免费文献传递   相关文献

A genetic transformation of roselle callus mediated by Agrobacterium tumefaciens

根癌农杆菌介导的玫瑰茄愈伤组织的遗传转化



全 文 :广 西 植 物 Guihaia 27(6):903— 908 2007年 11月
根癌农杆菌介导的玫瑰茄愈伤
组织的遗传转化
谢秀祯1,林俏慧2,郭 勇2
(1.海南师范大学 生物系 ,海口 571158;2.Department of Biochemistry,Biophysics and Molecular Biology,
Iowa State University,Iowa 50011,美国;3.华南理工大学 生物科学与工程学院 ,广州 510640)
摘 要:以根癌农杆菌 LBA4404和 EHA105为供体菌株,对玫瑰茄愈伤组织进行了转化条件的研究,建立了
一 套玫瑰茄愈伤组织遗传转化体系。利用该转化体系获得了2个稳定表达新霉素磷酸转移酶活性的玫瑰茄
转化细胞系。GUS活性组织化学检测和 PCR扩增鉴定的结果表明,愈伤组织的转化率为 4 0A。说明采用农
杆菌介导法将外源基因经愈伤组织导人玫瑰茄细胞是可行的。
关键词:玫瑰茄愈伤组织;根癌农杆菌;遗传转化;p一葡萄糖苷酸酶;新霉素磷酸转移酶Ⅱ
中图分类号 :Q812,Q943 文献标识码:A 文章编号:1000-3142(2007)06-0903-06
A genetic transformation of roselle callus mediated
by Agrobacterium tumefaciens
XIE Xiu-Zhen1,LIN Qiao-Hui2,GUO Yong2
(1.Department of Biology,Hainan Normal University,Halkou 571158,China;2.Department of Biochemistry,
Biophysics and Molecular Biology,Iowa State University,Iowa 50011,USA;3.Colege of Bioscience and
Biotechnology,South China University of Technology,Guangzhou 510640,China)
Abstract:In present paper,the basic conditions for the genetic transformation of Roselle calus were investigated by u—
sing Agrobacterium turnefaciens LBA4404 and EHA105,harboring pBI121,as donor strains and a genetic transfor—
mation system of Roselle calus was initiatively established,by which two transgenic Rosele cel lines expressed stab—
ly NPT]I activity were obtained.The results of GUS histochemical assays and PCR amplification demonstrated that
the overal1 transformation rate of Rosele calus was 4 0A.It iS feasible to use Agrobacterium-mediated method to in—
troduce exogenous gene into Roselle cels via calus.
