全 文 ：·研究报告· 2006年第3期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
海绵是一种非常原始的多细胞动物[1],是目前发现海洋活性物质最多的海洋生物之一,在海洋药物研究
中具有重要的价值。海绵具有丰富的共附生微生物,涵盖了古细菌、细菌、蓝细菌、真菌等多种微生物[2]。越来
越多研究表明海绵活性物质与其共附生微生物有关[2]。由于海绵共附生微生物不易体外分离培养,使其直接
利用受到限制。基于宏基因组 DNA的功能基因筛选、克隆表达途径为利用海绵及其共附生微生物丰富的基因
资源提供了可能。海绵由于骨针等特殊结构导致获得大片段 DNA非常困难。同时海绵基因组庞大,构建库容
量巨大的海绵宏基因组文库也将是一个挑战[3]。Fosmid载体质粒可携带大的外源 DNA片段,克隆约 40kb的
真核基因,操作简便,现已被广泛的应用于功能基因组学的研究[4]。我们认为,在现阶段,以功能基因筛选为目
的的宏基因组文库不一定要追求最大库容量。在国内较早针对海绵共生微生物进行了系列研究[5~10],并已经建
立了大片段海绵 DNA的提取技术[11]。在此基础上,尝试建立海绵宏基因组文库,并对相关抗菌基因进行初步
筛选,希望为进一步利用海绵丰富的共附生微生物基因资源奠定基础。
1 材料和方法
1.1 海绵
澳大利亚厚皮海绵(Cranielaaustraliensis(Carter))采自海南三亚西岛周边 5~20米海域,由中国科学院海
洋研究所李锦和研究员鉴定。
1.2 大片段 DNA抽提[11]
无菌下切取海绵组织少许,置于适量无钙镁的人工海水 (CMFSW,31.6gNaCl、0.75gKCl、1.0gMgSO4、
海绵宏基因组文库构建及抗菌肽功能基因的初步筛选
吴杰 李志勇 张戌升
(上海交通大学生命科学技术学院 海洋生物技术实验室,上海 200240)
摘 要: 宏基因组文库技术是利用未培养微生物基因资源的有效途径。成功构建澳大利亚厚皮海绵的 Fosmid宏
基因组文库,插入片段平均大小为36.8kb。利用建立的宏基因组文库,采用PCR技术初步筛选到具有编码抗菌肽的功
能基因。这是我国首次尝试构建海绵宏基因组文库,对于今后开发利用海绵丰富的基因资源具有重要的意义。
关键词: 澳大利亚厚皮海绵 宏基因组文库 抗菌肽 功能基因
ConstructionoftheMetagenomicLibraryofSpongeCraniela
australiensisandAntibacterialPeptideGenePreliminaryScreening
WuJie LiZhiyong ZhangXusheng
(MarineBiotechnologyLaboratory,SchoolofLifeScienceandBiotechnology,
ShanghaiJiaoTongUniversity,Shanghai200240)
Abstract:Themetagenomiclibrary-basedtechniqueisanefectivestrategyfortheutilizationofun-culturedmi-
croorganisms.Inthispaper,themetagenomiclibraryofspongeCranielaaustraliensiswasconstructedsuccesfuly,where
theaverageinsertedlengthis36.8kb.Basedontheestablishedlibrary,anantibacterialpeptidegenewasobtainedprimely
usingPCR method.Thiswasthefirsttimetoaim toconstructaspongemetagenomiclibraryinChina,whichisof
greatvaluefortheutilizationofsponge-asociatedgeneresources.
