全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 27(6)：903— 908 2007年 11月
根癌农杆菌介导的玫瑰茄愈伤
组织的遗传转化
谢秀祯1，林俏慧2，郭 勇2
(1．海南师范大学 生物系 ，海口 571158；2．Department of Biochemistry，Biophysics and Molecular Biology，
Iowa State University，Iowa 50011，美国；3．华南理工大学 生物科学与工程学院 ，广州 510640)
摘 要：以根癌农杆菌 LBA4404和 EHA105为供体菌株，对玫瑰茄愈伤组织进行了转化条件的研究，建立了
一 套玫瑰茄愈伤组织遗传转化体系。利用该转化体系获得了2个稳定表达新霉素磷酸转移酶活性的玫瑰茄
转化细胞系。GUS活性组织化学检测和 PCR扩增鉴定的结果表明，愈伤组织的转化率为 4 0A。说明采用农
杆菌介导法将外源基因经愈伤组织导人玫瑰茄细胞是可行的。
关键词：玫瑰茄愈伤组织；根癌农杆菌；遗传转化；p一葡萄糖苷酸酶；新霉素磷酸转移酶Ⅱ
中图分类号 ：Q812，Q943 文献标识码：A 文章编号：1000-3142(2007)06-0903-06
A genetic transformation of roselle callus mediated
by Agrobacterium tumefaciens
XIE Xiu-Zhen1，LIN Qiao-Hui2，GUO Yong2
(1．Department of Biology，Hainan Normal University，Halkou 571158，China；2．Department of Biochemistry，
Biophysics and Molecular Biology，Iowa State University，Iowa 50011，USA；3．Colege of Bioscience and
Biotechnology，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China)
Abstract：In present paper，the basic conditions for the genetic transformation of Roselle calus were investigated by u—
sing Agrobacterium turnefaciens LBA4404 and EHA105，harboring pBI121，as donor strains and a genetic transfor—
mation system of Roselle calus was initiatively established，by which two transgenic Rosele cel lines expressed stab—
ly NPT]I activity were obtained．The results of GUS histochemical assays and PCR amplification demonstrated that
the overal1 transformation rate of Rosele calus was 4 0A．It iS feasible to use Agrobacterium-mediated method to in—
troduce exogenous gene into Roselle cels via calus．
Key words：Roselle calus；Agrobacterium tumefaciens；genetic transformation p-g1ucurol1idase；Neomycin phosph—
otransferase I
玫瑰茄(Hibiscus sabdariffa)是锦葵科木槿属
一 年生草本植物，原产非洲苏丹，广布于世界各热
带、亚热带地区。玫瑰茄是一种具有多种经济用途
的作物 ，我国西南、华南和华东地区均有栽培。玫瑰
茄花萼所含的花青苷色素是一种天然红色食用色
