全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 31(3)：295— 299 2011年 5月
DOI：10．3969／j．issn．1000—3142．2011．05．004
基于 AFLP分子标记技术的黑花韭与
多星韭遗传多样性与亲缘关系分析
王 锦 ，何承中1，党承林2，黄瑞复2
(1．西南林业大学 ，昆明 650224；2．云南大学 生命科学学院，昆明 650031)
摘 要：采用AFLP分子标记技术分析了分布在滇中、滇西、滇西北的3个黑花韭居群、3个二倍体多星韭居
群和 6个四倍体多星韭居群的遗传多样性与亲缘关系。结果表明，12个居群在 DNA水平上已发生明显分
化。居群间的基因分化系数(GsT)为 0．444。由GST计算的居群间基因流(N )为 0．625，表明居群间部分基
因流动受阻。12个居群间的遗传距离(D)在0．019~0．298之间，平均为0．185。UPGMA聚类结果表明居群
聚类关系与地理分布相近似。四倍体多星韭与黑花韭的遗传距离较与二倍体多星韭的遗传距离要小。二倍
体多星韭与黑花韭的遗传距离最大，它们之间的亲缘关系最远。
关键词：黑花韭；多星韭；遗传多样性；亲缘关系
中图分类号：Q152；Q157 文献标识码：A 文章编号：1000—3142(2011)03—0295—05
Genetic diversity and relationship of Allium
tchongchanense and A．wallichii
based on AFLP an alysis
WANG JinI，HE Cheng-Zhong ，DANG Cheng-Lin2，HUANG Rui-Fu
(1．Southwest Forestry University，Kunming 650224，China；2．College of Li
Science，Yunnan University，Kunming 650031，China)
Abstract：Genetic diversity and relationship of 12 populations of Allium tchongchanense and A．wallichii which dis—
tributed in the central region，western region and northwestern region of Yunnan Province were analyzed by AFLP．
The results showed that there was obvious genetic differentiation among populations．Genetic differentiation eoeffi—
cient Gsr一 0．444．Nm一 0．625 calculated by Gsr showed that gene flow was interrupted among populations．The
genetic distance(D)of 12 populations was 0．O19—0．298，average 0．185．UPGMA cluster results showed that genetic
distance relationship was in accordance with geographic distribution．The genetic distance between A．wallichii tetra—
ploid and A．tchongchanenseow was smaller than that between A．wallichii tetraploid and A．wallichii diploid．The
genetic distance was the largest between A．wallichii diploid and A．tchongchanense．
Key words：Allium tchongchanense；A．wallichii；genetic diversity；relationship
黑花韭 (Allium 0 g 口 8 s8)、多星韭 (A．
wallichii)均为百合科(Liliaceae)葱属粗根组(sect．
Bromatorriza)的植物，它们营养体差异很大，但花
的构造差异不大。在学术界，关于黑花韭和多星韭
的分类学处理存在分歧，《中国高等植 物图鉴》
(1980)中，把黑花韭定为独立的分类学种；但许介眉
收稿 日期 ：2010—10—27 修回日期：2011-03—07
基金项目：国家林业局“948”项目(2008—4—11)；云南省级重点学科、云南省高校重点实验室及西南林业大学实验室共享平台基金(200826)[Supported
by the“948”Item of State Forestry Bureau(2008—4—11)；Yunnan Key Discipline。Yunnan College and University Key Laboratory for Ornamental Plant and
Horticulture and Southwest Forestry University Sharing Platform(200826)]
作者简介 ：王锦(1966一)，女，北京市人，博士，教授 ，主要研究方向为植物生态遗传 、园林生态和观赏园艺 ，(E-mail)908505685@qq．eom。