Keywords:Spongecranielaaustraliensis Metagenomiclibrary Antibacterialpeptide Functionalgene
收稿日期:2006-04-04
基金项目:国家高新技术发展计划(863)(2004AA628060)和上海市青年科技启明星计划(04QMX1411)资助
作者简介:吴杰(1980-),男,浙江宁波,硕士研究生,从事海绵宏基因组研究
通讯作者:李志勇,男,教授,Tel:8651-34203036,E-mail:zyli@situ.edu.cn
生物技术通报Biotechnology Buletin 2006年第3期
2.4gTris-HCl、20mM EDTA、H2O1L、pH 7.0)中,无菌钝头镊子轻轻搅动、撕成细末,10000rpm离心去上清,
CMFSW清洗两次,10000rpm离心,得到的沉淀按每 40mg加入 100μlCMFSW进行悬浮,取上清液,10000rpm
离心得沉淀,90μl缓冲液(50mmol/L葡萄糖、5mM Tris-HCl、10mmol/LEDTA、pH 8.0)悬浮,再加入 180μl2×
TNPE(200mM Tris-HCl、200mM EDTA、200mM Na2HPO4、3M NaCl)以及 90μl2%SDS,室温放置 30min,之后加
入 360μl5%十二烷基肌胺酸钠的 TE溶液,10μlPK(10mg/ml),55℃水浴 3h,Tris-饱和酚:氯仿:异戊醇(25:24:
1)、氯仿:异戊醇(24:1)抽提,等体积预冷异丙醇沉淀,10000rpm离心 15min得沉淀,加入 500μl70%的乙醇洗
涤两次,室温风干,加入 35μl无菌 TE,经不含 DNA酶的 RNA酶消化。取适量,0.7%琼脂糖凝胶,70V,1.0×
TAE,4℃,普通电泳 8h,EB染色,紫外下观察。
1.3 宏基因文库构建
将上述抽提得到的 DNA采用 Epicentre公司的 CopyControlTM FosmidLibraryProductionKit利用 End-
RepairEnzyme将片段末端补平;采用 1.0%低熔点琼脂糖凝胶,0.5×TBE,开关时间 1到 6s,角度 120°,6V/cm,
脉冲电泳 11h;EB染色,紫外下观察,标记 25kb～45kb的片段,割胶回收得到 25kb～45kb的片段;利用 Fast-
LinkDNALigase将获得的片段连接于 Fosmid粘粒上;30℃条件下将连接好的粘粒用噬菌体蛋白包装;梯度
稀释后侵染大肠杆菌,涂布在含有 12.5μg/ml的 LB平板上培养。随机挑选一克隆,LB液体培养基扩大培养,
抽提质粒,EcoRⅠ酶切,如上条件进行脉冲电泳,观察插入片段大小。用无菌牙签挑取阳性克隆与 96孔细胞
培养板上,加无菌甘油至终浓度 15%,-45℃保存备用。文库容量采用以下公式计算:
文库容量=
(克隆数)(稀释倍数)(100μl/ml)
用于涂布噬菌体体积
1.4 抗菌肽活性基因筛选
将克隆于适量 LB液体培养基培养 12h后,煮菌后离心,以上清为模板采用根据虎虾抗菌肽基因设计的
引物 T1:5-GTCTGCCAAGCCCAAGGGTAC-3、T2:5-CTGCCTGCAGCAAGCACGAGC-3[12]进行
PCR扩增。扩增体系为:2.5μl10×PCR缓冲液 (50mmol/LTris-HCl(pH8.2),18mmol/LMgCl2,500mmol/L
KCl,0.1%甘油,1%TritonX-100),10pmol的引物,2μl10mmol/L(每种碱基浓度)dNTP,2.5USuperTaq酶,1μl
模板,无菌的去离子水补充体积至 25μl;扩增程序为:(94℃变性 1min,48℃退火 1min,72℃延伸 2min)30个循
环,72℃延伸 3min。对于阳性克隆,采用抑菌圈法检测其抑菌活性,确定其是否含有抗菌活性基因;指示菌为:
金黄色葡萄球菌、荧光假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白假丝酵母、宛氏拟青霉、黑曲霉。将具有抗菌活性的克隆送
交上海博亚公司采用 ABI3730测序仪测序,采用软件 GeneExplorer对于获得的序列进行分析,获得开放阅读
框,再利用在线工具 Neuralnetworkpromoterprediction分析潜在的启动子及核糖体结合序列,结合两者结果
分析获得可能的活性序列;利用 GeneScan预测剪接后的序列;在前两者基础上,利用 ClustalX将所得到序列
进行比对分析。
2 结果与讨论
2.1 海绵宏基因组 DNA提取
图 1是澳大利亚厚皮海绵宏基因组 DNA的琼脂糖
凝胶电泳图谱。从图中可以看出提取得到的宏基因组
DNA浓度较高,而且片段大小集中在 45kb左右,可以用
于足 Fosmid宏基因组文库构建。
2.2 Fosmid文库构建及文库质量检测
将包装好的噬菌体梯度稀释,侵染大肠杆菌,以每个
平板约 200个菌落为基准计算文库容量,计算得到构建
的 Fosmid宏基因组文库大约包含 18000个克隆。随机挑
取克隆扩大培养后提取质粒,EcoRⅠ酶切电泳观察插入
片段大小,结果发现:外源插入片段最小为 26kb,最大为 50kb,平均大小为 36.8kb,其中约 30.8%的插入片
图1 澳大利亚厚皮海绵宏基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图
M:LambdaMixer1:澳大利亚厚皮海绵宏基因组DNA
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图2 插入片段脉冲电泳凝胶图
M:LambdaMixer其它泳道为酶切后的包含外源插入片段的
Fosmid粘粒
图3 引物T1/T2的不同PCR结果
M:100bpLadder 0:阴性 1～3:三种PCR结果