素，在国内外已应用于食品及饮料工业(李玉萍，
2003)；玫瑰茄细胞产生的花青苷，具有抗氧化、抗突
变作用(Pi—Jen等，2002)，在临床上已用于治疗高血
压、心脏病、发烧、发炎、肝脏机能障碍和免疫系统紊
乱等疾病(Dafalah等，1996；Haji等，1999)。另据
报道，玫瑰茄的提取物具有抗肿瘤、抗白血病和抑制
由胆固醇引起 的动脉粥样硬化的效果 (Chen等，
收稿日期：2006—09—25 修回日期 ：2007—02—08
基金项 目 广东省重点科技攻关项 目(A301020201)fSupported by Key Technologies Research and Development Program of Guangdong Pmv／nce
(A301020201)]
作者简介：谢秀祯(1960一)，男，海南儋卅I市人，博士，教授，主要从事基因工程的研究，E-mail：xiexiuzhen@sina．com。
通讯作者(Author for correspondence，E—mail：btyguo@SCUt．edu．cn)
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9O4 广 西 植 物 27卷
2003)。最近几年，Chang等(2005)及 Lin等(2005)
通过研究初步揭示了玫瑰茄提取物诱导人前髓白血
病细胞、胃癌细胞发生细胞凋亡的机理，从而为将玫
瑰茄提取物开发成肿瘤预防和治疗药物奠定了理论
基础。
自2O世纪 9O年代以来，国内外学者对利用玫
瑰茄细胞培养技术生产花青苷进行了广泛的研究，
并取得了可喜 的成果 (阮茜等，1999；朱新贵等，
1998；郑穗平等，1998)，但从 目前的研究结果来看，
生产周期长(约 16 d)已经成为制约这一技术走向产
业化的瓶颈之一。因此，如何获得快速增殖的玫瑰
茄细胞系已成为一个急需研究的课题。一条可供选
择的技术路线就是通过植物基因工程技术将诸如拟
南芥 Phytosulfokine—a的基因(Yang等，2000；林俏
慧等，2005)导入玫瑰茄细胞，以期获得快速增殖的
细胞系，在此基础上筛选花青苷高产细胞株。本文
作者曾报道了利用根癌农杆菌对玫瑰茄无菌苗的子
叶和下胚轴进行遗传转化的技术条件(谢秀祯等，
2006)，但通过农杆菌介导转化玫瑰茄转愈伤组织以
获得转基因细胞系的条件和技术方案至今尚未见报
道。玫瑰茄遗传转化技术的研究将为该作物的遗传
育种，特别是利用代谢工程培育花青苷高产新品系
及提早开花的新品种创造条件。
1 材料与方法
1．1材 料
(1)植物材料：玫瑰茄(Hibiscus sabdarifa L．)种子
来源于华南植物园引种部，消毒后播于不加激素的
B5固体培养基(附加 3 蔗糖)上，于25±1℃培养
箱中萌发，取 1O～12 d龄幼苗为实验材料。(2)农
杆菌菌株和质粒：根癌农杆菌菌株为 LBA4404
(str )和 EHA105(Cm )，均 含 植 物表 达 载 体
pBI121，该载体携带有gus基因和npt一1I基因，抗性
标记为 Kan。(3)酶和试剂：TaqDNA聚合酶购 自
大连宝生物公司；PCR引物由上海 Bioasia生物技
术有限公司合成；卡那霉素(Km，Sigma公司)、硫酸
链霉素 (Str，Amresco公 司)、乙酰丁香酮 (AS，
Aldrich公司)、X—Gluc(Genview公 司)购 自北京鼎
国生物技术有限责任公司；头孢霉素(Cefo)、氯霉素
(Cm)及其他试剂为国产或进口分装分析纯。(4)培
养基：愈伤组织诱导培养基成分为 B 培养基附加 l
mg／L 2，4一D、0．1 mg／L KT和 3 蔗糖，pH5．8。
侵染液为Bs培养基附加 3 蔗糖，pH5．8。预培养
基、共培养基和愈伤组织继代培养基成分相同，其组
成为 B5培养基附加 2 mg／L 2，4一D、0．1 mg／L KT
和 3 蔗糖，pH5．8。细胞悬浮培养基组成为B。培
养基附加 1 mg／L 2，4一D，0．1 mg／L KT和 2 蔗
糖，pH5．8。
1．2方法
1．2．1农杆菌感受态细胞的制备 以及质粒在不同农
杆菌菌株上的加载 按王关林等(2002)的方法进行