Key words:Roselle calus;Agrobacterium tumefaciens;genetic transformation p-g1ucurol1idase;Neomycin phosph—
otransferase I
玫瑰茄(Hibiscus sabdariffa)是锦葵科木槿属
一 年生草本植物,原产非洲苏丹,广布于世界各热
带、亚热带地区。玫瑰茄是一种具有多种经济用途
的作物 ,我国西南、华南和华东地区均有栽培。玫瑰
茄花萼所含的花青苷色素是一种天然红色食用色
素,在国内外已应用于食品及饮料工业(李玉萍,
2003);玫瑰茄细胞产生的花青苷,具有抗氧化、抗突
变作用(Pi—Jen等,2002),在临床上已用于治疗高血
压、心脏病、发烧、发炎、肝脏机能障碍和免疫系统紊
乱等疾病(Dafalah等,1996;Haji等,1999)。另据
报道,玫瑰茄的提取物具有抗肿瘤、抗白血病和抑制
由胆固醇引起 的动脉粥样硬化的效果 (Chen等,
收稿日期:2006—09—25 修回日期 :2007—02—08
基金项 目 广东省重点科技攻关项 目(A301020201)fSupported by Key Technologies Research and Development Program of Guangdong Pmv/nce
(A301020201)]
作者简介:谢秀祯(1960一),男,海南儋卅I市人,博士,教授,主要从事基因工程的研究,E-mail:xiexiuzhen@sina.com。
通讯作者(Author for correspondence,E—mail:btyguo@SCUt.edu.cn)
维普资讯 http://www.cqvip.com
9O4 广 西 植 物 27卷
2003)。最近几年,Chang等(2005)及 Lin等(2005)
通过研究初步揭示了玫瑰茄提取物诱导人前髓白血
病细胞、胃癌细胞发生细胞凋亡的机理,从而为将玫
瑰茄提取物开发成肿瘤预防和治疗药物奠定了理论
基础。
自2O世纪 9O年代以来,国内外学者对利用玫
瑰茄细胞培养技术生产花青苷进行了广泛的研究,
并取得了可喜 的成果 (阮茜等,1999;朱新贵等,
1998;郑穗平等,1998),但从 目前的研究结果来看,
生产周期长(约 16 d)已经成为制约这一技术走向产
业化的瓶颈之一。因此,如何获得快速增殖的玫瑰
茄细胞系已成为一个急需研究的课题。一条可供选
择的技术路线就是通过植物基因工程技术将诸如拟
南芥 Phytosulfokine—a的基因(Yang等,2000;林俏
慧等,2005)导入玫瑰茄细胞,以期获得快速增殖的
细胞系,在此基础上筛选花青苷高产细胞株。本文
作者曾报道了利用根癌农杆菌对玫瑰茄无菌苗的子
叶和下胚轴进行遗传转化的技术条件(谢秀祯等,
2006),但通过农杆菌介导转化玫瑰茄转愈伤组织以
获得转基因细胞系的条件和技术方案至今尚未见报
道。玫瑰茄遗传转化技术的研究将为该作物的遗传
育种,特别是利用代谢工程培育花青苷高产新品系
及提早开花的新品种创造条件。
1 材料与方法
1.1材 料
(1)植物材料:玫瑰茄(Hibiscus sabdarifa L.)种子
来源于华南植物园引种部,消毒后播于不加激素的
B5固体培养基(附加 3 蔗糖)上,于25±1℃培养
箱中萌发,取 1O~12 d龄幼苗为实验材料。(2)农
杆菌菌株和质粒:根癌农杆菌菌株为 LBA4404
(str )和 EHA105(Cm ),均 含 植 物表 达 载 体
pBI121,该载体携带有gus基因和npt一1I基因,抗性
标记为 Kan。(3)酶和试剂:TaqDNA聚合酶购 自
大连宝生物公司;PCR引物由上海 Bioasia生物技
术有限公司合成;卡那霉素(Km,Sigma公司)、硫酸
链霉素 (Str,Amresco公 司)、乙酰丁香酮 (AS,
Aldrich公司)、X—Gluc(Genview公 司)购 自北京鼎
