全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 2O(4)：31 3～318 2000年 t1月
文 章编 号 ：1 900—3 142(2000)04—0313 06
． 。 2
柚类种质资源 RAPD标记研究的引物筛选
＼／
张太平 ，李 丹 ，彭少麟 ，凌定 厚 ，陶丽珍
(中国科 学 院华 南 植物 研究所 r 东广 州 5l06 50)
摘 要 ：利用 100个 】0碱 基随机引物 ．对柚娄 4个品种 酸柚 沙田柚 、文旦柚 和泰国柚进行 了
RAPD标记的引物筛选研究 ，结果为无扩增产物 的引物 1 8个 ．在 】、2、3个和所有 4个样品中有
扩增产物的引物数分别为 20、13、25和 24个 ：读取了 12个在所有 4个样品中都有扩增产物的引
物的 RAPD带 ，计算 了样品间RAPD多态性位点的百分率为 60 6 ；计算 了样品问 的相似系数和
遗传距离，并对遗传距离进行 了UPGMA 聚类分析，论证 了利用所筛选 出的引物对柚 娄进行 RAPD
标记研究的可行性和可靠性 。
美键词 ：柚类 1 RAPD标记 ：引物 ：筛选 中囤分 ；_ i 码 素
Primers screening for the study on pum mel o
germ pl asm with RAPD markers
ZHANG Tai ping，LI Dan，PENG Shao—lin，LING Ding—hou，TAO Li—zhen
s∞ Chbm Institute Bot~ y ， CAS、Guangzhou 510650，ch Lna )
Abstract：One hundred arbitrary 10一base primers were used here for screening for the study on pumme—
lo germp]asm with RAPD markers Four samples of pome[o cu[tivars Suanyou．Shatianyou．Wen—
danyou (3euttivars from China)and Taiguoyou(a cultivar from Thailand)were used for ana[ysis．The
results showed that 18 primers didn’t produce any RAPD products within al 4 sampk ；while 24
primers prod uced variab[e RAPD products in al 4 samples．The rate of po[ymorphic loci among 4 sam—
p]es was 60-6％ according to the data maintained from 12 primers Odt of above 24．Similarity indices
and genet{c distance were calculated among 4 samples．The UPGM A c]uster was conducted on the base
of matrix of genetic distance． The result coincided with the pedigree of pummelo．
Key words}Pum melo{RAPD markers；primersl SC reening
收 稿 日期 l999—05—2 5
作者筒舟：张太平 (1967 1·男·生态学专业一在读博士．主要从事污染生态学与分子生态学研究工作。现通讯地址：华
南理工大学资豫 与环境工程系 t510640)
基金项日：国家自然科学基金重大项 目 (3989 9370)、中日美圊际合怍项目 (1 998年度)、中国科学 院广州分 院广东省科
学 院科 拄计 划项 目 (99B05902X) 资助
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3l4 广 西 植 物 2O卷
自 60年代利用同工酶作为遗传标记以来 ，分子标记技术迅速发展。特别是 PCR技术的出
现 ，使得基于 DNA的分子标记技术变得便捷而可靠。近年来迅速发展起来的分子标记技术包
括 RFI P (Restriction Fragment Length Polymorphism)、AFI P (Amplified Fragment Length
Polymorphism )、VNTR (Vafiable Number Tandem Repeats)、ISSR (Inter Simple Sequence Re
peats)、RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)等。RAPD标 记技术 是由 Wiliams等
(1990)和 Welsh(1990)等创立起来的。 ，由于其成本低，快速、灵敏 ，所需 DNA的量微少，
不需放射性同位素标记而用溴化乙锭染色后直接观察记录，因而倍受生物学家的青睐 。近年
来 RAPD分子标记技术 已迅速用于物种起源的遗传分析。 、遗传育种的品种鉴定 、遗传工
程 的基 因定 位“：等方面 的 研究 。RAPD在 果树 种 质资 源的 研究 中也迅 速用 于 品种鉴 定 与分
类 、系谱分析 、特异性状的基因标记 等各个方面 。由于 RAPD标记技术应用随机引物，
