0．25 o,4的柠檬酸高
铁铵的IA 平板上，培养 12~16 h后，用氯仿熏蒸 15
min，37℃放置 2 h，菌落周围显黑色即为阳性克隆。
1．2．5系统进化树构建 J3一葡萄糖苷酶 Unglul00
的氨基酸序列 GenBank和Cazy上登陆的部分 p一葡
萄糖苷酶的氨基酸序列(表 2)用 ClustalX1．8软件
进行完全比对，将 比对结果用系统进化分析软件
Mega2．1分别进行 Neighbor—joining(NJ)分析，绘
表 2 系统进化分析所用的 葡萄糖苷酶
Table 2 i?-glucosidase used for phylogenic analysis
制系统进化树 。
2 结果与分析
2．1沼气池未培养微生物总 DNA的提取和纯化
用间接提取法获得的沼气池宏基因组总 DNA，
经 Sephadex G200(含有 2 PVPP)层析柱进一步
纯化和透析袋电洗脱回收后如图 1所示。
2．2沼气池宏基因组文库的构建和筛选
该文库包含约三万个克隆，随机抽取其中14个
克隆用 BamH I进行酶切分析，结果显示所有的质
粒酶切带型各不相同，说明文库克隆的 DNA片段
随机性 比较强。文库 中外源片段的最大长度为 61
kb，最小长度为2O kb，平均长度为 4O kb，文库的总
容量为 1．2×10 kb．将文库克隆点板到含 0．1 七
叶苷和 0．25 9／6的柠檬酸高铁铵的 LA平板上进行
l3一葡萄糖苷酶活性筛选。
2．3 p-葡萄糖苷酶活性克隆pGXNIO0及其蛋白Un-
glulO0的鉴定
选择其中表达活性最强的克隆 pGXN100进行
亚克隆，最后将 J3一葡萄糖苷酶基因定位在 2．2 kb的
3 M 1 2
图 1 沼气池样品中未培养微生物总 DNA
Fig．1 The extracted metagenomic DNA of uncultured
microorganisms from biogas digester
M ：23kb；1：粗提的沼气池宏基 因组 DNA；2：经 SephadexG200
纯化的宏基因组 DNA；3；经电透析回收的宏基因组 DNA
M ：23kb；1．the raw metagenomic DNA from biogas digester；
2．the metagenomic DNA purified by SephadexG2OO；3．the
metagenomic DNA recovered by electroelution．
DNA片段上，并送交大连宝生物公司进行测序。结
果分析表明，该DAN片段上由一个全长为1 863 bp
的开放阅读框(open reading frame ORF)，并将此基
因命名为 unglul00。
Vector NTI软件分析 unglul00基因G+C含
6期 唐咸来等：沼气池宏基因组文库中未培养微生物 p一葡萄糖苷酶基因的克隆与鉴定 793
M1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2 1 3 1 4 M2
图2 气池宏基因组文库中重组
质粒的 BamH I酶切分析
Fig．2 Recombinant plasmids from biogas digester
metagenomic library digested with BamH I
M1：1kb Mark；M2：23kb Mark；1-14：Recombinant
plasmids digested with BamH I．
图 3 具有 p一葡萄糖苷酶活性的阳性克隆
及其最小亚克隆质粒的酶切带型
Fig．3 The clones which show 8一glucosidase
activity and the restriction pattern of
the smallest sub—clone plasmid
量为71 ，其编码蛋白由 621个氨基酸组成，蛋白
的分子质量(Mw)和等电点(PI)分别为 65kD和
5．69。与来源于产气克雷伯菌属的一个 J3一葡萄糖苷
酶基 因 AN292在 DNA 和氨 基 酸 水平 上 分 别有
76 和 85 的同源性 。
