全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 28(3)：379— 381 2008年 5月
银杏外种皮提取物对酪氨酸酶的抑制作用
王 勤，钟 雪，邱 凌，庄江兴，陈清西
(厦 门大学 生命科学学院 教育部细胞生物学与肿瘤细胞工程重点实验室 ，福建 厦门 361005)
摘 要 ：以银杏外种皮为材料 ，采用水 、乙醇和乙醇一乙醚三种不 同的方法分离提取其中的活性物质(分别命
名为 1#，2#，3#)，研究它们对蘑菇酪氨酸酶催化 L_多巴(L—DOPA)氧化活力的影响。结果表明，这 3种提取
物均对蘑菇酪氨酸酶有抑制作用，1#，2#和 3#对酶抑制作用的 ICso分别为 2．25、1．75和0．32 mg／mL。抑
制作用动力学结果表明：三种提取物对酶的抑制作用均表现为混合型，相应的抑制常数 KI依次为 2．11、1．62
和0．29 mg／mL；KIS依次为 2．80、2．33和0．45 mg／mL。结果显示，采用乙醇一乙醚提取的银杏外种皮提取物
对酪氨酸酶抑制作用最强。
关键词：银杏外种皮 ；提取方法 ；酪氨酸酶 ；抑制作用；动力学
中图分类号：Q945．6 文献标识码：A 文章编号 ：1000—3142(2O08)03—0379—03
Inhibito~ mechanism of extrm：ts from Gink~l l~ ry t ac m rD
biolaba sarcotesta on mushroom tyrosinase
WANG Qin，ZHONG Xue，QIU Ling，ZHUAN G Jiang-Xing，CHEN Qing-Xi
(Key Laboratory of Ministry of Education for Cell Biology and Tumor Cel Engineering，
Colie of Life Sciences，Xiamen University，Xiamen 361005，China)
Abstract：Three extractants(water，ethanol and ethanol—aether mixture)were isolated from Ginkgobiolaba Sarc0teSta，
and then three kinds of extracts were used to test the inhibition on the activity of mushroom tyrosinase．The results
showed that three extracts could inhibit the activity of tyrosinase obviously．The inhibitor’s concentration leading to
50 enzyme activty lost，ICso was estimated to be 2．25，1．75 and 0．32 mg／mL，respectively．Their inhibition mech—
amsms were analyzed．All of three extracts showed reversibly inhibitors to tyrosinase and the type of inhibition be—
longed to be mixed-typ e．The inhibition constants，KI and KIS，of each extract were determined respectively and com—
pared．The value of K1 was determined to be 2．11，1．62 and 0．29 mg／mL，respectively；the value of KISwas deter-
mined to be 2．80，2．33 and 0．45 mg／mL，respectively．The ethanol—aether extracts showed the best inhibition on ty—
rosinase~
Key words：G 以 g0 b／o／aba sarcotesta；extractive method；tyrosinase；inh ibitory mechanism~kinetics
酪氨酸酶(EC．1．14．18．1)广泛存在于动植物
和人体内，在动植物体酶促褐变、体内色素合成的过
程中起了关键的作用 (Sdnchez—Ferrer等，1995)。
它能将酪氨酸羟化，产生邻位二羟基苯丙氨酸(L一多
巴)(单酚酶活性)，然后再将多巴氧化成多巴醌(二
酚酶活性)，进而生成一系列引起褐化的色素物质。
因此，目前国内外研究了大量化学物质对酪氨酸酶
的抑制作用，以期寻找高效的抑制剂作为食品加工
中的保鲜剂，化妆品添加剂(宋康康等，2003)及杀虫
剂(徐汉虹，2001)等。长期以来，银杏一直是中草药
收稿日期：2007—03—27 修回日期 ：2007-08-11
基金项目：福建省自然科学基金(B0510001)；国家自然科学基金(30570408)[Supported by Natural Science Foundation of Fujian Province(B0510001)
