全 文 ：园　艺　学　报　2000 , 27(3):207～ 209
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期:1999-05-18;修回日期:1999-06-15
基金项目:国家自然科学基金资助项目 (39625017);国际科学基金资助项目 (D13001-1)
枳橙与 Page橘柚原生质体非对称融合再生杂种胚状体
刘继红　邓秀新
(华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室 , 武汉 430070)
摘　要:X-射线辐照枳橙 (2 n=2 x=18)叶肉原生质体 , 碘乙酸处理 Page橘柚 (2 n=
2 x=18)悬浮细胞系原生质体 , 电场诱导两种原生质体融合 , 经培养再生出愈伤组织和胚状
体。对再生的愈伤组织进行细胞学检查 , 观察到二倍体 (2 n=2 x=18 , 52.2%)、 四倍体
(2 n=4 x=36 , 5.8%)和非整倍体细胞 (42.0%)。选取 OPA07、 OPE05 、 OPAN07 和 OPW01
等4 种随机引物分析胚状体的杂种特性。 RAPD 检测结果说明所得到的胚状体均为通过非对称
融合得到的枳橙和 Page橘柚的体细胞杂种。
关键词:柑橘;非对称融合;体细胞杂种;RAPD
中图分类号:S 666;Q 813.2 　文献标识码:A　文章编号:0513-353X (2000)03-0207-03
1　目的 、材料与方法
自得到首例属间柑橘体细胞杂种以来 , 柑橘原生质体融合进展很快 , 现已得到 150 余例柑橘种间 、
属间体细胞杂种。绝大部分体细胞杂种是异源四倍体 , 融合后倍性增加 , 而且这些体细胞杂种综合了融
合双亲的全部遗传物质 , 在导入有利性状 (基因)的同时 , 也带进了它们的不利性状 (基因)。因此 ,
减少双亲遗传物质进入杂种中可能是解决倍性增加 、 培育出商用品种的途径 , 非对称融合能够达到上述
目的。Vardi等通过非对称融合方式得到 5 例种间 、 属间柑橘胞质杂种〔1 , 2〕。枳橙和 Page橘柚都具有多胚
特点 , 有性杂交后较难得到合子胚 , 本研究试图通过非对称融合途径得到它们的非对称杂种或胞质杂
种 , 实现部分基因 (或性状)的转移 , 以便能将枳橙的一些抗性性状导入 Page橘柚中 , 从而得到柑橘新
种质。
Page 橘柚 (C.reticulata ×C.paradisi)愈伤组织由美国佛罗里达大学 Grosser 博士赠送 , 枳橙 (Pon-
cirus trifoliata×Citrus sinensis)种子采自华中农业大学标本园。悬浮系建立 、 种子消毒和播种及原生质体分
离 、 纯化等参考 Grosser 等的方法〔3〕。 根据以前的方法对枳橙原生质体辐射 45 min〔4〕 , 用终浓度为
0.25 mmol/ L的碘乙酸 (IA)处理 Page橘柚原生质体 15 min。电场诱导原生质体融合 、 原生质体培养 、 染
色体检查参考文献 〔3〕。用 SDS 法分别提取枳橙叶片 、 Page 橘柚愈伤组织和再生胚状体的 DNA , 提取 、
扩增和电泳检测参照史永忠等的方法〔5〕进行。
2　结果与讨论
2.1 　原生质体融合及胚状体再生　枳橙叶肉原生质体在现有培养条件下不能再生形成细胞团。经 IA
0.25 mmol/ L处理的 Page 橘柚原生质体在培养过程中逐渐失去活力 , 最终破裂。因此 , 双亲原生质体及
其同源融合子都不能再生 , 而只有异源融合子 (图版 , 1), 由于生理代谢上的互补 , 才能恢复分裂能
力。在第 12 天时能观察到分裂的细胞 , 在第 20 天左右 , 融合处理的培养皿中出现细胞团 (图版 , 2)。
几次降压后 , 细胞团逐渐长大 , 长到 1～ 2 mm 时 , 转到 EME 500 培养基上 , 15 ～ 30 d 后 , 就能再生出球
形胚状体 , 胚状体转入 EME 1500培养基上长大 , 子叶期胚状体转入生芽培养基进一步生长 (图版 , 3)。
2.2 　染色体检查　取继代后呈颗粒状的新鲜愈伤组织进行染色体观察 , 结果表明所观察到的愈伤组织
染色体数目不一致 , 出现染色体倍性嵌合现象。在所检查的 69 个细胞中 , 主要是二倍体细胞 , 占
52.2%(2 n=2 x=18 , 图版 , 4);只观察到少数四倍体细胞 , 占 5.8% (2 n=2 x=36 , 图版 , 5);同时
