全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第6期
纤维素由多糖组成，在植物体中每年光合作用
可生成的生物质高达 1.5×103 亿 t，是世界上最多
的可再生生物质资源。但是由于纤维素的结构复杂，
目前这一巨大资源的绝大部分还不能被人类所综合
利用［1］。纤维素酶是能将纤维素降解并最终转化成
葡萄糖的一类酶的总称，包括内切葡聚糖酶（endo-1，
4-β-D-glucanase，EC 3.2.1.4， 简 称 EG）， 能 随 机 的
在纤维素分子内部切断 β-1，4-糖苷键 ；外切葡聚
糖 酶（exo-1，4-β-D-glucanase，EC 3.2.1.91， 简 称
收稿日期 ： 2013-12-13
基金项目 ：国家重点基础研究发展计划（“973”）（2010CB833801），国家自然科学基金重点项目（41230962）
作者简介 ：麦志茂，男，博士研究生，研究方向 ：海洋微生物酶的开发与利用 ；E-mail ：maizhimao@163.com
通讯作者 ：张偲，男，研究员，研究方向 ：海洋生物，海洋药物 ；E-mail ：zhsimd@scsio.ac.cn
红树林土壤微生物宏基因组文库的构建及两种新颖的
β-葡萄糖苷酶基因的鉴定
麦志茂  苏宏飞  李丽珍  张偲
（中国科学院南海海洋研究所 中国科学院海洋生物资源可持续利用重点实验室，广州 510301）
摘 要 ： 宏基因组技术是挖掘微生物新酶的重要途径。通过构建红树林土壤微生物 Fosmid 文库，共获得了约 100 000 个阳
性克隆，该文库外源插入片段平均长度约为 30 kb，文库容量达 3 Gb。通过对文库中 10 000 个克隆进行功能筛选，获得了 17 个具
有 β-葡萄糖苷酶活性的克隆。对其中 2 个表达 β-葡萄糖苷酶的克隆进行亚克隆，获得 2 个新颖的 β-葡萄糖苷酶的基因，分别命名
MhGH3 和 bgl66。生物信息学分析表明，MhGH3 基因由 1 992 个碱基对组成，bgl66 基因由 2 025 个碱基对组成。在氨基酸水平上，
MhGH3 和 bgl66 编码的蛋白质与 GenBank 数据库中已知 β-葡萄糖苷酶的一致性分别为 64% 和 55%。
关键词 ： β-葡萄糖苷酶 纤维素酶 红树林 宏基因组文库
Construction of a Mangrove Soil Metagenome Library and
Identification of Two Novel β-Glucosidase Genes
Mai Zhimao Su Hongfei Li Lizhen Zhang Si
（Key Laboratory of Marine Bio-resources Sustainable Utilization，South China Sea Institute of Oceanology，Chinese Academy of Sciences，
Guangzhou 510301）
Abstract:  Metagenomics provides a means of exploring new enzymes in microorganisms. A mangrove soil metagenome library with
100 000 clones was constructed. The average length of inserted DNA fragment is about 30 kb, and the total capacity of inserted DNA reached
about 3 Gb. Seventeen clones with β-glucosidase activity were detected by screening 10 000 fosmid clones. The subcloning and sequencing
revealed two novel β-glucosidase genes（MhGH3 and bgl66）. Bioinformatics analysis indicated that MhGH3 and bgl66 composed of 1 992 bp
and 2 025 bp in length, respectively. The deduced amino acid sequence of MhGH3 and bgl66 showed the highest sequence identity of 64% and
55% with the known β-glucosidase in GenBank datebase, respectively.