the National Natural Science Foundation of China(30570408)]
作者简介 ：王勤(1969-)，女，山东济宁市人，博士，副教授 ，主要从事生物化学研究 ，(E-mail)qwang@xmu．edu．cn．
通讯作者(Author for correspondence，E—mail：chenqx@xmu．edu．cn)
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380 广 西 植 物 28卷
中的常见药材，为我国特产，具有较高的药用价值。
银杏叶能活血止痛、降低胆固醇、治疗心绞痛、改善
心脑血管循环等，其果实白果具有润肺定喘、涩精止
带等作用，可治疗肺结核、支气管哮喘等。然而在采
收的季节，银杏外种皮经常被弃去，造成环境污染。
银杏外种皮中含有大量的糖类、黄酮和酚酸类成分，
有实验表明该类物质是酪氨酸酶的抑制剂(刘林刚
等，2005；刘森，2004)，如能将外种皮中的有效物质
提取出来作为生物农药用于杀虫(石启田，2004)，将
具有良好的应用前景。我们采用不同的方法提取银
杏外种皮中的活性物质，比较了不同提取物对酪氨
酸酶的抑制作用机理及抑制作用动力学，以期从中
得到高效、安全的酪氨酸酶抑制剂用于生物杀虫剂。
1 材料与方法
1．1实验材料
收集银杏外种皮，烘干、粉碎。酪氨酸酶为 Sig—
ma化学公司的蘑菇酪氨酸酶，比活力为 6680 u／
mg。二甲亚砜 (DMSO)、L-3，4--羟基 苯氨酸 (L-
DOPA)为Aldrich化学公司产品。其它试剂为国产
分析纯试剂，使用的蒸馏水为去离子重蒸水。
1．2方法
1．2．1样品制备 1 样 品：银杏 外种皮 与水 1：5
(w／v)充分混合，组织捣碎后热回流提取 2 h，离心
取上清，减压浓缩至干。2 样品：银杏外种皮与
50 9／6乙醇 1：5(w／v)充分混合，组织捣碎后热回流
提取 2 h，滤液抽滤，旋转蒸发浓缩后，冷冻干燥。
3 样 品：银杏外种皮与 50 9／6乙醇 1：5(w／v)充分
混合，组织捣碎后热回流提取 2 h，滤液抽滤，旋转
蒸发浓缩后，用乙醚萃取，醚层经 Na：CO。溶液和
NaOH溶液充分洗涤后，浓缩至干。分别称取三种
提取物 ，1#、2 样 品用水溶解 ，3 样品用 DMSO溶
解，分别计算提取物浓度。
1．2．2酪氨酸酶活力测定 参考 Chen等(2003)的
方法 ，先加入 0．1 mL提取物(溶于 DMSO溶液)于
比色杯中，再加入 2．8 mL预先在 30℃恒温水浴中
保温的底物溶液，然后加入 0．1 mL酪氨酸酶水溶
液，迅速充分混匀，在 30℃恒温条件下跟踪测定
475 nm的光密度值随时间的增长直线，从直线的斜
率求得酶活力。测定酶所用底物为 0．5 mmol／L L-
DOPA，酶的终浓度为 6．67 t~g／mL，所用 DMSO终
浓度均为 3．33 9／6，并用对照扣除 DMSO本底的影
响。测定仪器为 DU 650分光光度计。抑制剂对酶
的抑制作用的机理是通过 Lineweaver—Burk双倒数
作图，比较酶催化反应的动力学参数，包括表观米氏
常数(K )和最大反应速度( )的变化来判断的
(黄璜等，2003；柯莉娜等，2004)。提取物浓度以反
应体系中的终浓度计算。
1．2．3提取物对酪氨酸酶活力抑制效果的评价 在
正常测活体系中，加入不同量的银杏外种皮提取物，
测得其抑制曲线，比较导致酶活力下降 50 9／6的抑制
剂浓度(IC 。)，根据 ICs。值阐明其抑制强度。应用
酶动力学研究方法，测定各抑制剂的抑制常数(K
或 K 。)，比较其值来判断抑制强度。
2 结果
2．1银杏外种皮提取物对蘑菇酪氨酸酶活力的影响
依次以 1#～3 样品为效应物，测定它们对蘑
菇酪氨酸酶催化底物 L-DOPA氧化反应的酶活力
的影响(图1)，结果表明，随着三种效应物浓度的增
大，酶活力均呈指数下降，IC 。分别为 2．25、1．75和
0．32 mg／mL。乙醇一乙醚提取物对蘑菇酪氨酸酶的
抑制作用最为明显 。
≥
+J
‘；
：
o
日
罂 ∞
嚣 !
+J
∞
效应物浓度c／mg．mL
图 1 1#～3#样品对蘑菇酪氨酸酶活力的影响
Fig．1 Effects of 1#-3# samples on the
2．2银杏外种皮提取物对蘑菇酪氨酸酶的抑制作用
均表现为可逆效应
在含不同浓度的效应物的测活体系中，固定底
物 L—DOPA浓度为 0．5 mmol／L，测定不同酶量的
反应初速度 。图 2表示在含 1 样 品的测活体系 中
酶的剩余活力与加入的酶量的关系，由图可知，酶活
力对酶量作图为一组通过原点的直线，图中的0线
代表无效应物时的酶活力，随着效应物浓度的增大，
直线的斜率降低。该结果表明，1 样品对酶的抑制
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3期 王勤等：银杏外种皮提取物对酪氨酸酶的抑制作用 381
作用属于可逆过程，随着抑制剂浓度的增大，催化效
率显著降低，说明效应物和酶的结合导致酶活力受
抑制，并不导致酶的分子构象的永久变化而失活。
2 和 3 样品亦表现出相类似的可逆抑制过程。
烘
锰
图 2 1#样品对蘑菇酪氨酸酶抑制作用机理的判断