296 广 西 植 物 31卷
在《中国植物志》(1980)中，将黑花韭归并为多星韭，
作为多星韭的异名。多星韭有二倍体和四倍体两种
核型，在不同的分布区，植株形态和花的构造存在一
定的差异(晏一祥等，1990)。云南大学生命科学院
对多星韭和黑花韭的研究较早，自20世纪 9O年代
以来先后有多位硕士研究生对多星韭(按《中国植物
志》分类处理)居群在生态、细胞学、遗传结构等方面
进行了初步研究，并取得了一些研究成果(邹晓菊，
1997；李曼碧，1998；蔡小虎，1999；黄骥，2000)。王
锦等(2006)还对多星韭生态遗传学研究进展进行了
综述。但 目前还未见从分子水平对多星韭和黑花韭
遗传多样性和亲缘关系研究的报道。本文以云南为
重点，在黑花韭和多星韭居群分布较为集中的滇中、
滇西、滇西北 3个地区进行广泛调查和采样，采用
AFLP分子标记技术分析黑花韭和多星韭遗传多样
性和亲缘关系。研究结果旨在为这两个种的划分提
供分子遗传学依据，为其生物多样性保护、花卉新品
种选育和野生花卉资源开发利用提供科学参考。
1 分布与生境
在黑花韭与多星韭主要分布地区，根据其分布
的海拔梯度和生境特征，重点调查了 12个典型居
群。黑花韭和多星韭的生境复杂多样，为方便起见，
本文将其生境分为岩溶型、岩生型、灌草型、林地型、
草甸型 5种类型。各居群编号、地点、地理位置、海
表 1 12个居群的生境概况
Table 1 Habitats of 12 populations
注：L1、J3、J4为黑花韭居群；D、S1、s2为二倍体多星韭居群；L2、L3、L4、j1、J2、j5为四倍体多星韭居群。
Note：L1，J3 and J4 as Allium￡ch gc^ s8 populations；D，S1，S2 as A．wallichii diploid populations；L2，L3，L4，J1，J2，J5 as A．walichii
tetraploid populations．
拔 、生境见表 1。
2 材料与方法
2．1材 料
依据随机取样的原则，居群内个体数较多时，随
机采取 30株个体作为分析样本，样株间相隔约 5O
m，居群内个体数少于 30株时，全部取样。采集新
鲜叶片为材料进行试验。
2．2基因组 DNA提取
采用改良SDS法依照标准酚／氯仿流程(Mur—
ray Thompson，1980)提 取 基 因 组 DNA，用
0．8 的琼脂糖凝胶电泳检测其质量，用紫外分光光
度计(Spekl一1300)检测其浓度，最后分取各样本 50
L DNA混合样品稀释至 20 ng／~L，保存于一2．O。C
冰箱备用。
2．3 AFLP分析
AFLP分析的基本程序按 Vos等(1995)所描
述的方法进行，仅依据本实验室的前期经验对体系
进行优化。采用 EcoRI／MseI酶切组合进行基因组
限制性酶切，预扩增反应选用引物组合 EOO／MO0，
选择性扩增反应采用引物组合 E+3／M+3。PCR
扩增反应在 PTC-100 Thermal PCR仪上进行。
选择性 PCR产物与双指示剂(变性液)按 2．5：1的
比例混合，于 95。C进行变性 5 min后立即放置于冰
水混合物中。取 6 L热变性后的混合液上样，在
6 变性聚丙烯酰胺凝胶中 90W 恒功率电泳约 9o
min。电泳结束后采用银染检测法进行 AFLP指纹
3期 王锦等：基于 AFLP分子标记技术的黑花韭与多星韭遗传多样性与亲缘关系分析 297
显色(Tixier等 ，1997)。
2．4数据统计分析
按电泳图谱 中同一位置上 AFLP条带的有无
进行统计，有带记为“1”，无带记为“0”，形成 0／1矩
阵图输入计算机。应用 POPGENE 1．31软件(Yeh
等，1997)在假定居群处于 Hardy-Weinberg平衡状
态下，对全部居群和各单个居群分别进行遗传参数
分析，计算多态位点百分率(P)、观测等位基因数
(N0)、有效等位基因数(Ne)、Nei’S基因多样性指
数(H)、Shannon信息指数(D、以及居群间的Nei’S
遗传距离，采用 UPGMA方法对 24个居群进行聚
类分析。居群间基因流的定量估测是通过公式 N
一 (1一G ／4 G )间接推算(Wright，1978)。进一
步采用 wINAMOVA1．55软件(Excoffier，1993)对
品种间以及品种内的分子变异进行分析(AMO—
VA)，同时算得 品种问 的基 因分 化系数 ( )。
POPGENE 1．31软件和 WINAMOVA 1．55软件
的输入文件由DCFA 1．1软件(张富民等，2002)制
作。WINAMOVA 1．55软件分析的显著性检验采
用 1 000次置换。
3 结果与分析
不同的 E+3／M+3引物组合可产生不同数量
及大小的 AFLP片段，5对引物组合分别检测到 69
～ 73个 AFLP标记，平均每对引物组合可检测出
71．4个；5对 AFLP引物组合共检测到多态性标记
348个，多态性水平最高者为引物组合 E-AGT／M—
ATG，达 lOO ，最低者为 引物 组合 E—GAA／M—
AAC，其多态性水平为 93．06 ，每对 AFLP引物组
合平均可产生 69．6个多态性标记(表 2)。
从 42对引物组合中筛选出了 5对 AFLP引物
组合 E—AAT／M—GAC、E—ACT／M—AGG、E—AGT／
M—ATG E—ATG／M—TAC、E—GAA／M—AAC用 于居
群遗传相似性研究。5对 AFLP引物组合共检测到
357个标记 ，其 中 348个 是多态 的。在 居群水平上
的多态性标记在 23．53 ～78．99 之间，平均为
