全 文 ：一种简便的遗传转化技术在大麦中的应用
马伯军　　　　　　　　袁妙葆
(浙江师范大学生物系 , 金华 321004)　　(杭州大学生命科学学院 , 杭州 310012)
王光清　杨金水　葛扣麟
(复旦大学遗传研究所 , 上海 200433)
摘　要　本文报导一种简便实效的以大麦的愈伤组织小细胞团做为受体 , 进行 PEG +电击法的双重强
化转化新途径 , 并对如何提高转化效率进行了探索。
关键词　大麦;多细胞团受体系统;部分去壁细胞;PEG +电击法。
　1997-05-06 收稿
　第一作者简介:马伯军 , 男 , 1965年出生 , 硕士 , 讲师 , 现从事植物遗传学研究工作。
A convenient foreign gene transfer system in barley
Ma Bojun
(Depar tmen t of Biology , Zhejia ng Normal Univer si ty , Jinhua 321004)
Yuan Miaobao
(Col lege of Li fe Science , Hangzhou Universi ty , Hangzhou 310012)
Wang Guanqing　Yang Jinshui　Ge Koulin
(Inst itute of Genetics , Fudan Un iversity , Shanghai 200433)
Abstract　In this paper , the authors introduce a new convenient and efficient gene transfer sy stem , which uti-
lizes par tially digested barley cells as receptor and a combination of PEG introducing w ith electroporation.They
also make exploration on how to improve transformation rate.
Key words　Barley;multicellular recepto r system;partially digested cells;PEG + electroporation
　　对禾谷类作物遗传转化 , 选择合适的受体系统是极为重要的 , 目前主要有原生质体;悬浮系
及愈伤组织细胞团;整株无菌苗等几类受体 , 对于 PEG 和电击法正常的情况下都要求以原生质
体作为受体 , 然而禾谷类作物的原生质体培养在高等植物中是比较困难的 , 虽然有成功的实例 ,
但往往局限于某个或某些基因型 , 对于当前生产裁培品种很少成功〔1 ,2〕 。我们所建立的技术途径
则避开原生质体培养 , 以当前生产栽培的当家大麦品种为材料 , 对其具高分化潜能的愈伤组织小
细胞团进行一定程度的酶解去壁 , 使外源基因的导入成为可能 , 通过 PEG +电击法的双重强化
处理 , 最终获得了转化成功。
广 西 植 物 Guihaia　18 (1):51—53 1998 年 2月　
1　材料与方法
1.1　用于基因转化的质粒 DNA 制备
转化用的外源 DNA是 pBI121质粒 , 其中含有可作选择标记的 NPT -Ⅱ基因和 GUS 基因 。
通过碱变性法制备质粒 DNA , 并用氯化铯梯度超离心加以纯化备用。
1.2　胚性细胞团受体系统的制备
对普通大麦生产栽培品种 “舟麦 2号” 幼穗进行诱导 , 二月后出现大量的胚性愈伤组织细胞
团。将0.5 g 的1 ～ 2 mm 大小的细胞团放到 10 ml经过滤灭菌的酶液中 , 26℃静止酶解 3h。酶解
液为:2%纤维素酶 R-10 、 0.5%离析酶 R-10 和 2%半纤维素酶溶解于 CPW 溶液 (KH2PO4
27.2 mg/L 、 KNO3 101 mg/L , CaCl2·2H2O 1480 mg/ L 、 MgSO4·7H2O 240 mg/L 、 KI 0.16 mg/
L 、 CuSO4·5H2O 0.025 mg/L 、 甘露醇 7.7%、 pH5.6), 酶解部分去壁后的细胞团用 CPW 液洗
涤 3次用于转化 。
1.3　改进的 PEG +电击法双重转化处理
按以下步骤进行:
(1)上述细胞团取 0.5 g 悬浮于 1 ml CPW溶液中 , 45 ℃热击 10 min后冰浴 2 min。
(2)加入 20μg pBI 121 DNA 、 50μg 小牛胸腺 DNA和 1 ml 40%PEG , 充分混和后 , 室温静
止 30 min。
(3)每隔 5 min加入 2 ml F 溶液 (KCl 368 mg/ L 、 CaCl2·2H2O18 400 mg/ L 、 NaCl 800 mg/
L 、 Na2HPO4·2H2O 125 mg/L), 逐步稀释至终体积 10 ml。
(4)PEG 处理后的细胞团用 W5电击缓冲液 (125 mM CaCl2·H2O 、 154 mM NaCl 、 5 mM
KCl 、 5 mM 葡萄糖)洗三次后在 2ml W5液中 25 ℃温育 3 h 。
(5)W5液洗 3次后 , 转到电击杯中 , 加入20μg pBI 121 DNA和 50μg 小牛胸腺 DNA , 加入
W5液至电击杯终体积 0.8 ml , 25 ℃温育 1 h 。