段大小在 31kb到 35kb之间,约 33.0%的插入片
段在 35kb到 40kb之间。可见我们建立的澳大利
亚厚皮海绵宏基因组文库具有比较好的质量。这
是我国首次建立的海绵宏基因组文库,为后续相
关功能基因的筛选奠定了基础,同时也为今后系
统地构建我国海绵宏基因组文库奠定了技术基
础。
2.3 抗菌活性基因的检测
利用根据虎虾抗菌肽基因设计的引物 T1/T2
进行 PCR扩增检测,除三条固定条带外,可得到
三条阳性条带,一条 约 2000bp(以下以 L表
示),一条约 1500bp(以下以 M表示),最后一条
约 1200bp(以下以 S表示),具体如图 3所示。
共筛选得到 23株阳性克隆,对它们进行的抑菌活性实验
显示:对于真菌(宛氏拟青霉、黑曲霉、白假丝酵母)绝大部分
没有抑菌活性;对于细菌,针对枯草芽孢杆菌的抑制作用较明
显。并发现含有 M条带的克隆中除 1株没有表现出抑菌活性,
其余都表现出抑菌活性;包含 S条带的克隆部分表现出抑菌
活性;包含 L条带的没有表现出抑菌活性。考虑克隆中的插入
片段在 25kb以上,推测条带 M中包含有自己的启动子序列,
并有可能包含有编码抑菌活性物质的基因。
2.4 序列分析
利用软件 GeneExplorer对测序结果进行分析,发现 M片段含有两个完整的开放阅读框(ORF):自 5端
第 88到 612位核苷酸(见图 4ORFA),自 5端第 387到 821位核苷酸(见图 4ORFB)。其中位于 387到
389的起始密码子 ATG上游有一潜在的核糖体结合位点(RBS,自 5端第 375到 382位核苷酸)。通过 Neural
networkpromoterprediction工具(htp:/www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)预测潜在的基因启动子,发现
两个潜在的原核生物启动子:自 5端的第 140到 185位核苷酸(见图 4PromoterA),93%可能性;自 5端的第
734到 779位核苷酸 (见图 4PromoterB),83%可能性。ORFB上游有核糖体结合位点,同时也有启动子序
列,所以其转录不受载体的影响。因此,有理由推测 ORFB包含抑菌活性基因。ORFA位于整个序列的上游,
在其上游没有发现启动子、核糖体结合位点,所以其转录必然受到载体的影响。尚未发现潜在的真核生物启
动子,说明该段基因很可能来源于海绵体内的共附生微生物。
利用软件 ClustalX将 ORFA、ORFB与引物来源的虎虾抗菌肽 cDNA基因[12]进行序列比对,发现 ORFA
与虎虾抗菌肽 cDNA基因相似十分为 40%,ORFB为 63%。这进一步说明 ORFB很可能编码与虎虾抗菌肽类
似的蛋白。ORFB是从宏基因组 DNA直接扩增得到的,当中很可能含有内含子。进一步利用软件 GeneScan
(htp:/genes.mit.edu/GENSCAN.html)分析 ORFB,预测剪接后的 270bp的 DNA序列见图 5,可编码一全长
90个氨基酸的蛋白,与虎虾抗菌肽序列相似十分为 24%。对虾科类(penaeidin-like)抗菌蛋白对于革兰氏阳性
菌、革兰氏阴性菌具有抑制活性。Tze-TingC等人[12]利用 RT-PCR从微生物含量很丰富虎虾肠道、腮部扩增得
到类似的 cDNA,说明这类活性蛋白有可能一部分来源于虎虾的共附生微生物。
吴杰等:海绵宏基因组文库构建及抗菌肽功能基因的初步筛选 97
生物技术通报Biotechnology Buletin 2006年第3期
图5 利用GeneScan预测得到的剪接后的ORFBDNA序列及其编码的氨基酸序列
:起始密码子 :终止密码子 :核糖体结合位点 :启动子
1 ATGGCGCCAGATGGCTCGTGCTTGCTGCAGGCAGGGGTCTGCCAAGCCCAA
M A P D G S C L L Q A G V C Q A Q
52GGGTACTGGATGTTTATTCTGGTCAACATCATCTTTACGCTCGTGCTTGCT
G Y W M F I L V N I I F T L V L A
103GCAGGCAGGCTCGTGCTTGCTGCAGGCAGGCTCGTGCTTGCTGCAGGCAGA
A G R L V L A A G R L V L A A G R
154GGCAGAGGTCTGCCAAGCCCAAGGGTACTGCTCGTGCTTGCTGCAGGCAGG
G R G L P S P R V L L V L A A G R
205GGTCTGCCAAGCCCAAGGGTACTGCTCGTGCTTGCTGCAGGCAGGCCCCTG
G L P S P R V L L V L A A G R P L
256 TCT GCC AAG CCC AAG
S A K P K
图4 M条带的序列
(下转第103页)
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2006年第3期
参 考 文 献
1 HirabayashiJ,KasaiK.Glycobiology,1993,3(4):297~304.
2 Vacelet.JMicroscBiolCel,1975,23(3):271~288.
3 MμlerWEG,BrummerF,BatelR,etal.Naturwissenschaften,2003,90(3):103~120.
4 WildJ,HradecnaZ,SzybalskiW.GenomicResearch,2002,12(9):1434~1440.
5 LiZY,HeLM,WuJ,etal.JournalofExperimentalMarineBiologyandEcology,2006:75~85.
6 李志勇,秦恩昊,蒋群,等.水产学报,2005,29(1):38~42.