操作，获得的单菌落按王关林等(2002)提取质粒进
行验证 。
1．2．2农杆菌的活化 农杆菌在含有 50 mg／L Kan
和25 mg／L Str或 34 mg／L Cm 的 YEP选择培养
基上戈Ⅱ线暗培养(28℃)。长出菌落后挑取单菌落
在新的选择培养基上涂皿，取适量培养 48 h后的菌
体悬浮 于侵染液 中，可 同时加入终浓度为 100
tzmol／L的 AS，27～28℃，180 r／min培养 30 min
后用侵染液调整 OD ∞至合适数值即可用于浸染。
1．2．3玫瑰茄愈伤组织的获得及其预处理 取 10---
12 d龄的玫瑰茄无菌苗的下胚轴，切成 0．8～1 cm
长的切段，置愈伤组织诱导培养基上，25℃，光照培
养(强度为25．2／~mol·In-。·s～，光周期为 16／8 h
· d- )。待长出愈伤组织后，再将其切下并转移到
愈伤组织继代培养基上培养，2～3周继代 1次。作
为比较，当继代 4～5次后，取部分愈伤组织进行悬
浮培养 2代，收集细胞和细胞团转移到固体培养基
上培养并每隔2～3周继代 1次，获得愈伤组织。从
经继代培养的玫瑰茄愈伤组织中，挑选颜色新鲜、生
长旺盛的颗粒状愈伤组织在培养皿上适当干燥后 ，
即可用于浸染。
1．2．4农杆菌侵染及共培养 用于转化的愈伤组织
在农杆菌悬浮液中浸泡一定时间后，取出铺在放有
无菌滤纸的培养皿上吸干菌液，再转移到含有 100
tzmol／L AS的共培养基上(培养基表面铺一张无菌
滤纸)，适当风干后，于 25℃黑暗培养2～3 d。
1．2．5抗性愈伤组织的筛选 将共培养后的愈伤组
织取出放在有3层无菌滤纸的培养皿中干燥 2～3
d，再转移到含适当浓度 Kan和 300 mg／L Cefo的
愈伤组织继代培养基上选择培养。培养条件为 25
℃，光照强度为 25．2／~mol·In-。·s～，光周期为 16／
8 h·d- ，2～3周继代 1次。
1．2．6抗性细胞系的获得 将经2次继代培养的适
量愈伤组织转移到含有 100 mg／L Kan和 300 mg／
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6期 谢秀祯等：根癌农杆菌介导的玫瑰茄愈伤组织的遗传转化 905
L Cefo的悬浮培养基 中，25℃，100 r／rain，微光照
培养，2～3周继代 1次。最后一次继代时，培养基
中不加 Kan，培养到第 8天时取一定细胞 密度 的培
养物作平板培养，用于检测转化细胞 Kan抗性的遗
传稳定性。
1．2．7 GUS活性 的检 测 采 用组 织化 学法检测 。
将经检测确认无菌的抗性愈伤组织切成小块，取一
块加入 50 L X—Gluc反应液中，37℃保温 12 h，观
察蓝色反应。
1．2．8转化材料 的 PCR检 测 从转化材料 中提取
植物总 DNA进行 PCR扩增鉴定 。DNA粗提液微
量制备按王关林(2002)的方法进行。以转化材料的
DNA为模板，未转化材料的DNA作阴性对照。用
CaMV 35S启动 子 引物 5，_ATGACGCACAATC-
CCACTATCCTTC(、r3 和 Nos终 止 子 引 物 5 一
GATAATCATCGCAAGACCGGCAACAG一3 对
gus基因进行 PCR扩增，扩增条件为：94℃ 4 rain
预变性后，加入 2．5 U Taq DNA聚合酶，94℃ 1
rain，58℃ 1 min，72℃ 1 rain，30个循环 ，最后 72
℃延伸 10 min。预期扩增片段大小为2 063 bp。另
外 ，用 nptⅡ基 因的两 个 引 物 5，_GACTGGGCA-
CAACAGACAATCGG一3 和 5 一AGCAATAT—
CACGGGTAGCCAACG一3 对 转 化 细 胞 系 的 总
DNA进行 PCR扩增，扩增条件为：94℃ 4 rain预
变性后，加入2．5 U Taq DNA聚合酶，94℃ 1 rain，
60℃ 1 rain，72℃ 1 rain，30个循环 ，最后 72℃延
伸 10 min。预期扩增片段大小为 621 bp。
2 结果与分祆
2．1培养方法对愈伤组织生长的影响
为了获得理想的愈伤组织用于转化，本试验比
较了两种不同的培养方法对玫瑰茄愈伤组织生长状