55．95 ，多态性水平最高者为梁王山 L4居群，最
低者为香格里拉 S2居群，居群遗传变异程度依次为
L4>J2> L3>L2>J1>J5>D> L1>J4>J3>S1>
S2；居群水平上的观测等位基因数在 1．235～1．790
之间，平均为 1．560个，有效等位基因数在 1．125～
1．380之间，平均为 1．258个；Nei’S基因多样性指
数在 0．084～0．226之间，平均为 0．162，Shannon
信息指数在 0．130～0．351之间，平均为 0．254，其
大小变化规律与各居群多态性标记百分率的大小趋
势相似(表 3)。
表 2 AFLP选择性扩增引物产生的条带多态性
Table 2 AFLP selective amplification of
polymorphic primer bands
WINAMOVA 分析结果表 明，l2 r个居 群 间的
遗传变异分量为 22．423，占总遗传变异的 33．16 ；
而居群内遗传变异分量为 45．192，占总遗传变异的
66．84 9／5。居群间存在极显著 的遗传分化 ( sr一
0．332，PPOPGENE分析结果表明，12个居群间的基因
分化系数(GSr)为 0．444，即有 44．4 的遗传变异存
在于居群间，而居群内不同个体之间的遗传变异占
55．6 。由 G 计 算 的居 群 间 基 因 流 (N )为
0．6254，表明居群间部分基因流动受阻。由居群间
基因分化系数和基因流值可见，12个居群问的基因
交流较少，各居群间由于生殖上的部分隔离和隔离
已经 出现了较 明显的分化趋向。
12个居群间的遗传距离(D)在 0．019～0．298
之间，平均为0．185。其中，梁王山多星韭四倍体居
群 L3与 L4居群间的遗传距离最小，D==0．019，而
鸡足山多星韭四倍体居群J5与香格里拉多星韭二倍
体居群 s1居群间的遗传距离最大，D=0．298(表 5)。
根据 Nei’S遗传距离，采用 UPGMA方法对 12
个居群的聚类结果表明，在阈值为0．10处将 12个居
群划分为两大组，第 1组由梁王山4个居群和鸡足山
5个居群构成，而第 2组包含了香格里拉 2个居群和
道人山居群，聚类关系与地理分布相近似(图1)。
4 讨论
12个居群基因位点的多态性异常丰富，多态位
298 广 西 植 物 31卷
表 4 居群间和居群 内分子变异的 AMOVA分析
Table 4 AM0VA analysis of molecular variation among populations and within population
点高达 97．48 9／6。在居群水平上的多态性标记在
23．53 9／6～78．99 9／6之间，平均为 55．95 ；每个位点
在居群水平上的观测等位基因数在 1．235～1．790
之间，平均为 1．560个，有效等位基因数在 1．125～
1．380之间，平均为 1．258个 ；这是 12个居群形态
性状多态性丰富多样的遗传学基础；四倍体居群在
这三个指标上均大于二倍体居群，四倍体居群有更
高的多态性和变异性，因而四倍体居群分化剧烈，分
布范围比二倍体居群更为广泛。班勇(1995)认为，
广泛分布的物种常常维持较高的遗传变异，而环境
因子变化较大，又对广布种多态性的维持起着较大
的作用。
3期 王锦等：基于 AFLP分子标记技术的黑花韭与多星韭遗传多样性与亲缘关系分析 299
J3
d4
L1
L3
L4
L2
J2
J1
J5
S2
S1
D
O．12 0．10 0．08 0．06 0．04 0．02 0．00
遗传距 离 Geneti c di stances
图 1基于 Nei’s遗传距离的 12个居群 UPGMA聚类图
Fig．1 UPGM A dendrogram of 1 2 populations
based on Nei’s genetic distances
12个居群间的基因分化系数(Gsr)为 0．444，即
有 44．4 的遗传变异存在于居群间，而居群内不同
个体之间的遗传变异占 55．6 ，居群内不同个体问
的变异是遗传多样性的主要来源。由G 计算的居
群间基 因流(N )为 0．6254，表明居群间部分基 因
流动受阻。各居群问由于生殖上的部分隔离和隔离
已经出现了较明显的分化趋向。多星韭的繁育系统
通常为异花授粉 ，居群 内和居群间均能发生重组和
基因流动，但各居群特别是小居群都发生不同程度
的遗传漂变，并且不同生境和地区居群间存在一定
的地理隔离，阻碍了基因流动，因而各居群的遗传基
础会有所不同。而不同的选择压力作用于相似或相
异的遗传基础，造成各居群间的遗传差异，并导致它
们在物候、形态、核型及适应性等方面的分化。
12个居群问的遗传距离(D)在 0．019~0．298之
间，平均为 0．185。四倍体多星韭与黑花韭的遗传距
离较小，而与二倍体多星韭的遗传距离较大，说明四
倍体多星韭与黑花韭之间的亲缘关系较近。四倍体
多星韭的二倍化程度很高，说明它是部分异源四倍
体起源，并且已经历了一个较长的二倍体化过程(杨
爽等，2007；赵丽莉等，2008)。所调查的 12个居群
中，四倍体多星韭居群与黑花韭居群为同域分布，黑
花韭可能就是四倍体多星韭的亲本之一。四倍体多
星韭生境多样，既有林地型也有灌草型和亚高山草
甸型，表明它是成功的多倍体，除了多倍性本身具有
的可广泛重组等原因外，二倍体化程度高是其成功
的重要原因。异源多倍体在形态上往往与亲本二倍
体不连续，表现为清楚可分的种，所以较易赢得分类
学家的认可(徐炳声，1998)。二倍体多星韭与黑花
韭的遗传距离最大，它们之间的亲缘关系最远。