7 黄艳琴,李志勇,蒋群,等.微生物学通报,2005,32(4):5~10.
8 沈颖,李志勇,蒋群,等.微生物学通报,2005,32(4):15~19.
9 何丽明,李志勇,蒋群,等.微生物学通报,2005,32(3):51~56.
10 胡叶,李志勇.生物技术通报,2005(6):56~61.
11 李志勇,吴杰.大片段海绵宏基因组 DNA快速提取方法.中国发明专利,申请号:200610024278.8.
12 TzeTingC,JenLeihW,ThomasTC,etal.MarineBiotechnology,2005,37(6):119～127.
系、载体各顺式作用元件与基因表达的关系等,是一种非常有效的方法。蛋白质突变技术在生物化学与分子
生物学研究中常用的方法是 PCR突变法。运用 PCR进行定点突变本身又有很多方法,如重组 PCR法、重叠延
伸法、u模板法等等[3~4]。这些方法有的所需引物较多,有的操作步骤较繁琐。近些年来国外发展了一种的快速
PCR定点突变法。本实验在这一方法的基础上加以改进,新的方法只需一次 PCR反应和酶切,无需 DNA的其
它操作,简单快速,有效率约达 79.6%。
目前,实验室所用的 E.coli宿主菌多为甲基化细菌[5],它可在细胞内对一些特定的 DNA碱基序列进行甲
基化修饰。模板限制性内切酶的识别位点为甲基化和半甲基化位点。由于只有亲代 DNA经过细胞内甲基化修
饰,体外 PCR扩增的 DNA因没有被甲基化,对模板限制性内切酶不敏感,故模板限制性内切酶不能消化体外
PCR扩增的DNA,由细胞内提取的DNA经模板限制性内切酶酶切后切为多个片段,体外合成的带有缺口的单链
或双链DNA保留下来,在转化感受态细菌后,大肠杆菌自身修复系统可将此缺口连接,形成环状闭合质粒。
用模板限制性内切酶酶切质粒和纯化的 PCR产物,同时转化感受态细胞,结果为 PCR产物转化长出较
多菌落,而酶切质粒只长出少许菌落。从理论上讲,来自于细菌的质粒 DNA含有甲基化位点,经模板限制性
内切酶酶切后不能转化成功,后者之所以长出少数菌落,估计是酶切不彻底所致。
此外,该项研究最好的聚合酶为 KlenTaqTM LADNA聚合酶,该酶反应速度快,保真性能好,催化片段
长,但该酶目前国内还没有商品供应。实验中研究了 TaqDNA聚合酶、TaqplusDNA聚合酶、pfu聚合酶,综
合考虑反应速度、保真效果和催化长度等因素,以 TaqplusDNA聚合酶效果较好。TaqplusDNA聚合酶的纠
错率为 TaqDNA聚合酶的 100倍[6~8],保真性能较强,但即使这样也不能确保合成的 DNA序列准确无误,故
需对 PCR聚合反应的结果进行序列分析,以保障合成的突变体基因序列与实验设计的一致。
实验结果表明,该实验方法阳性率高,重复性好,操作简便,明显优于其它定点突变方法。
参 考 文 献
1 AiyarA,XiangY,LeisJ.MethodsMolBiol,1996,57:177～191.
2 LingMM,RobinsonBH.AnalBiochem,1997,254:157～178.
3 CW.迪芬巴赫,GS.德维克斯勒,《PCR技术实验指南》(第一版),北京:科学出版社.1998.
4 TaylorJW,EcksteinF.NucleicAcidsRes,1985,13:8765～8785.
5 McClelandM,NelsonM,RaschkeE,etal.NuclAcidsRe1994,22:3640～365.
6 KongHM,KuceraRB,JackWE.JBiolChem,1993,268:1965～1975.
7 MatilaP,KorpelaJ,TenkanenT,etal.NuclAcidsRes,1991,19:4967～4973.
8 KeohavongP,WangCC,ChaRS.Gene,1988,71:211～216.
高川等:一种改进的快速PCR定点突变技术
(上接第98页)
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