况的影响。结果表明，从玫瑰茄无菌苗下胚轴诱导
获得的愈伤组织，如果一直在固体愈伤组织继代培
养基上培养，经 20次继代后所得到的愈伤组织结构
较紧密，有的质地较硬，有的表面湿润呈水浸状，生
长较差，不适于用作转化材料；而中间经过 2代悬浮
培养后再进行继代培养得到的愈伤组织结构较疏
松，呈颗粒状，红黄间色，表面较干爽，生长良好。因
此，本试验使用后者作为转化材料。另外，通过观察
发现，愈伤组织继代培养后第 8～10天，生长最快，
适于转化 。
2．2卡那霉素选择压的确定
玫瑰茄愈伤组织对抗生素敏感性的测定结果
(图1)表明，Km对玫瑰茄愈伤组织的增殖有抑制作
用。随着培养基中Kan浓度的提高，它对愈伤组织
生长的抑制作用也随着增大。当Kan浓度达到 300
mg／L时，愈伤组织的生长完全被抑制。因此，本研
究选用 300 rag／L Kan作为转化愈伤组织的选择压。
1OO
8O
I}田}I
6O
4O
啦； 2O
O
O 1OO 200 300
Km浓度／mg．L
图 1 Kan浓度对玫瑰茄愈伤组织生长的抑制作用
Fig．1 Inhibition of Kan concentration
on the growth of Roselle callus
＼
褂
富
謦
困
确
‘f)
LBA4404 EHA1 05
根癌农杆菌菌株
图 2 AS和农杆菌菌株对愈伤组织转化的影响
Fig．2 Effects of AS and different A．tumefaciens
strains on genetic transformation of Roselle callus
TER：瞬时表达率 Transient expression rate
2．3农杆菌菌株和 AS对转化的影响
在本试验中，采用两种常用的、遗传背景不同的
农杆菌菌株(LBA4404和 EHA105)对玫瑰茄愈伤
组织进行转化(两菌株的菌液浓度、侵染时间均为
OD 。：0．5和 10 rain)，并比较添加(添加量为 100
／*mol／L)和不添加乙酰丁香酮(AS)对转化效果的
影响。经过 3 d共培养后，统计 GUS组织化学反应
呈阳性的愈伤组织所 占的比例，结果见图 2。从图
中可以看到，两种菌株对玫瑰茄愈伤组织的侵染能
力存在 较大 的 差异，无 论是 否添 加 AS，菌株
LBA4404的侵染能力都明显强于菌株 EHA105。
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9O6 广 西 植 物 27卷
另外，在菌株 LBA4404菌悬液和共培养基中加人
AS后，受体材料 gus基因的瞬时表达率提高了
1．38倍，这说明使用愈伤组织作为转化的受体材料
时，由于缺少作为信号分子的酚类物质，外源 AS等
信号物质的添加能更有效地促进 T-DNA向植物细
胞转 移。但值 得 注 意 的是，加 入 AS对 菌 株
EHA105的侵染能力没有明显的提 高，这可能跟玫
瑰茄愈伤组织对这一菌株不太敏感有关。有鉴于
此，本试验选用菌株 LBA4404并在菌悬液和共培养
基中添加 100~mol／L乙酰丁香酮对玫瑰茄愈伤组
织进行转化。
2．4 pH值对AS作用效果的影响
在本试验中，当在农杆菌LBA4404的侵染液和
共培养基中都添加 AS时，pH值对 GUS基因的瞬
时表达率有很大的影响，pH为 5．6时表达率最高，
pH高于或低于 5．6转化率都明显下降，当 pH为
6．0时，转化率几乎为零(图 3)。因此，添加 AS的
侵染液和共培养基，必须严格控制其 pH值，以 5．6
为最佳。
图 3 pH值对AS诱导玫瑰茄愈伤组织转化的影响
Fig．3 Effects of pH value on genetic transformation of
Roselle callus induced with 100／~mol／L AS
2．5农杆菌菌液浓度对转化率的影响
分别用 5种不同菌液浓度的农杆菌 LBA4404
侵染玫瑰茄愈伤组织 10 rain，然后分别测定 gus基
因的瞬时表达率，结果 (图 4)表 明，菌液浓度在
OD 。小于 0．73时，随着菌液浓度的提高，gus基因
的瞬时表达率也随着增加，并在 ODs。0．73左右达