还具有较多非整倍体细胞 (19条 、 20 条和30条等), 占 42.0% (图版 , 6)。
图 1　再生胚状体RAPD分析
Ⅰ ～ Ⅳ分别为引物OPAN07 、 OPE05 、 OPA07和 OPW01的
RAPD带型 (C和T 分别为枳橙和 Page橘柚 ,
1～ 6为 6个受检测胚状体)
Fig.1　Hybridity identification of the embryoids by RAPD analyses
Ⅰ -Ⅳ, Band patterns of the embryoids by primers OPAN07 ,
OPE05 , OPA07 and OPW01 respectively
　(C is Citrange andT is Page tangelo , 1-6 are the regenerated embryoids).
2.3 　RAPD分析　本研究中所用的 4 种引
物都能够区分开枳橙 (供体)和 Page 橘柚
(受体)。从引物 OPAN07 扩增的结果 (图
1 , Ⅰ)可以看出 , 供体有 2 条特征带 (a、
b), 受体有 2 条特征带 (c、 d), 所检测的
6 个胚状体都含有供体的 a 带和受体的 c、
d 带 , 表明所分析的 6个胚状体都是杂种起
源;结 合引 物 OPE05 、 OPW01 和 引 物
OPA07的扩增结果 , 也能够看出胚状体的
杂种特性:在引物 OPE05 的扩增带型中 ,
胚状体都具有枳橙的 e带 (图 1 , Ⅱ), 在
引物OPA07 和OPW01 的扩增带型中 , 胚状
体则分别具有 Page橘柚的 h 带和 m 带 (图
1 , Ⅲ和Ⅳ)。从图中还可以看到 , 枳橙的
部分 RAPD 带在杂种胚状体中没有出现:
引物OPAN07 的扩增产物中 , 枳橙的 b带在
6 个胚状体中都未能检测到;OPE05 的扩增
产物中 , 枳橙的 f带只在1 号和 6号胚状体
中出现 (图 1 , Ⅱ);引物 OPW01 的扩增带
型与受体 (Page)相似 , 杂种胚状体中却
没有出现 Page橘柚的 n带和枳橙的特征带 o 带 (图1 , Ⅳ), 在引物 OPA07扩增带型中 , Page橘柚和枳橙
共有的带 i和枳橙的特征带 l也未出现 , 说明供体亲本的部分遗传物质发生了丢失。此外 , 从部分引物
的扩增结果中还能看出杂种胚状体出现了双亲没有的新带。在 OPE05中 , 第 1 号和第 6 号胚状体都出现
了 1条新带 (g);而在引物OPA07 中 , 6 个杂种胚状体都分别出现了 2 条新带 (j 、 k)。带的缺失和增加
可能是供体和受体基因组重组 、 丢失所造成的。在OPA07 、 OPAN07 和OPW01 3个引物的扩增反应中 , 供
试 6个胚状体的 RAPD带型相同 , 只在引物 OPE05 的扩增带型中表现出细微的差别。
本研究采用叶肉原生质体作为供体 , 与经 IA 处理的悬浮系原生质体融合 , 成功得到杂种胚状体 ,
表明叶肉原生质体能够用于非对称融合 , 这为柑橘非对称融合提供了一条思路。在开展非对称融合时 ,
对供体原生质体的辐射处理通常要达到两个目的:第一 , 造成细胞 DNA断裂 , 促进进入杂种的供体染色
体部分丢失;第二 , 抑制原生质体分裂和形成细胞团 , 减少融合后代的鉴定工作。 在现有培养条件下 ,
柑橘及其近缘属的叶肉原生质体不能分裂 , 更不具有胚胎发生能力。因此 , 以叶肉原生质体为供体时 ,
不必寻找抑制分裂的射线剂量 , 只要所用射线剂量能够造成 DNA断裂即可 , 不要求过高的剂量。用较低
的剂量辐射供体原生质体 , 能够避免过度辐射对细胞造成的伤害 , 有利于融合后的再生。本研究中再生
的胚状体未能再生丛芽 , 其原因可能是:一方面 X-射线辐射 45 min 对枳橙叶肉原生质体造成极大的伤
害 , 与受体原生质体融合后 , 代谢得到互补 , 但由于叶肉原生质体与悬浮系原生质体所处的生理状态不
同 , 其代谢互补不完全或有限 , 不能达到最佳状态 , 最终影响其形态分化;另一方面 , 胚状体的非对称
程度较高 , 双亲遗传物质协调表达能力较差 , 也影响其形态分化。
参考文献:
1　Vardi A , Breinman A , Galun E.Cit rus cybrids:production by donor-recipient fusion and verification by mitochondrial DNA pro-