(6)冰浴 10 min后电击 , 电击仪为 BIO-RAD Gene Transfer。
(7)电击后冰浴 15 min , 经洗涤后加以培养。
1.4　转化后的细胞团的培养 、筛选 、 植株再生以及转基因植株的鉴定
转化后的细胞团在 MS +2mg/L 2 , 4-D +1 000 mg/L LH 上培养2周后 , 转移到添加 100
mg/ L卡那霉素的选择培养基中筛选 , 20天后把抗性愈伤组织细胞团转移到加 10 mg/ L丙氨酸的
MS +0.1 mg/L NAA +0.5 mg/L KT 分化培养基中进行植株再生。转化后细胞团的 GUS 、
WPT -Ⅱ活性检测及再生植株的 Southern分子杂交见另文〔4〕。
2　结果与讨论
2.1　部分去壁程度的确定
酶解部分去壁程度的确定对实验的成败是关键的 。酶解 2 h仅有少数原生质体开始释放 , 随
着酶解时间的增加 , 原生质体释放的数量也随之增加 , 酶解 5 h后 , 在原生质体释放数增加的同
时 , 细胞的破碎程度也有所增加 , 到 8 h , 原生质体的游离数已基本稳定 , 而破碎的细胞数却显
著增加 。故以 8 h的原生质体数定为 100%, 从而得出各酶解小时的相对原生质体释放数 。据研
究 , 水稻悬浮系小细胞团当原生质体释放相对比例为 10%时 , 细胞团上的细胞已不同程度的去
壁 , 以此酶解程度的细胞团进行转化效果最好〔4〕 , 故对于大麦我们确定了酶解 3h其相对比例为
52 广　西　植　物 18 卷　
10%左右时 , 用于转化。
2.2　转化强度与存活率 、转化率的关系
转化强度与存活率 、 转化率是密切相关的 , 在只用 0.5 KV/cm 电击时 , 存活率虽有
35.5%, 但转化率为 0 , 而当 PEG +2.0 KV/cm 时 , 则存活率为 0 (表 1)。可见 , 在能存活前
提条件下 , 尽可能增加转化强度 , 可以提高转化率。为了比较不同转化参数的转化效果 , 对转化
后培养 11周的具有蓝色反应的愈伤组织进行分散 、 酶解及过筛网等处理 , 收集游离细胞 , 在倒
置显微镜下观察统计蓝细胞和总细胞数的比例 , 作为转化率的相对指标 。我们的结果表明使用
PEG+1.5 KV/cm的转化参数是较为合适的 。
表 1　转化参数对存活率 、 转化率的影响
Table 1　Effect of t ransfermation parameter on cell
survival rare and t ransformation rate
转 化参 数 存活率(%) 转化率(%)
电击(0.5 KV/ cm) 35.5 0
PEG +电击(0.5 KV/ cm) 14.5 16.8
PEG +电击(1.0 KV/ cm) 12.0 17.2
PEG +电击(1.5 KV/ cm) 11.3 25.1
PEG +电击(2.0 KV/ cm) 0 0
2.3　电击前的预培养 、 预处理对提高转化率
的作用
　　在电击前 , 进行 3h的 W5电击缓冲液预培
养及预培养后的加质粒 DNA预处理 1h是十分
必要的 。同样是 PEG + 1.5 KV/cm 的转化强
度未经预培养 、 预处理的转化率为 17.4%, 而
通过预培养 、预处理的转化率为 25.1%, 比对
照的提高 30.7%, 而存活率并无什么下降 。转
化率的提高可能是由于受体细胞内的核酸酶在
3h预培养中逐渐渗漏出来并被洗脱 , 从而降低
了对外源 DNA 的降解作用;在电击前 1h的质粒 DNA 预处理能使质粒 DNA 与愈伤组织细胞团
充分接触 , 并渗入间隙 , 从而提高转化率。
2.4　问题与展望
由于我们所采用的是小细胞团做为受体 , 这就难以避免导致转化子的嵌合现象 。但对于嵌合
现象可以通过进一步的组织培养和选择等途径 , 应该不难解决的。Vasil等认为组织培养中通过
细胞胚发育而来的再生植株一般多来源于单个细胞〔5〕 , 因此 , 嵌合体现象也不是绝对不可避免
的。总之 , 我们认为通过部分酶解去壁 , 配以改进的 PEG +电击法双重转化 , 避开了原生质体
培养以及价格昂贵的基因枪 , 不失为一条简便实效的大麦等谷类作物的遗传转化新途径 。
参 考 文 献
1　王光远 , 夏镇澳.水稻原生质体再生成熟植株.实验生物学报 , 1987 , 20(2):253～ 257
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4　Yang J S , Ge KL , Wang YZ , et a l.Highly ef ficient t ransfer and stable integration of foreign DNA into partially digested rice cells us-
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5　Vasil I K et a l.Developing cell and ti ssue culture for the improvement of cereal and grass crops.J.Plan t Physiol , 1987 , 128:193～
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53　　1期 马伯军等:　一种简便的遗传转化技术在大麦中的应用