国生物技术有限责任公司;头孢霉素(Cefo)、氯霉素
(Cm)及其他试剂为国产或进口分装分析纯。(4)培
养基:愈伤组织诱导培养基成分为 B 培养基附加 l
mg/L 2,4一D、0.1 mg/L KT和 3 蔗糖,pH5.8。
侵染液为Bs培养基附加 3 蔗糖,pH5.8。预培养
基、共培养基和愈伤组织继代培养基成分相同,其组
成为 B5培养基附加 2 mg/L 2,4一D、0.1 mg/L KT
和 3 蔗糖,pH5.8。细胞悬浮培养基组成为B。培
养基附加 1 mg/L 2,4一D,0.1 mg/L KT和 2 蔗
糖,pH5.8。
1.2方法
1.2.1农杆菌感受态细胞的制备 以及质粒在不同农
杆菌菌株上的加载 按王关林等(2002)的方法进行
操作,获得的单菌落按王关林等(2002)提取质粒进
行验证 。
1.2.2农杆菌的活化 农杆菌在含有 50 mg/L Kan
和25 mg/L Str或 34 mg/L Cm 的 YEP选择培养
基上戈Ⅱ线暗培养(28℃)。长出菌落后挑取单菌落
在新的选择培养基上涂皿,取适量培养 48 h后的菌
体悬浮 于侵染液 中,可 同时加入终浓度为 100
tzmol/L的 AS,27~28℃,180 r/min培养 30 min
后用侵染液调整 OD ∞至合适数值即可用于浸染。
1.2.3玫瑰茄愈伤组织的获得及其预处理 取 10---
12 d龄的玫瑰茄无菌苗的下胚轴,切成 0.8~1 cm
长的切段,置愈伤组织诱导培养基上,25℃,光照培
养(强度为25.2/~mol·In-。·s~,光周期为 16/8 h
· d- )。待长出愈伤组织后,再将其切下并转移到
愈伤组织继代培养基上培养,2~3周继代 1次。作
为比较,当继代 4~5次后,取部分愈伤组织进行悬
浮培养 2代,收集细胞和细胞团转移到固体培养基
上培养并每隔2~3周继代 1次,获得愈伤组织。从
经继代培养的玫瑰茄愈伤组织中,挑选颜色新鲜、生
长旺盛的颗粒状愈伤组织在培养皿上适当干燥后 ,
即可用于浸染。
1.2.4农杆菌侵染及共培养 用于转化的愈伤组织
在农杆菌悬浮液中浸泡一定时间后,取出铺在放有
无菌滤纸的培养皿上吸干菌液,再转移到含有 100
tzmol/L AS的共培养基上(培养基表面铺一张无菌
滤纸),适当风干后,于 25℃黑暗培养2~3 d。
1.2.5抗性愈伤组织的筛选 将共培养后的愈伤组
织取出放在有3层无菌滤纸的培养皿中干燥 2~3
d,再转移到含适当浓度 Kan和 300 mg/L Cefo的
愈伤组织继代培养基上选择培养。培养条件为 25
℃,光照强度为 25.2/~mol·In-。·s~,光周期为 16/
8 h·d- ,2~3周继代 1次。
1.2.6抗性细胞系的获得 将经2次继代培养的适
量愈伤组织转移到含有 100 mg/L Kan和 300 mg/
维普资讯 http://www.cqvip.com
6期 谢秀祯等:根癌农杆菌介导的玫瑰茄愈伤组织的遗传转化 905
L Cefo的悬浮培养基 中,25℃,100 r/rain,微光照
培养,2~3周继代 1次。最后一次继代时,培养基
中不加 Kan,培养到第 8天时取一定细胞 密度 的培
养物作平板培养,用于检测转化细胞 Kan抗性的遗
传稳定性。
1.2.7 GUS活性 的检 测 采 用组 织化 学法检测 。
将经检测确认无菌的抗性愈伤组织切成小块,取一
块加入 50 L X—Gluc反应液中,37℃保温 12 h,观
察蓝色反应。
1.2.8转化材料 的 PCR检 测 从转化材料 中提取
植物总 DNA进行 PCR扩增鉴定 。DNA粗提液微
量制备按王关林(2002)的方法进行。以转化材料的
DNA为模板,未转化材料的DNA作阴性对照。用
CaMV 35S启动 子 引物 5,_ATGACGCACAATC-
CCACTATCCTTC(、r3 和 Nos终 止 子 引 物 5 一
