全 文 ：广 西 植 物 Guihaia． 30(2)：246— 249 2010年 3月
应用胚挽救技术获得三倍体柑橘植株
刘可慧1，2，于方明3，张秋明4，易干军
(1．广东省农业科学院 果树研究所 ，F)tl 510640；2．桂林电子科技大学 应用科技学院，广西 桂林 541004
3．广西师范大学 环境与资源学院，广西 桂林 541004；4．湖南农业大学 园艺园林学院，长沙 410128)
摘 要：以3个柑橘异源四倍体体细胞杂种(即四倍体粗柠檬与哈姆林甜橙体细胞杂种，简称“HR”；酸柚与
粗柠檬体细胞杂种，简称“sR”；墨西哥来檬与伏令夏甜橙体细胞杂种，简称“KV”)为父本，分别与二倍体单胚
性沙田柚进行有性杂交，在有性胚还没有完全败育以前，通过胚抢救技术进行三倍体植株培养(以四季柚花粉
亲本为对照)。结果表明，处理的杂交组合直接成苗率极显著低于对照(P合成苗率相对较高，达 10．1 ；较适合瘪籽沙田柚幼胚离体培养 的培养基 是 MT+GA31．0 mg／L+蜂皇浆
200 mg／L+水解乳蛋白250 mg／L+蔗糖 30 g／L+琼脂 0．7 ；流式细胞分析仪检测结果显示，本试验成功获
得了柑橘三倍体植株。
关键词：体细胞杂种；有性杂交；瘪籽沙田柚；胚抢救；三倍体植株
中图分类号 ：$662．5 文献标识码 ：A 文章编号：1000—3142(2010)02—0246—04
Regenerating triploid citrus plants
by embryo rescue technique
LIU Ke-Hui1一，YU Fang-Ming0，ZHANG Qiu-Ming ，YI Gan-Jun
(1．Institute of Pomology，Guangdong Academy of Agricultural Sciences，Guangzhou 510640，China；2．Colege
ofApplied Science and Technology，Guilin University of Electronic Technology，Guilin 541004，Chinai
3．Department of Environmental Engineering，Guangxi Normal University，Guilin 54 1004，China；
4．College of Horticulture，HⅫ口n Agricultural University，Changsha 410128，China)
Abstract：Diploid Shatian pummelo was used as the female and crossed with the alotetraploid somatic hybrids(Citrus
jambhiri+C．sinensis(HR)；C．grandis+Rough lemon(SR)；C．aurantifolia+C．simnsis(KV))to regenerate triploid
citrus plants by embryo rescue technique，using C．grandis pollen as the contro1．Results showed that the regenera—
ring rate of treated sexual hybridization was significantly lower than that of the control(P~ 0．O1)，in which the corre-
sponding value of Shatian pummelo X HR was comparably higher(the rate of seedling is 10．1％)．The optimal medi—
um for embryo rescue was solid MT medium supplemented with GA3 1．0 mg／L，queen bee oar 200 mg／L，laeialbu—
min hydrolysate 250 mg／L and agar 0．7％．Results of flow eytometry analysis showed that triploid citrus plants were