到最高值(70．6 9／6)。菌液 OD 。超过 0．73后，不仅
gus基因的瞬时表达率有所降低，而且愈伤组织的
褐化死亡加剧。尽管在 OD 。。为 0．73时，gus基因
的瞬时表达率最高，但愈伤组织的褐化死亡率也较
高。因此，综合考虑，用 OD 。为 0．55左右的菌液
侵染 10 rain进行玫瑰茄愈伤组织的转化。
褂
苗
鉴
因
郴
∞
3
0 0 0．2 0．4 0 6 0．8 1．0 1．2
农杆菌菌液浓度 (OD 600)
图 4 菌液浓度对愈伤组织遗传转化的影响
Fig．4 Effects of A．tumefaciens concentration on the
genetic transformation of Roselle callus
2．6共培养时间对转化率的影响
用 OD6。约为 0．55的农杆菌 LBA4404菌液侵
染玫瑰茄愈伤组织 10 min，在不同的共培养时间取
样进行 GUS染色鉴定，统计 GUS基因瞬时表达率
和愈伤组织褐化率，结果如图4所示。由图可见，开
始时，随着共培养时间的延长，愈伤组织的 GUS基
因瞬时表达率也随着提高，3 d时达到最高值，此后
GUS基因瞬时表达率有所下降，同时愈伤组织的褐
化率急剧增大，到6 d时褐化率达到 38 。因此，在
本实验中，共培养时间选择 3 d为宜。
60
褂 50
40
鉴 、30
因
醐 20
矗 1 0
0
＼
褂
野
诬
图 5 共培养时间对愈伤组织遗传转化的影响
Fig．5 Effects of CO—cultivation time on genetic
transformation of Roselle calus
2．7抗性愈伤组织的检测和鉴定
从本试验获得的 Kan抗性愈伤组织中随机挑
取 8块，用组织化学法测定细胞 GUS表达活性，其
中4块得到阳性结果，而阴性对照无蓝色反应。进
一 步用 CaMV 35S启动子和 Nos终止子特异性引
物对有GUS活性的愈伤组织总 DNA进行 PCR扩
增，均得到预期分子量约 2 060 bp的条带，与质粒
DNA扩增出的条带大小相同，而未转化的愈伤组织
，6＼斛 描
∞ 的 们 ∞ 加 0
∞ ∞ ∞ 们 ∞ 加 0
∞ ∞ ∞ 0
，6＼斟 苗蓝匝硝S丌
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6期 谢秀祯等：根癌农杆菌介导的玫瑰茄愈伤组织的遗传转化 907
的DNA中未扩增出相应的条带(图 6)。这表明通
过愈伤组织一农杆菌共培养法已将外源 gus基因导
入了玫瑰茄细胞并获得表达，愈伤组织总转化率为
4 。
bp
5000
M 1 2 3 4 5 6
图 6 转化愈伤组织的 PCR扩增结果
Fig．6 PCR amplification result of transgenic calli
M．DNA Marker；1．阳性对照 Positive control；2．阴性对照
Negative control；3-6．转化愈伤组织 Transgenic cali。
2．8抗性细胞系的获得及其检测
抗性愈伤组织经过原代和继代悬浮选择培养后
得到的抗性细胞系，再经无选择压力下继代培养 2
次，培养物在含 Kan和不含 Kan的平板中培养，其
植板率没有明显差别，进一步用 npt 1I基因特异引
物进行 PCR扩 增 ，均得 到 预期 扩增 片段 ，大 小 约
620 bp(表 1和图 7)。说明转化细胞系的 NPT 1活
性能稳定表达和遗传。
表 1 Kan抗性细胞 系的遗传稳定性检测
Table 1 Detection of genetic stability of
Kan resistant cell lines
3 讨论
利用基因工程技术将外源基因导入植物细胞是
现代遗传育种的重要途径。目的基因转化并整合到
受体植物细胞基因组中是植物基因工程地主要环
节。根癌农杆菌 Ti基因转化系统是目前研究最多、
理论机理最清楚、技术方法最成熟的基因转化途径。
但相对而言，这条途径的影响因素也是最多的，其中
关键的是用于转化的农杆菌菌株、目标植物受侵染
的部位和共转化的方法。
农杆菌作为植物遗传转化的工具，其属性对转
化的成功有决定性的影响。有研究表明(Kazuhito