参考文献：
中国高等植物图鉴编委．198o．中国高等植物图鉴(第 5册)
[M]．北京：科学出版社：22—32
中国科学院中国植物志编辑委员会．1980．中国植物志(第 14
卷)[M]．北京：科学出版社：210—211
Ban Y(班勇)．1995．Plant life history strategies[J]．Chin J Ap一
＆ol(生态学杂志)，14(3)：33—39
Cai XH(蔡小虎)．1999．A study on population differentiation of
Allium wallichii in Yunan Province[-D]．Yunnan University
Excofier L． 1993． Analysis of Molecular Variance(AM0Ⅵ )
Version 1．55[R3．Genetics and biometry laboratory，University
of Geneva，Switzerland
Hsu PS(徐炳声)．1998．The species problem in plant taxono—
my in China[J]．Acta Phytotaxon Sin(植物分类 学报)，36
(5)：47O一480
Huang J(黄骥)。2000．The ecological genetics of Allium walli—
chii in Liangwang Mountain Kunming area[D]．Yunnan Uni—
versity
Li MB(李曼 碧)．1998．A study on population variation and
differentiation of Allium wallichii in Kunming area[D]．
Yunnan University
Murray MG，Thompson WF．1980．Rapid isolation of high-molec—
ular weight plant DNA[J]．NuclAcid Res，8：4 321—4 325
Timer MH，Sourdile RM，Leroy P，et a1． 1997． Detection of
wheat microsatelites using a non radioactive silver nitrate stai—
ning method[J]．J Genet Breed，51：175—177
Vos P，Hogers R，Bleeker M，eta1．1995．AFLP：a new technique
for DNA fingerprintingEJ]．NuclAcid Res，23：4 407—4 414
Wright s．1978．Evolution and Genetics of Populations，Vo1 4，
Variability within and among natural populations[M]．Chicago：
University of Chicago press
Yan YX(晏一祥)，Huang RF(黄瑞复)，Wei RC(魏蓉城)，et a1．
1990．Studies on the karyotype of 5 samples of Allium sect．
Bromatorrhiza EkbergEJ]．Acta Phytotax Sin(植物分类学
报)，28(3)：177—184
Yang S(杨爽)，Wang J(王锦)．2007．Study on cytological karyo—
type of Alium wallichii in Liangwang mountain area，Yunnan
Province[J]．J Southwest For Coll(西南林学院学报)，27(5)：
38— 41
Yeh F，Yang RC，13oyle T，et a1．1997．A user-friendly shareware
for population genetic analysis[R]．Molecular and Biotechnology
Center，University of Alberta，Edmonton
Zhang FM(张富民)，Ge S(葛颂)．2002．Data analysis in popula—
tion genetics．I．analysis of RAPD data with AMOVA[J]．
Biodivers Sci(生物多样性)，10(4)：438—444
Zhao LL(赵莉丽)，Wang J(王锦)．2008．The study on karyotype
of AIlium zoallichii in Jizu Mountain，Yunnnan Province[J]．
ShandongFor Sci Tech(山东林业科技)，38(3)：1—3
Zou XJ(邹晓菊)．1997．Cytological studies on several populations
of Allium wallichii in Jizu Mountain Dali area and Kunming ar—
ea[D]．Yunnan University
Wang J(王锦 )，Dang CL(党 承林 )．2006．Research progress on
ecological genetics of Allium walichii[J]．For Inv Plan(林业
调查规划)，31(2)：93—95