successfully obtained in this study．
Key words：somatic hybrids；hybridizing；seedless Shatian pummelo；embryo rescue；triploid plants
胚抢救是指对由于营养或生理原因造成的难以
播种成苗或在发育早期阶段就败育、退化的胚进行
早期分离培养(伊华林等，2001)。它是果树早熟类
型品种的选育以及近年来对无核类果树品种选育所
采取的有效手段与成功方法之一。1933年 Tukey
成功地培养了甜樱桃的幼胚，成为胚培养在果树应
收稿日期 ：2008—05—18 修回日期：2009—02—28
基金项目：广东省科技攻关项目(2002A2080303)；桂林电子科技大学博士启动基金(Z2O718)[supp0rted bythe Scientific andTechnological Project of
Guangdong Province(2002A2080303)；Doctoral Scientific Research Foundation of Guilin University of Electronic and Teehnology(Z20718)]
作者简介：刘可慧(1976一)，女，湖南邵阳人 ，博士，主要从事环境生态学和全球变化生态学的研究 ，(E-mail)cofeeleave@126
． c0m 。
’通讯作：~(Author for correspondence，E—mail：yiganjun@vip．163．com)
2期 刘可慧等：应用胚挽救技术获得三倍体柑橘植株 247
用上 的里程碑 。1987年至今 ，Ramming(1990)经过
三年的努力 ，利用胚挽救技术已成功的培育出了早
熟桃与无核葡萄。如今，胚抢救技术在果树育种上
的应用越来越广泛。在我国，胚抢救技术在柑橘育
种上也取得了一定进展 (邓 秀新等，1996；Carimi
等，1998；伊 华 林 等，1998；Grosser& Gmitter，
2005；宋健坤等，2005)。采用常规二倍体和四倍体
品种间杂交，具有很大的杂交障碍，杂种胚早期败
育 ，很难获得杂交后代 ，因而育种效率极低。随着生
物技术的发展，采用胚胎挽救技术可阻止三倍体杂
交幼胚的早期败育，形成三倍体植株。但在柑橘上，
通过不同来源的异源四倍体体细胞杂种与二倍体单
胚进行有性杂交试验获得三倍体植株的研究相对较
少。因此，本研究通过对不同来源的异源四倍体体
细胞杂种与 二倍体 单胚性沙 田柚进行 有性杂交试
验 ，对杂交果实的幼胚 在未 完全败育前进行胚抢救
实验，试图获得三倍体柑橘植株，旨在为进一步培育
无籽沙田柚提供依据。
1 材料与方法
1．1试验材料
以沙田柚为试验母 本。供试父本分别为 四倍体
粗柠檬 (Citrus jambhiri)与哈姆林 甜橙 (C．sinen—
sis)体细胞杂种 ，简称“HR”；酸柚 (C．grandis)与粗
柠檬 (Rough lemon)体细胞杂种 ，简称“SR”；墨西哥
来檬 (C．aurantifolia)与伏令夏甜橙 (C．sinensis)体
细胞杂种 ，简称“KV”。以四季柚(C．grandis)花粉
亲本为对照。于 2003年 3月 2O～22日进行授粉 试
验。除去未授粉的花和小幼果 。将它们杂交所得的
果实分别简称为 H，S，K，CK。异源 四倍体花粉 由华
中农业大学邓秀新教授课题组 提供。在授粉后 99 d
将幼果采回，于4℃下暂时保存。
1．2沙田柚胚抢救培养基筛选
首先将幼果漂洗干净后(以 H 为试验材料)，果
实横切，用尖手术刀挑起败育种籽，用 75 酒精浸
泡 30 S，再放人 0．1 升汞 中消毒 10 rain，用无菌水
冲洗 3～5次 ，然后用无菌水浸泡 0．5～I．0 h待用 。
每瓶培养基接种 3～5粒。培养基为 MT基本培养
基附 加 不 同 浓 度 的 GA。、蜂 皇 浆 、水 解 乳 蛋 白
(LH)。比较各种组合对沙 田柚胚挽救直接成苗率
的影响，以筛选适合于沙田柚胚挽救的培养基。本
试验设三个因素，其中A为 GA ；B为蜂皇浆；C为
水解乳蛋白(LH)，各因素均设置 3个浓度水平(表