Unglul00蛋 白的氨基 酸序 列 ，经 SMART 网
站 (htp：／／smart．embl—heidelberg．de)对其功能结
构域进行分析后显示：该蛋白 N端 7—41、108—393、
468—600个氨基酸区域存在的PFAM结构分别和依
赖于磷酸烯醇丙酮酸的磷酸转移酶系统(PTS)的糖
基转运蛋白 PTS—EIIB、PTS—EIIC、PTS—EIIA一1具
有高度相似性，由此，我们得出结论，Unglul00蛋白
的催化功能域可能和磷酸转移酶系统(PTS)中的糖
基转运活性等功能有直接的密切的关系。
2．4系统进化分析
系统进化(图 5)显示 Unglul00与肠杆菌属处
于同一组中，和克雷伯氏菌属三者亲源关系最近；
Unglul00与耶尔森菌属、果胶杆菌属在进化树上相
对较远；与埃希杆菌属、李斯特菌属在进化树上相对
较远。该结果与 Blastx分析的 Unglul00基因编码
产物与肠杆菌属的 l3一葡萄糖苷酶特异性的 PTS系
统组件 IABC的同源性最高 的结果相符。据此可
以推断Unglul00蛋白可能是PTS中J3一葡萄糖苷酶
特异性的转运蛋白组件。
3 讨论
在能源危机日益严重的情况下，沼气做为21世
纪生物能源的主要形式正得到广泛的推广和利用
(中国生物产业发展战略研究课题组 ，2004)。其 内
容物主要为动物粪便、农作物秸秆等纤维素物质，但
由于纤维素内部结构的复杂性使其较难于降解，需
要内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、p一葡萄糖苷酶等多
种纤维素酶的协同作用才能完成 (Lange＆ Ahr—
ing，2001)。而 p一葡萄糖苷酶在沼气厌氧发酵过程
中具有催化纤维素类物质水解生成葡萄糖的重要作
用，是纤维素降解的关键限速酶，极大的限制了其降
解效率和产气速率。因此，开发耐热性稳定和高活
性的I3一葡萄糖苷酶对于大中型沼气工程的工业化生
产具有重大的理论和实际生产意义。
当前在 J3一葡萄糖苷酶基因的克隆和鉴定方面，
国内外的主要方法是从纤维素被活跃降解的环境中
100 200
图 4 Unglul00蛋白的功能结构域分析
Fig．4 The structure functional domain analysis of Unglu l 00 protein
794 广 西 植 物 28卷
0．O5
I I
图 5 Unglul00蛋白的系统进化分析
Fig．5 Phylogenic analysis of Unglul00 protein
P464265)
分离纯化产酶活性微生物 ，对所得的菌株鉴定并对
其产酶条件及酶学特性等进行研究后，在进一步用
分子生物学的方法对其进行克隆、鉴定和表达。而
在自然界中超过 99 的未培养微生物组成了地球
上生物多样性的主体(Arnann等，1995)，所以长期
以来微生物的纯培养方法严重地限制了我们认识微
生物的视野，使得微生物的多样性资源难以得到全
面的开发和利用。自从 l998年 Handelsman等人
提出宏基因组(Metagenome)的概念以来 ，宏基 因组
技术在开发未培养微生物 以及功能基 因、活性物质
等方面应用非常广泛(Schmeissor等，2007；Howard
等 ，2006；Lorenz& Eck，2005；Daniel，2005；Steele
& Streit，2005)，目前已经成功构建了土壤(eg：红
树林土壤)(蒋云霞等，2007)、海洋(eg：海底污泥)
(任海霞等，2006)、人唾液和牛的瘤 胃(赵广存等，
2005)等环境样品的宏基因组文库，但现在未见有构
建沼气池宏基因组文库并获得纤维素酶基因的报
到。本研究从沼气池中提取宏基因组 DNA并以此
构建文库，并以从中筛选到的一个活性较强的 p一葡
萄糖苷酶克隆为研究对象，对其进行了克隆和表达，
待 一葡萄糖苷酶在沼气发酵过程中的基因功能得阐
明后，我们就可以利用这些具有良好生理生化性质
的酶基因来构建优势高效的基 因工程菌，通 过开发
功能基因资源来缓和 21世纪能源危机的现象。
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