GATAATCATCGCAAGACCGGCAACAG一3 对
gus基因进行 PCR扩增,扩增条件为:94℃ 4 rain
预变性后,加入 2.5 U Taq DNA聚合酶,94℃ 1
rain,58℃ 1 min,72℃ 1 rain,30个循环 ,最后 72
℃延伸 10 min。预期扩增片段大小为2 063 bp。另
外 ,用 nptⅡ基 因的两 个 引 物 5,_GACTGGGCA-
CAACAGACAATCGG一3 和 5 一AGCAATAT—
CACGGGTAGCCAACG一3 对 转 化 细 胞 系 的 总
DNA进行 PCR扩增,扩增条件为:94℃ 4 rain预
变性后,加入2.5 U Taq DNA聚合酶,94℃ 1 rain,
60℃ 1 rain,72℃ 1 rain,30个循环 ,最后 72℃延
伸 10 min。预期扩增片段大小为 621 bp。
2 结果与分祆
2.1培养方法对愈伤组织生长的影响
为了获得理想的愈伤组织用于转化,本试验比
较了两种不同的培养方法对玫瑰茄愈伤组织生长状
况的影响。结果表明,从玫瑰茄无菌苗下胚轴诱导
获得的愈伤组织,如果一直在固体愈伤组织继代培
养基上培养,经 20次继代后所得到的愈伤组织结构
较紧密,有的质地较硬,有的表面湿润呈水浸状,生
长较差,不适于用作转化材料;而中间经过 2代悬浮
培养后再进行继代培养得到的愈伤组织结构较疏
松,呈颗粒状,红黄间色,表面较干爽,生长良好。因
此,本试验使用后者作为转化材料。另外,通过观察
发现,愈伤组织继代培养后第 8~10天,生长最快,
适于转化 。
2.2卡那霉素选择压的确定
玫瑰茄愈伤组织对抗生素敏感性的测定结果
(图1)表明,Km对玫瑰茄愈伤组织的增殖有抑制作
用。随着培养基中Kan浓度的提高,它对愈伤组织
生长的抑制作用也随着增大。当Kan浓度达到 300
mg/L时,愈伤组织的生长完全被抑制。因此,本研
究选用 300 rag/L Kan作为转化愈伤组织的选择压。
1OO
8O
I}田}I
6O
4O
啦; 2O
O
O 1OO 200 300
Km浓度/mg.L
图 1 Kan浓度对玫瑰茄愈伤组织生长的抑制作用
Fig.1 Inhibition of Kan concentration
on the growth of Roselle callus






‘f)
LBA4404 EHA1 05
根癌农杆菌菌株
图 2 AS和农杆菌菌株对愈伤组织转化的影响
Fig.2 Effects of AS and different A.tumefaciens
strains on genetic transformation of Roselle callus
TER:瞬时表达率 Transient expression rate
2.3农杆菌菌株和 AS对转化的影响
在本试验中,采用两种常用的、遗传背景不同的
农杆菌菌株(LBA4404和 EHA105)对玫瑰茄愈伤
组织进行转化(两菌株的菌液浓度、侵染时间均为
OD 。:0.5和 10 rain),并比较添加(添加量为 100
/*mol/L)和不添加乙酰丁香酮(AS)对转化效果的
影响。经过 3 d共培养后,统计 GUS组织化学反应
呈阳性的愈伤组织所 占的比例,结果见图 2。从图
中可以看到,两种菌株对玫瑰茄愈伤组织的侵染能
力存在 较大 的 差异,无 论是 否添 加 AS,菌株
LBA4404的侵染能力都明显强于菌株 EHA105。
维普资讯 http://www.cqvip.com
9O6 广 西 植 物 27卷
另外,在菌株 LBA4404菌悬液和共培养基中加人
AS后,受体材料 gus基因的瞬时表达率提高了
1.38倍,这说明使用愈伤组织作为转化的受体材料
时,由于缺少作为信号分子的酚类物质,外源 AS等
信号物质的添加能更有效地促进 T-DNA向植物细
胞转 移。但值 得 注 意 的是,加 入 AS对 菌 株