208　　　　　　　　　　　　　　　园　　艺　　学　　报 　　　　　　　　　　　　　　　27卷
f iles.Theor.Appl.Genet., 1987 , 75:51～ 58
2　Vardi A.Protoplast-fusion-mediated transfer of organelles from Microcitrus into Citrus and regeneration of novel alloplasmic trees.
Theor.Appl.Genet., 1989 , 81:141～ 143
3　Grosser J W , Gmitter F G Jr.Protoplast fusion and citrus improvement.Plant.Breed.Rev., 1990 , 8:339～ 374
4　刘继红 , 邓秀新.X-射线对柑桔愈伤组织和原生质体的影响.核农学报 , 1998 , 12 (5):317～ 320
5　史永忠 , 郭文武 , 邓秀新.柑橘 RAPD技术体系建立与体细胞杂种鉴定.园艺学报 , 1998 , 25 (2):105～ 110
Regeneration of Hybrid Embryoids via Protoplast Asymmetric Fusion between
Citrange and Page Tangelo
Liu Jihong and Deng Xiuxin
(National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement , Huazhong Agricultural University , Wuhan 430070)
Abstract:X-irradiated mesophyll protoplasts of citrange (Poncirus trifoliata ×Citrus sinensis)were electrofused
with embryogenic protoplasts of Page tangelo (C.reticulata ×C.paradisi), which were treated with 0.25 mmol/ L
iodoacetic acid for 15 min.Calli and embryoids recovered from the fusion products.A lot of diploid and aneuploid
cells , together with few tetraploid cells , were observed.Four arbitrary primers , OPA07 , OPE05 , OPAN07 and
OPW01 , were selected to identify the hybridity of the embryoids.The results of RAPD analy ses showed that the em-
bryoids were somatic hybrids between Citrange and Page tangelo.
Key words:Citrus;Asymmetric fusion;Somatic hybrids;RAPD
图版说明　原生质体融合 、 胚状体再生及愈伤组织染色体检查　1.异源融合子 (×400);2.细胞团 (×800);
3.胚状体;4.二倍体细胞 (2 n=2 x=18 , ×2 000);5.四倍体细胞 (2 n=2 x=36 , ×1 600);6.非整倍体细胞
(19条 , ×2 000)。
Explanation of plates　Protoplast fusion, regeneration of embryoids and cytological examinations　1.One heterokaryon (×400);
2.Cell clusters derived from protoplasts (×800);3.Regenerated embryoids;4.Diploid cell with 18 chromosomes (×2 000);
5.Tet raploid cell with 36 chromosomes (×1 600);6.Anueploid cell with 19 chromosomes(×2 000).
2093期 　　　　　　刘继红等:枳橙与 Page橘柚原生质体非对称融合再生杂种胚状体