1)。每个处理根据材料多少接种的瓶数有所不同，
重复 3次 (每一 批培 养 基 为一次 重复)。采 用 L9
(3 )正交试验设计。
表 1 幼胚直接成苗正交试验因素水平表 (mg／L)
Table 1 Levels of factors to embryo rescue
为比较三个杂交后代的直接成苗率情况，分别
取其幼胚用 MT+GA。1．0 mg／L+蜂皇浆 200 mg／
L进行培养。以MT基本培养基为对照。所有培养
基均加 蔗糖 30 g／L，琼 脂 7 g／L。培养 基用 0．1
mol／L HC1或 0．1 mol／L NaOH将 pH值调至 5．8
～ 6．0，1．1 kg／cm。高压灭菌 15 rain，灭菌后放置 2
d左右备用。以上实验均重复 3次，每一批配制的
培养基 为一次重复。培养条件：光照强度为 36
#mol·m ·s～，每天光照 16h，温度为(26±2)℃，
培养室湿度约 7O 。
1．3杂种后代倍性检测
随机抽取 3株杂种后代植株 叶片，以大田沙田
柚叶片为对 照，用流式 细胞 仪(Flow cytometry)进
行细胞倍性检测(付春华等，2005)。检测时，取待测
样品约 0．5 cm ，处理后上样于 Partec倍性分析仪，
测定样品单个细胞核的 DNA 总量。
2 结果与分析
2．1不同杂交组合对幼胚直接成苗的影响
观察结果表 明 ，授粉 99 d后 ，杂交果实种子均
呈干 瘪状 ，而 对 照种 子 发 育饱 满 ，这 与邓 秀新 等
(1996)的报道一致 。从表 2可知 ，经处理的幼胚直
接成苗率极显著 的低于对照(n一3，P理之间又以 H处理的萌发率最高，小苗生长情况相
对健壮 ，处理效果最好。说 明不 同来源的异源四倍
体父本对沙 田柚胚抢救的效果影响较大。
2．2不同添加物对沙田柚幼胚直接成苗的影响
由表 3可知 ，MT+GA。1．0 mg／L+蜂皇浆 200
mg／L4-LH500 mg／L培养基较适宜于沙田柚幼胚
成苗实验，直接成苗率达 l3．1 。A因素对直接成
苗率 的影响处 于主要地位 ，并 以 A2(1 mg／L)为最
248 广 西 植 物 3O卷
好；其次为B因素，以B3(400 mg／L)为佳；第三为C
因素。就C因素而言，三个水平的直接成苗效果相
差不大，从成本考虑选用 0 mg／L，从而其优化培养
基配方为 A2B3C1，即 MT十条 GA。1．0 mg／L十蜂
皇浆 400 mg／L。在培养过程中发现添加 LH后小
表 2 不同杂交组合对胚挽救直接成苗率的影响
Table 2 Effects of different crossing combinations
on regeration rate of embryo rescue
注；表中同列不同大写字母和小写字母表示 Tukey’S HSD法分
别在 5％和 1 水平的差异显著(n=3)。
Note：Different capital letters in same column indicate significant
differences at O．05 or 0．01 levels according to Tukey’S HSD(n一 3)．
表 3 幼胚直接成苗率 L913 )正交试验结果 (rag／L)
Table 3 Results of experiment analysis
about plant regeneration rate
因素 Factros 成苗率 ( )
- ·· -— - -- - -- - -- - -- - - —- — -- - — -- — -- - -- - -- — -- — -— - -— — -一 Rate of plant
A B C regeneration
7．27
29．65
25．72
21．63
1
】7．29
21．53
24．27
6．98
9
22．】4
2O．62
2O．33
1．81
2．O
2．4
3．3
8．3
10．2
13．1
6．8
9．1
9．8
0
图 1 杂种后代倍性测定结果 ’
Fig．1 The results 0f somatic hybrid identification
检测数值在 100 counts附近表示为二倍体；在 15O counts附近表示为三倍体