Key words:  β-Glucosidase Cellulase Mangrove Metagenomic library
CBH），能从纤维素分子还原端和非还原端以纤维
二糖为单位切断 β-1，4-糖苷键 ；β-葡糖苷酶（β-D-
glucosidase，EC 3.2.1.21，简称 BG），能水解纤维二
糖生成葡萄糖［2］。
在纤维素降解过程中，β-葡萄糖苷酶能水解纤
维二糖生成葡萄糖，解除产物纤维二糖对内切葡聚
糖酶和外切葡聚糖酶的抑制作用，在纤维素降解中
起着关键作用。但是许多微生物的 β-葡萄糖苷酶为
胞内酶或者产量很低，并且大部分 β-葡萄糖苷酶活
2014年第6期 169麦志茂等 ：红树林土壤微生物宏基因组文库的构建及两种新颖的 β-葡萄糖苷酶基因的鉴定
性易受末端产物葡萄糖的抑制［3］，所以挖掘酶活力
高，不受葡萄糖抑制作用的 β-葡萄糖苷酶在纤维素
转化生产燃料乙醇工业中有着重要的应用价值。
自然界中 99% 的微生物不易获得纯培养，未培
养微生物也是地球上最大的尚未开发的生物资源［4］。
宏基因组技术不依赖于微生物培养，以特定环境中
微生物总 DNA 为研究对象，大大增加了获得新的生
物活性物质的机会，是一条找寻新基因及新酶的新
途径。红树林环境周期性遭受海水浸淹，兼有陆地
和海洋环境的特点但又具有自身的独特性，其土壤
具有沼泽化特征，含盐浓度高，植物凋落物非常丰富，
富含木质纤维素，土壤微生物多样性高，大部分微
生物能分泌降解木质纤维素的酶类［5］。目前对红树
林土壤微生物纤维素酶的研究并不多，利用宏基因
组技术，通过构建红树林土壤微生物宏基因组文库，
有望获得新颖的纤维素酶及其基因资源。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株和质粒 本试验所用菌株和质粒，见表 1。
表 1 试验所用的菌株和质粒
菌株 质粒及其特性 来源
Escherichia coli DH5α
F-，φ80dlacZ △ M15，△（lacZYA-argF）U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17（rk
-，mk
+），phoA，
supE44，λ-，thi-1，gyrA96，relA1
本实验室保存
Escherichia coli EPI300
recA1，endA1，F– mcrA Δ（mrr-hsdRMS-mcrBC）φ80dlacZΔM15 ΔlacX74 recA1 endA1 araD139 Δ（ara，
leu）7697 galU galK λ– rpsL nupG trfA dhfr
Epicentre 公司
质粒 plasmids
pCC2FOS Fosmid 载体，具有氯霉素抗性 Epicentre 公司
pUC19 克隆载体，具有氨苄青霉素抗性 本实验室保存
fosSCSIO2 pCC2FOS 载体上克隆有 30 kb 宏基因组 DNA 片段，表达 β-葡萄糖苷酶活性 本工作
fosSCSIO3 pCC2FOS 载体上克隆有 41 kb 宏基因组 DNA 片段，表达 β-葡萄糖苷酶活性 本工作
pUC-MhGH3 pUC19 载体上克隆有 3.8 kb fosSCSIO3 上的插入片段，表达 β-葡萄糖苷酶活性 本工作
pUC-bgl66 pUC19 载体上克隆有 4.1 kb fosSCSIO3 上的插入片段，表达 β-葡萄糖苷酶活性 本工作
1.1.2 培养基、培养条件和抗生素及其用量 大肠
杆菌使用 Luria-Bertani（LB）培养基和 LA 培养基（LB+
1. 2% 琼脂），在 37℃条件下培养 16 h。筛选培养基
为含 0.1% 七叶苷和 0.25% 柠檬酸高铁铵的 LA 平板。
氨苄青霉素使用终浓度为 100 μg/mL，氯霉素使用终
浓度为 12.5 μg/mL。
1.1.3 酶和试剂 限制性内切酶、DNA 聚合酶、连
接酶等购自 TaKaRa 公司，Fosmid 文库构建试剂盒
购 自 Epicentre 公 司， 七 叶 苷（Esculin） 和 PVPP
（Polyvinyl Polypyrrolidone）购自上海生工公司，琼脂
糖为进口分装，其他试剂药品均为分析纯。
1.1.4 红 树 林 土 壤 样 品 红 树 林 表 层 土 壤（0-
10 cm）样品来源于海南省三亚市白鹭公园（18
15’04.43”N，109 31’07.62” E）， 采 集 的 样 品 放 入
-20℃冰箱保存。
1.2 方法
1.2.1 红树林土壤微生物总 DNA 的提取和纯化 红
树林土壤微生物总 DNA 的提取采用直接法，方法参
照文献［6］，略有改动。提取方法如下 ：
（l）称取 5 g 红树林土壤样品，放入 50 mL 灭菌
离心管中 ；（2）向样品中加入 13.5 mL DNA 提取缓
冲液 ：（100 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L EDTA［乙