等，1992)，不同植物对农杆菌侵染的敏感性不同，而
同一种植物对不同的农杆菌菌株也具有不同的敏感
性。在本研究中，普通株 LBA4404的转化率明显高
于超毒株 EHA105，这可能与植物细胞的内源激素
及细胞壁的结构等有关。
bp
2000
1000
750
500
250
100
M 1 2 3 4
图 7 转化细胞系的PCR扩增结果
Fig．7 PCR amplification result of transgenic cell lines
M．DNA Marker；1．阳性对照Positive control；2．阴性对照
Negative control；3-4．转化细胞系Transgenic cel lines
在本研究中，还发现玫瑰茄的生理状态对转化
效果影响是比较大的。因此，在进行愈伤组织继代
培养时，除了改变培养方法外，通过调整继代培养基
中植物激素的浓度和配比(使用 2 mg／L 2，4一D和
0．1 mg／L KT)，发现愈伤组织的生长状态得到明显
改善，愈伤组织变得更加干爽、颗粒性好，略呈淡黄
色，转化后褐化率有了很大的降低。
在整个转化过程中农杆菌与外植体共培养是非
常重要的环节，因为农杆菌的附着、T—DNA的转移
及整合都在共培养时期内完成，因此，除了共培养时
间外，共培养方法对转化率也有较大影响。在本研
究中，发现在共培养前后愈伤组织的适当干燥是遗
传转化操作中的一个关键环节，因为农杆菌在愈伤
组织表面的适当生长是遗传转化所必需的，但又要
抑制其过度生长，以免引起愈伤组织的活性降低甚
至死亡，同时还要保证共培养后的除菌效果。如何
把握干燥的程度还是一个问题。太干会使愈伤组织
本身生理状态降低，太湿又为农杆菌提供生长环境。
另外，尽管对是否在共培养基上加无菌滤纸还有争
论，但在本研究中我们发现在共培养基上加一张无
菌滤纸，有利于控制愈伤组织上农杆菌过度增殖。
在愈伤组织与农杆菌共培养后，为了提高脱菌
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908 广 西 植 物 27卷
效果，李东栋等(2002)用无菌水将愈伤组织轻轻漂
洗数次，直至洗液变清为止，然后再加入含有 400
mg／L头孢霉素的无菌水浸泡20 min。我们也采用
过这一方法，尽管脱菌效果不错，但一直没有获得转
化愈伤组织，可能是跟所用的愈伤组织的质地有关。
对于一些结构稍微疏松的愈伤组织，经过多次洗涤
后，其表面上生长活跃而易受侵染的细胞已被洗掉，
剩下的只是一些结构致密而没被侵染的愈伤组织。
因此，后来我们改用共培养后将愈伤组织置于无菌
滤纸上适当干燥就直接转到脱菌培养基上培养。
通过研究，我们初步建立了一套根癌农杆菌介
导的玫瑰茄愈伤组织遗传转化体系。该体系的操作
程序如下：①挑选颜色新鲜、生长旺盛的颗粒状愈伤
组织在继代培养基上培养 8～10 d，置培养皿上适当
干燥后；②浸泡在 OD ∞约为 0．55的根癌农杆菌
LBA4404的菌液(内含 100t~mol／L AS，PH5．6)中
10 min，取出，用无菌滤纸吸干菌液；③置含 100
t~mol／L AS的共培养基上，于黑暗条件下 25℃共
培养 3 d；④转移到附加 300 mg／L Kan和 300 mg／
L Cefo的愈伤组织继代培养基上，于 25℃选择培
养，2～3周继代一次；⑤取适量抗性愈伤组织接入
悬浮培养基中，25℃，100 r／rain培养2～3周后，继
代培养获得抗性细胞 系；⑥用组织化学法或／和
PCR扩增法鉴定转化愈伤组织和细胞系。
利用上述转化体系，我们成功地将外源基因导
入玫瑰茄细胞，获得稳定表达 GUS活性的转化愈
伤组织和稳定表达 NPT I活性的转化细胞系。抗
性愈伤组织生成率达 8 ，其中 GUS活性阳性率为
5O ，总转化率为 4 。相对于用玫瑰茄下胚轴作
受体材料的转化系统(谢秀祯等，2006)来说，这一转
化率是比较低的，但由于得到的抗性愈伤组织嵌合
体较少，而且由转化愈伤组织获得悬浮培养细胞系
所需时间较短，因此这一转化方法不失为玫瑰茄品
种改良和细胞株选育的一条可供选择的途径。
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