当对 大量实验材料进 行研究 时 ，往往首 先要对 引物进行筛 选 。
柚 (Cu~s grandi~Osbeck)为柑桔属常绿果树 ，广泛分布于中国及东南亚的亚热带地区，
种质资源非常丰富 。我国为柚类遗传多样性分布中心之一，据初步统计，我国现有栽培品种
(系)12o个以上 。为进一步开发利用柚类种质资源 ，必须对其遗传多样性进行深入研究。国
内外利用同工酶。 、ISSR⋯ 等标记技术对柑桔属其他果树及柚类的部分品种进行过研究，但
还未见利用 RAPD标记技术 对柚类种质 资源进行 系统研究的报道 。为便 于更有效地利用
RAPD技术对柚类种质资源进行遗传分析，本实验利用 4个柚类品种为材料，通过 RAPD标
记技术对 100个 lO碱基的随机引物进行筛选，并对结果进行了 UPGMA聚类分析 。
1 材料 与方法
1．1实验 材料
本实验所用的材料为半野生的酸柚 ，国内常见栽培品种沙田柚、文旦柚 ，以及泰国引种
的栽培品种 (品种名未知，暂叫泰国柚)。取幼叶作为提取基因组 DNA的实验材料 。由于本
实验的主要 目的是对柚类种质资源 RAPD分析所需引物进行筛选 ，所以所选实验材料尽量代
表不同的遗传背景。
1．2基 因组 DNA 的提 取
采用 Charles J．Simson等的方法 ，并参照 N．F．Weeden讲义 (分子生物学技术培训
班资料)稍作修改。分别取酸柚、沙田柚 、文旦柚与泰国柚新鲜幼嫩叶片 l em 左右，置于研
钵 中，加入 1 mL CTAB提取缓冲液 (2 w／VCTAB，1．4 M NaCI，2OmM EDTA，100 mM
Tris—HCI，pH8．0，0．4 v／v巯基乙醇)，研磨成匀浆，转入 2 mL离心管中，加入 100 I 氯
仿一异戊醇 (24：1)，65。C加热 2O～30 min，然后冷却至室温 ，再加入足够的氯仿一异戊醇，充
满整个试管，反复摇动至形成乳浊液，10 000× g离心约 10 rain左右使其形成分离相。将上
层水相 (约 0．5～0．8mL)转移至 2ml 离心管中，加人等体积冰冻酒精使 DNA沉淀 ，将 DNA
挑出来用 70 酒精冲洗 ，真空干燥后溶于 100 TE中备用。
1．3 PCR反应 及其产 物电泳
扩增反应在 Biometra的UNO-Thermerblock上进行。25 l反应液中包括 10 mM Tris—HCI
(pH9．0，25。C)，50 mM KC1，0．01 tritonX一10，1．9 mM MgCI2，0．1 mM 4×dNTP，0．2
M 10碱基随机引物 ，l单位 TaqDNA聚合酶，lO～50 ng模板 DNA。反应液上加 2O l矿
物油肪止反应过程的水分蒸发 。反应过程共 45个循环，除第一个循环经 94。c预变性 30 S，每
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4期 张太平等 ：柚类种质资源 RAPD标记研究的引物筛选 31 5
一 个循环都包括 92℃ 变性 1 rain，35。C引物与模板结合 1min，72 C引物延伸 2rain，最后
一 次循环还包括 72。c保温 5 rain，降温至 4。c等候取出或直接取出样品在冰箱中 4℃ 保存。
灭菌重蒸水作为对照。扩增产物以 1．5 的琼脂糖凝胶电泳，以Gene Ruler TM 100 bp DNA
Ladder Plus(100~3 000 bp)为分子标记，溴化乙锭染色，结果用 Polaroid 667照相记录。
表 1 实验 所 用的 引物 殛其 序 列
Table 1 Primers used in the study and their sequences
1，4 RAPD标记 的数 据获得与 处理
根据照相记录，首先确定不同引物的扩增结果，统计在所有 4个样品中无扩增带的引物，
分别在 1、2、3个及所有 4个样品中都有扩增带的 j物。筛选出清晰且可重复的在所有 4个
样品中都扩增带的引物，在样品间对 RAPD的扩增带进行比较，确定清晰可重复的DNA带作
为一个位点 ，若某个 DNA带在一个材料中出现记为 “1”，未出现记为 “0”，根据公式 F一2N．，／
N +N。计算不同材料间的相似系数，N 为样品 i和样品j共有的分子量相同 DNA带，N．为样
品i的DNA扩增带数 ，N，为样品 j的 DNA扩增带数。各样品问的遗传距离 P一1一F。根据
样品问的遗传距 离矩 阵利用 Statsoft软 件进 行各样 品问 UPGMA (unweighted pair—group
method with arithmerk mean)聚类分析 。
2 结果 与分析
2．1 RAPD标记的引物筛选结果
本实验所用 100个引物 (S1一S100)为加拿太 Sangon公司的产品， j物及其序列见表 1
用 100个引物对 4个样品进行随机扩增 ，以筛选 出适合于对所有柚类品种进行 RAPD分析的
研 蚋螂 黜 葶}蓦} 葶；啪 跏啪㈣
眦 刚 哪_舅 跚鲫 _羞 _舅_景啪 啪吼
Ⅲ 蛐鲫蹦晰 鲫 啪 鲫Ⅲ螂啪
郅 卵邬卯 哪 吼_舅
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3 L6 广 西 植 物 2O卷
引物 。i00个 引 物在所有 d个样 品 中无扩增 产物 (i00 bp一3 000 bp，下 同)的有 1 8个 (18 )
表 2 四个样品 i2十随机 引物 的扩增结果
Table 2 RA PD pattern obtained from p~rnm elo samples with 12 primers