Fig．2 Determination of the inhibitory mechanism
of 1# sample on mushroom tyrosinase
直线 O～4浓度分别为 0、1．6、3．2、6．4和 9．6 mg／mL。
＼
E 008
／
； 006
004／
一
． J ，rI ．1 ．
底物浓度的倒数cs。。／mmo l～．L 2#样品浓度CJnag．nat_
图3 2#样品对蘑菇酪氨酸酶抑制类型和抑制常数的测定
Fig．3 Determination of the inhibitory type and
inhibition constant of 2# sample on tyrosinase
曲线 O～4分别代表测活体系中加入的2#样品的
浓度分别为0，0．8，1．6，2．4和 3．2 mg／mL。
2．3银杏外种皮提取物对蘑菇酪氨酸酶的抑制机理
在含不同浓度样品的测活体系中，改变底物浓
度，测定酶促反应的初速度，Lineweaver-Burk双倒
数作图，可以判断效应物对该酶的抑制作用机理。3
种提取方法得到的银杏外种皮提取物对蘑菇酪氨酸
酶的抑制作用具有相 同的机 理，其 Lineweaver—
Burk双倒数作图均得到一组交于第二象限的直线，
斜率和截距都因样品的浓度变化而改变，米氏常数
(K )随着样品浓度的增大而增大，最大反应速度
(V )随着样品浓度的增大而下降，其抑制机理表现
为混合型。图 3为样品 2 提取物对蘑菇酪氨酸酶
的抑制作用的 Lineweaver-Burk双倒数作图，二次
作图，以斜率(图3：II)和纵轴截距(图3：II)分别对效
应物浓度作图为一条直线，分别可以求得样品对游离
酶(E)的抑制常数(K。)和对酶底物络合物(ES)的抑
制常数(K璐)。测定结果列于表 1，以供比较。
表 1 不 同提取方法提取的银杏外种皮提取物
对蘑菇酪氨酸酶抑制效应的比较
Table 1 Comparison of the inhibitory effects from
G．ingo biolaba on mushroom tyrosinase
3 讨论
银杏外种皮的水提法、乙醇提法及乙醇一乙醚萃
取法所得的三种样品对蘑菇酪氨酸酶均具有显著的
抑制作用。根据表 l，从 IC 。值来看，三种提取物的
抑制强度依次为 3 >2 >l#。乙醇一乙醚萃取法
得到的银杏外种皮提取物的抑制强度是乙醇提取法
得到的 5．5倍，是采用水提取法得到的 7倍。该法
效果最好，其有效成分得到了分离。虽然三个样品
均为混合型抑制类型，但它们的抑制常数 K s与 K
之比值(K ／K )并不完全相同，三种提取法得到的
Kls／K1分别为 1．33、1．44和 1．55。Kls／Kl的比值
均大于 l，说明银杏外种皮提取的效应物对酪氨酸
酶的游离酶 (E)的抑制作用较对酶一底物络合物
(ES)的抑制作用强，显示底物对酪氨酸酶被银杏外
种皮提取物的抑制有一定的保护作用。K s／K 比
值随着抑制效果增强而呈递增的趋势，说明样品在
酪氨酸酶与底物结合前，就迅速抑制了酶活力，同时
与酶一底物络合物相结合，从而表现出对酪氨酸酶高
效的抑制力 。
本文从酶学角度出发，获得了从银杏外种皮中
提取酪氨酸酶抑制剂的有效方法，从理论上论证了
银杏外种皮提取物对酪氨酸酶的抑制效果，开拓了
银杏外种皮在果蔬保鲜、生物防治方面的应用价值。
(下转第 40l页 Continue on page 401)
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3期 赵昶灵等：高等植物花色苷在液泡中的存在状态及其着色效应 401
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等植物花色苷在液泡中的存在状态及其着色效应
赵昶灵，张丽梅，刘福翠
(云南农业大学 农学与生物技术学院 ，昆明 650201)
摘 要：综述了花色苷被摄人液泡的原因、花色苷在液泡中的存在状态及其对植物细胞的着色效应。花色苷在
植物细胞质中合成后转运到液泡里是为了解除其对蛋白质和DNA等细胞功能分子的毒性。花色苷的液泡区隔
化是花色苷在植物细胞 中发挥正常功能的前提。在大多数植物中，花色苷在绝大多数情况下完全溶解在液泡
里。但是，花色苷也能在液泡里形成颗粒 ，这些颗粒可以划分为花色苷体和花色苷液泡包涵体两类 。花色苷体
由膜包裹，其形成是液泡中小的有色囊泡逐渐合并的结果，发育完全的花色苷体为典型的球状、具 比液泡更深的
红色；液泡里的花色苷体具高密度，呈现为含高浓度花色苷的不溶性小球；花色苷体的存在可导致液泡的强烈色
彩。花色苷液泡包涵体可能具备蛋白质基质，既无膜包裹又无内部结构，其形成是转运进液泡的花色苷与蛋白
质基质结合的结果；液泡里的花色苷液泡包涵体形状不规则，象果冻；在花色苷液泡包涵体 中，花色苷可能通过
氢键连接于蛋白质基质的一个有限空间位点；花色苷液泡包涵体被认为是液泡中花色苷的“陷阱”，优先摄取花
色素 3，5一二糖苷或酰化的花色苷；花色苷液泡包涵体的存在可增加液泡色彩的强度并导致“蓝化”。
关键词 ：花色苷 ；存在状态 ；着色效应 ；花色苷体；花色苷液泡包涵体
(上接第 381页 Continue from page 381)
参考文献：
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