二胺四乙酸钠］，100 mmol/L sodium phosphate［磷酸
钠］，1.5 mol/L NaCl，1% CTAB［十六烷基三甲基溴
化铵］，2% PVPP［交联聚乙烯吡咯烷酮］，pH8.0），
漩涡震荡 5-10 min，混合均匀 ；（3）将震荡后的样
品置于摇床中振摇 45 min，使得土壤匀质化，加入
1.5 mL 20% SDS，轻柔颠倒混匀，65℃水浴 3 h，每
隔 30 min 轻柔颠倒混匀样品 ；（4）水浴裂解后，在
10 000 g 离心 10 min ；（5）上清液中加入氯仿 / 异戊
醇（24∶l），混合均匀，在 10 000 g 离心 10 min。（6）
收集上清，加入 0.6 倍体积异丙醇，室温下沉淀 40
min，然后在 10 000 g 离心 15 min 收集核酸沉淀 ；
（7）用 70% 乙醇洗涤核酸沉淀 2 次，最后将沉淀溶
于 100 μL 无菌 TE 缓冲液中，0.8% 琼脂糖凝胶电泳
检测。（8）粗提的红树林土壤微生物总 DNA 通过脉
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第6期170
冲电泳进行纯化，同时回收 35-48 kb 的片段。
1.2.2 红树林土壤微生物宏基因组文库的构建 文
库 构 建 使 用 Epicentre 公 司 FOSTM Fosmid Library
Production Kit 试剂盒，将纯化好并且大小合适的
DNA 片段进行末端修复，然后与 pCC2FOS 载体进
行连接，噬菌体包装并感染大肠杆菌 EPI300，然后
涂布于含有 12.5 μg/mL 氯霉素的 LA 平板，37℃培
养 16 h。在平板上随机挑取 18 个克隆子进行诱导培
养，碱裂解法提取质粒，BamH Ⅰ酶切，通过脉冲
电泳检测插入片段的大小分布。
1.2.3 文库保存 短期保存 ：文库克隆在平板上培
养 16 h 后，在 4℃冰箱中可暂时保存 2-3 个月。单
克隆的长期保存 ：挑取单菌落于含有 LB 培养基的
96 孔板中，37℃培养 16 h，加入终浓度为 15％的甘
油，保存于 -80℃冰箱中。
1.2.4 β-葡萄糖苷酶活性筛选和克隆分析 配制含
有 0.1% 七叶苷和 0.25% 柠檬酸铁铵的 LA 筛选平板，
将文库中保存的克隆子接种至平板上培养 16 h，菌
落周围出现黑色水解圈的即为 β-葡萄糖苷酶活性克
隆。从筛选平板上挑取水解圈大的阳性克隆进行培
养，提取 Fosmid 质粒，并用 Sau3A Ⅰ进行部分酶
切，回收 1-5 kb 的片段，与经过 BamH Ⅰ酶切并去
磷酸化后的 pUC19 载体进行连接，转化 DH5α 宿主
菌，挑取在筛选平板产生黑色水解圈的亚克隆测序。
DNA 序列拼接后，采用 NCBI 的 Blastn 和 Blastx 进
行序列比对和分析。
1.2.5 系统进化分析 将获得的两种 β-葡萄糖苷酶
的氨基酸序列与 GenBank 中相似性最高的部分 β-葡
萄糖苷酶的氨基酸序列用 Clustal X 软件进行完全比
对，将比对结果用系统进化分析软件 Mega 4 进行
Neighbor-joining（NJ）分析，绘制系统进化树。
1.2.6 GenBank 索引号 β-葡萄糖苷酶基因 MhGH3
和 bgl66 在 GenBank 的 索 引 号 分 别 为 KF424271 和
KF777107。
2 结果
2.1 红树林土壤微生物宏基因组DNA提取和纯化
从红树林土壤中粗提 DNA，获得的 DNA 片段
远远大于 35 kb（图 1），利用枪头反复吹打对 DNA
进行切割，然后进行脉冲电泳分离纯化，同时回收
35-48 kb 的片段，纯化后的 DNA 大小在 35 kb 左右，
其纯度和大小满足 Fosmid 质粒文库构建要求。
48
kb
1 2 3
23
1 ：λMix ；2 ：λ-Hind Ⅲ digest ；3 ：红树林土壤宏基因组 DNA
图 1 红树林土壤中提取的宏基因组 DNA
2.2 红树林土壤宏基因组文库构建及质量评价
将包装好的噬菌体侵染大肠杆菌 EPI300，共获
得约 100 000 个克隆的文库，随机挑取 18 个克隆，
诱导使其产生高拷贝质粒后提取 Fosmid DNA，用
BamH Ⅰ进行酶切，脉冲电泳检测（图 2）。结果所
有质粒除了 1 个 8.1 kb 的载体片段外，都含有插入
片段，而且带型各不相同，其大小在 20-55 kb 之间，
平均长度约为 30 kb，文库容量达 3 Gb，说明文库的
容量大，插入片段多样性高。
48
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
kb
23
9.4
6.6
4.5
2.3
2
1 ：λMix ；2 ：λ-Hind Ⅲ digest ；3-20 ：BamH Ⅰ酶切的文库克隆的质粒