引 钉 RAPD带
prlmer band
Sl0
S．1
S73
S75
S79
S88
样 品 samples 引 钉 RAPD带
primers baJ ds
Sgl
S02
89 4
1酸柚 ；2沙 田柚 3文 旦柚 ；4泰 国柚 1，2．3．4 repre~nts Suanyou．Shatianyou
W endanyou-and T~isuoyou reslmctively
样 品”samples
} } } i { } } } i ! 、．
{ j ： ● ； ， j i c● 8 9 ． } 4
—
4 l 0 l 1 l
¨ ” ¨ ¨ ； { i 【、 ； 4 5 6 7 8 9 ∞ ¨
6 0 l 1 0 O O 1 l O 0 l l 1 0 0 0 0 l 1 1 l l } 1 l 1 O O 0 l l l 1 1 0 0 l l 1 1 l O 0 ， 1 l l 1
i { ： 4 5 6 7 8 9 O
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4期 张太平等：柚类种质资源 RAPD标记研究的引物筛选 317
分别为 s3、s9、$26、s31、$35、S,16、$50、$54、$55、s57、$59、$60、$62、$63、$66、$67、
s81、S100；在 1个样 品中有扩增产物的引物有 20个 (20 )，分别为 s4、sl2、S13、S14、
S16 S1 9， $22， $29 $34， $36 $38 $4o S,19 s 1 $64 $65， $77 $86， $87 $95
在 2个样品中有扩增产物的引物有 1 3个 (13 )，分别为 s7、Sl1、S1 5、S17、$28、$30、$32、
$37、$68、$70、$71、$74、$98；在 3个样品中有扩增产物的引物有 25个 (25 )，分别为
S1、 S2、Sj、S6、S18、 S21、$23、S21、 S27、$43、$44、$45、S51、 $52、$53、$56、$58、
$69、$78、$82、$83、$85、$89、$93、$99：在全部 4个样品中都有扩增产物的引物有 24个
(24 )，分别为 S8、StO、$2o、$25、$33、$39、s4l、$42、$47、$48、$72、$73、$75、$76、
S79、 $80、 $84、 $88、 $90、 S9l、 $92、S94、 $96、 $97。
A—
B一
图 t 引物 $78 $79、$80的 RAPD 电辣结 果
Fig 1 RAPD products of pfimer~$78、 S79 $80
2、3、4同表 2．M 为标 记 DN^．A 为 3 000 hp
B为 500 bp l、! 3、4liketable，
A=3 000 bp，B一 500 bp
一 般来说 ，在 大部 分样 品 中不能 产生
DNA 扩增带 的引物 ，说 明与该类 种质基 因
组 DNA 的同源性 较低 ，在 对 种质 资源 的
RAPD研究中不宜用作合适的引物，而通
常筛选出能在所有样品中产生清晰、可重
复 的 DNA 扩增带 的引物用 于正 式 的种质
资源大规模材料的 RAPD标记研究 。
2．2 RAPD标 记的数 据分析
选取在所有 4个样品中都有扩增产物
的引物 12个 ，它们为 S10、S,17、$73、$75、
圈 2 引 物 s9】、$92、s93的 RAPD 电泳 结果
Fig 2 RAPD products of primers$91、$92、 $93
1、2 3、4同表 2．M 为标 记 DNA，A 为 3 0O0 bp
B为 500 bp．1、2、 3、4 liketable．
A 一 3 000 bp B： 500 bp
表 3 4个柚 类样 品问 的 相似 系敲 和 遗传 距 离
Table 3 Simi[arity index and genetic distance
of 4 samp[es of pum m e]o
在 “ ”上方的数据为相似系数 ．下方为遗传距离
the data above⋯ are similarity indices and below are
genetic distance
$79、$80、$88、$90、$91、$92、$94、$96，根据照 片记录 ，如 图 1、2为部分 引物的 RAPD
图谱 读取每个引物的扩增产物 RAPD带 ，如表 2
由表可知 ，l2个随 机 引物在 4个柚 类样 品 中共扩增 出 1O4条带 ，即检 测 到 104个柚类
RAPD位点，其中 63个位点为多态性位点 ，多态性位点百分率为 60．6％ 。
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318 广 西 植 物 20卷
根据以上公式计算各样品间的相似性系数和
遗 传 距 离 ，结 果 如 表 3。通 过 对 遗 传 距 离 的
UPGMA聚类分析 ，结果如图 3
从 4个柚类样品的 uPGMA聚类分析图可
以清楚 地看 出 ，处 于半野生 状态 的酸 柚与其 他 3
个栽培品种差别明显 ，单独归为一类；3个栽培品
种 之间遗传距 离较小 ，归为一类 ．而来 自国 内的 2
个 品种 首先聚在 一起 ，与来 自泰 国的样 品分离 ，与
柚类系谱关系相符 。
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