Analyzed values closed tO 100 counts meant the plant was diploid，while closed to】5O connIs was triploid
苗的生长情况 比不加要好 。故选 A2B3C2，即 MT
+GA31．0 mg／L+蜂皇浆 400 mg／L+LH250 mg／
L配方作为沙田柚胚挽救直接成苗的培养基，这在
正交试验中没有出现。对照培养基(MT基本培养
基)直接成苗率为0，说明在沙田柚的胚挽救直接成
苗试验中加入一定浓度的 GA 及附加物是必要的。
2．2杂种后代倍性检测
从形态上看，所获得的杂种后代大多数植株叶
片较大，颜色较浓。以往的研究也表明，柑橘多倍体
叶片面积和厚度一般大于二倍体，这主要是因为多
倍体细胞染色体数目相对较多，使细胞体积增大所
引起(李小梅等，l999)。本试验共获得完整植株 25
株，随机抽取 3株经流式细胞仪检测 ，其 中 2株为三
倍体植株 ，l株为二倍体(图 1)。
3 讨论
通过 2x(旱)与4x(舍)杂交后，形成的种子高度
不育，在种子未完全败育以前，将幼胚进行离体培养
可获得三倍体植株 (伊 华林 等，l997；l998；宋健坤
等，2005)。本研究结果表明，以沙田柚为母本与异
源四倍体体细胞杂种进行杂交，对其幼胚进行离体
培养，幼胚直接成苗率达 3．81 ～1o．1l ，说明该
时期进行沙田柚杂种胚挽救实验是成功的。但直接
成苗率比已经报道的都要低一些，这可能与采样时
期有关。邓秀新等(1996)、宋健坤等(2005)在授粉
9O d后进行幼胚培养取得 了很好的效果 ；而伊华林
等(1997)则认为胚挽救的适宜时间为授粉后 8O～
一
0 0 0 0 R
2期 刘可慧等 ：应用胚挽救技术获得三倍体柑橘植株 249
90 d；本试验胚抢救 的时 间为授粉后 99 d，相 对较
晚。另外，广东梅县较武汉纬度低、温度更高和湿度
更大 ，胚败育可能更快 ，从而导致本研究中成苗率较
低。同时，成苗率还与亲本组合有关。宋健坤等
(2005)以沙田柚、本地早橘、中秋橘、HB柚、国庆 4
号温州蜜柑等二倍体品种为母本 ，以(橘柚+无酸甜
橙)、(橘柚+柚)、(无酸甜橙 +柚)、(伏令夏橙 +橘
橙)、(甜橙十丹西橘)等优 良四倍体体细胞杂种的花
粉授粉 ，通过胚挽救技术获得再生植株其成苗率从
16．3 到 93．1 不等。本研究结果表 明，各处理之
间的成苗率差别也较 大，以四倍体粗柠檬与哈姆林
甜橙体细胞杂种为父本与沙田柚进行杂交，其植株
再生率相对较高。
幼胚的离体培养过程中细胞分化是一个复杂的
生理生化过程 ，不同植物、不 同胚培养 阶段 ，培养基
有所不 同。并且 ，在胚培养 的早期 阶段合适 的激素
种类和 浓 度 对 胚 抢 救 效 果 影 响 较 大。Carimi等
(1998)认为添加适量的生长调节物质 ，是柑橘幼胚
生长的前提条件。本实验研究结果表明 ，加 GA 的
培养基 ，尤以 1．0 mg／L水平的效果最好 ，直接成苗
率达 8．3 ～13．1 。任杰等 (2007)认 为在柑橘球
形胚和心形胚 阶段 ，2．9 umol／L的 GA 有利于胚
发芽。还有研究表 明，GA。可促进根茎生长和胚早
期萌发(Garimi等 ，l998)。另外 ，适量 的蜂皇浆 和
I H也有利于幼胚的直接成苗。这些附加物的加入
除提供丰富的营养物质外 ，还可能直接对 幼胚 的萌
发有刺激作用或间接的加强 了植物生长调节剂对幼
胚的作用。在本试验中较适合于瘪籽沙田柚胚抢救
的培养基组合是 MT十GA 1．0 mg／L+蜂皇浆 200
mg／I +水解乳蛋 白 50 mg／L+蔗糖 30 g／L+琼脂
0．7％。
流式细胞仪检测结果表 明，本试验成功获得了
柑橘三倍体植株 ，进一步证实采用胚挽救技术 ，对三
倍体杂种幼胚进行早期离体 培养 ，使其在适宜的条
件下成苗，获得三倍体的柑橘新种质这一技术路线
是可行的，值得深入研究。
致谢 感谢广 东省果树研 究所周碧蓉研 究员、
曾继吾副研 究员及吴元立老师对本研 究的指导和辛
勤付 出；感谢 广东省梅 州市兴宁市龙威农业发展有
限公司为本 实验提供 了良好的实验场地。
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