图 2 文库质粒的酶切分析
2.3 β-葡萄糖苷酶活性克隆的筛选
通过活性筛选，获得了 17 个表达 β-葡萄糖苷
酶活性的克隆（图 3）。提取活性克隆 Fosmid 质粒再
次转化大肠杆菌 EPI300，在含有七叶苷底物的平板
上仍然具有 β-葡萄糖苷酶活性，说明 β-葡萄糖苷酶
活性来自于 Fosmid 质粒中插入片段上的 β-葡萄糖苷
酶基因表达所产生。
2.4 两种β-葡萄糖苷酶基因的鉴定
2.4.1 MhGH3 基 因 的 鉴 定 从 红 树 林 土 壤 微 生
2014年第6期 171麦志茂等 ：红树林土壤微生物宏基因组文库的构建及两种新颖的 β-葡萄糖苷酶基因的鉴定
物宏基因组文库中选择 β-葡萄糖苷酶活性克隆子
fosSCSIO2 进行亚克隆，最终获得一个含有长约 3.8
kb 插 入 片 段 的 亚 克 隆 子 pUC-MhGH3， 测 序 后 用
NCBI 上的 ORF Finder 工具预测该 DNA 序列，得到
一个编码 β-葡萄糖苷酶基因的开放阅读框（ORF），
命名为 MhGH3。MhGH3 基因的 ORF 由 1 992 个碱
基组成，G+C 含量为 59%，其编码的蛋白质 MhGH3
在 GenBank 数据库中与来自 Sphingomonas sp. LH128
的 β-葡萄糖苷酶有 64% 的最高一致性。
MhGH3 由 663 个氨基酸组成，属于糖苷水解
酶 3 家族（GH3），用 SMART 工具（Simple modular
architectureresearch tool）对该基因编码的产物进行
结构预测，结果显示该 MhGH3 不含信号肽，自 N
端的第 140-449 位氨基酸为 GH3 家族功能域，第
523-661 位氨基酸为 GH3 家族 C 末端功能域，预测
分子量为 71.2 kD，理论等电点为 4.57。
2.4.2 bgl66 基因的鉴定 从红树林土壤微生物宏基
因组文库中选择 β-葡萄糖苷酶活性克隆子 fosSCSIO3
进行亚克隆，最终获得一个含有长约 4.1 kb 插入片
段的亚克隆子 pUC-bgl66，测序后用 NCBI 上的 ORF
Finder 工具预测该 DNA 序列，得到一个编码 β-葡萄
糖苷酶基因的开放阅读框，命名为 bgl66。bgl66 基
因的 ORF 由 2 025 个碱基组成，G+C 含量为 60.9%，
其编码的蛋白质 Bgl66 在 GenBank 氨基酸数据库中
与来自 Sphingomonas sp. PAMC 26605 的 β-葡萄糖苷
酶有 55% 的最高一致性。Bgl66 由 674 个氨基酸组成，
属于糖苷水解酶 3 家族（GH3），用 SMART 工具对
该基因编码的产物进行结构预测，结果显示该 Bgl66
蛋白序列 N 端第 1-23 位氨基酸为信号肽序列，第
79-339 位氨基酸为 GH3 家族功能域，第 373-662
位氨基酸为 GH3 家族 C 末端功能域，预测分子量为
71.4 kD，理论等电点为 4.29。
2.5 系统进化分析
分析系统进化树可知，MhGH3 与来源于单胞
菌属的 Sphingomonas sp. LH128 处于一组（图 4-A），
而 且 Blastx 分 析 表 明 MhGH3 也 与 Sphingomonas
sp. LH128 的 β-葡萄糖苷酶相似性最高，所以推断
MhGH3 可 能 是 来 自 单 胞 菌 属 的 细 菌。Bgl66 与 来
源 于 单 胞 菌 属 的 Sphingomonas sp. PAMC 26605 处
于一组（图 4-B），而且 Blastx 分析表明 Bgl66 也与
Sphingomonas sp. PAMC 26605 的 β-葡萄糖苷酶相似
性最高，所以推断 Bgl66 可能是来自单胞菌属的细菌。
3 讨论
从环境微生物中获取宏基因组 DNA 是构建文库
的关键步骤。红树林土壤有机质含量高，腐殖酸含
量较多，对 DNA 的提取造成很大的困难。针对这些
难题，目前已有关于红树林土壤总 DNA 提取的相关
文献报道［7，8］。本研究用含有 PVPP 的 DNA 提取液，
使粗提的总 DNA 中腐殖酸含量大大降低，并提取得
到大片段的 DNA。利用低熔点琼脂糖凝胶脉冲电泳，
有效地对 DNA 进行分离和纯化，获得了大小合适的
高质量红树林土壤微生物总 DNA。对文库的筛选方
法有基于活性的功能筛选和序列筛选两种方法，通
过功能筛选，有可能获得全新的功能特别的酶和基
因［9］。对 10 000 个克隆进行活性筛选，获得了 17
个具有 β-葡萄糖苷酶活性的克隆。最近的文献报道，
从 Fosmid 文库中获得纤维素酶阳性克隆的概率一般
为 1/10 000 或者更低［10］，我们获得阳性克隆的概率
比文献报道的高。通过对其中两个表达 β-葡萄糖苷
酶活性的克隆进行亚克隆，获得了两个 β-葡萄糖苷
酶基因，其编码的蛋白质序列与已知的 β-葡萄糖苷
酶相似性低，说明具有较高的新颖性 ；在数据库中
与之相似性高的 β-葡萄糖苷酶序列来源于基因组测
序，其酶学性质尚未表征。后续的试验将对获得的
新颖的 β-葡萄糖苷酶基因进行异源表达，研究其酶
学性质及其在工业中的应用。
4 结论
从红树林土壤样品中获得了大片段的总 DNA，
并构建了一个高质量的红树林土壤微生物 Fosmid 文
库，文库的库容量大，插入片段多样性高。从文库
图 3 具有 β-葡萄糖苷酶活性的阳性克隆
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第6期172
中鉴定两个编码潜在的 β-葡萄糖苷酶基因，为新颖
的 β-葡萄糖苷酶基因。
参 考 文 献
［1］ Saha S, Roy RN, Sen SK, et al. Characterization of cellulase-
producing bacteria from the digestive tract of tilapia, Oreochromis
mossambica（Peters）and grass carp, Ctenopharyngodon idella
（Valenciennes）［J］. Aquaculture Research, 2006, 37 ：380-388.
［2］ Voorhorst W, Eggen R, et al. Characterization of the celB gene
coding for beta-glucosidase from the hyperthermophilic archaeon
Pyrococcus furiosus and its expression and site-directed mutation in
Escherichia coli［J］. J Bacteriol, 1995, 177 ：7105-7111.
［3］ Wood TM, Mccrae SI. Purification and some properties of the
extracellular β-D-glucosidase of the cellulolytic fungus Trichoderma
koningii［J］. J Gen Microbiol, 1982, 128 ：2973-2982.
［4］ Amann RI, Ludwig W, Schleifer KH. Phylogenetic identification
and in situ detection of individual microbial cells without
cultivation［J］. Microbiol Rev, 1995, 59 ：143-169.
［5］ Hyde K, Lee S. Ecology of mangrove fungi and their role in
nutrient cycling ：what gaps occur in our knowledge? Asia-Pacific
Symposium on Mangrove Ecosystems ：Springer ；1995, 295 ：107-
118.
［6］ Zhou J, Bruns MA, Tiedje JM. DNA recovery from soils of diverse
composition［J］. Appl Environ Microbiol, 1996, 62 ：316-322.
［7］ 杨建 , 洪葵 . 红树林土壤总 DNA 不同提取方法比较研究［J］.
生物技术通报 , 2006（1）：372-377.
［8］ Jiang YX, Zheng TL. Evaluation of different extraction buffers on the
quality of mangrove soil DNA［J］. J Trop Oceanogr, 2011, 30（2）：
87-93.
［9］ Yun J, Ryu S. Screening for novel enzymes from metagenome and
SIGEX, as a way to improve it［J］. Microb Cell Fact, 2005, 4 ：8.
［10］ Kim SJ, Lee CM, Kim MY, et al. Screening and characterization
of an enzyme with beta-glucosidase activity from environmental
DNA［J］. J Microbiol Biotechnol, 2007, 17 ：905-912.
（责任编辑 李楠）
A
B
分枝节点上所标注的数字是采用邻位相连法经过 1 000 次 Bootstrap 法运算得到的百分数
图 4 MhGH3（A）以及 Bgl66（B）的系统进化树