EHA105的侵染能力没有明显的提 高,这可能跟玫
瑰茄愈伤组织对这一菌株不太敏感有关。有鉴于
此,本试验选用菌株 LBA4404并在菌悬液和共培养
基中添加 100~mol/L乙酰丁香酮对玫瑰茄愈伤组
织进行转化。
2.4 pH值对AS作用效果的影响
在本试验中,当在农杆菌LBA4404的侵染液和
共培养基中都添加 AS时,pH值对 GUS基因的瞬
时表达率有很大的影响,pH为 5.6时表达率最高,
pH高于或低于 5.6转化率都明显下降,当 pH为
6.0时,转化率几乎为零(图 3)。因此,添加 AS的
侵染液和共培养基,必须严格控制其 pH值,以 5.6
为最佳。
图 3 pH值对AS诱导玫瑰茄愈伤组织转化的影响
Fig.3 Effects of pH value on genetic transformation of
Roselle callus induced with 100/~mol/L AS
2.5农杆菌菌液浓度对转化率的影响
分别用 5种不同菌液浓度的农杆菌 LBA4404
侵染玫瑰茄愈伤组织 10 rain,然后分别测定 gus基
因的瞬时表达率,结果 (图 4)表 明,菌液浓度在
OD 。小于 0.73时,随着菌液浓度的提高,gus基因
的瞬时表达率也随着增加,并在 ODs。0.73左右达
到最高值(70.6 9/6)。菌液 OD 。超过 0.73后,不仅
gus基因的瞬时表达率有所降低,而且愈伤组织的
褐化死亡加剧。尽管在 OD 。。为 0.73时,gus基因
的瞬时表达率最高,但愈伤组织的褐化死亡率也较
高。因此,综合考虑,用 OD 。为 0.55左右的菌液
侵染 10 rain进行玫瑰茄愈伤组织的转化。






3
0 0 0.2 0.4 0 6 0.8 1.0 1.2
农杆菌菌液浓度 (OD 600)
图 4 菌液浓度对愈伤组织遗传转化的影响
Fig.4 Effects of A.tumefaciens concentration on the
genetic transformation of Roselle callus
2.6共培养时间对转化率的影响
用 OD6。约为 0.55的农杆菌 LBA4404菌液侵
染玫瑰茄愈伤组织 10 min,在不同的共培养时间取
样进行 GUS染色鉴定,统计 GUS基因瞬时表达率
和愈伤组织褐化率,结果如图4所示。由图可见,开
始时,随着共培养时间的延长,愈伤组织的 GUS基
因瞬时表达率也随着提高,3 d时达到最高值,此后
GUS基因瞬时表达率有所下降,同时愈伤组织的褐
化率急剧增大,到6 d时褐化率达到 38 。因此,在
本实验中,共培养时间选择 3 d为宜。
60
褂 50
40
鉴 、30

醐 20
矗 1 0
0




图 5 共培养时间对愈伤组织遗传转化的影响
Fig.5 Effects of CO—cultivation time on genetic
transformation of Roselle calus
2.7抗性愈伤组织的检测和鉴定
从本试验获得的 Kan抗性愈伤组织中随机挑
取 8块,用组织化学法测定细胞 GUS表达活性,其
中4块得到阳性结果,而阴性对照无蓝色反应。进
一 步用 CaMV 35S启动子和 Nos终止子特异性引
物对有GUS活性的愈伤组织总 DNA进行 PCR扩
增,均得到预期分子量约 2 060 bp的条带,与质粒
DNA扩增出的条带大小相同,而未转化的愈伤组织
,6\斛 描
∞ 的 们 ∞ 加 0
∞ ∞ ∞ 们 ∞ 加 0
∞ ∞ ∞ 0
,6\斟 苗蓝匝硝S丌
维普资讯 http://www.cqvip.com
6期 谢秀祯等:根癌农杆菌介导的玫瑰茄愈伤组织的遗传转化 907
的DNA中未扩增出相应的条带(图 6)。这表明通
过愈伤组织一农杆菌共培养法已将外源 gus基因导
入了玫瑰茄细胞并获得表达,愈伤组织总转化率为
4 。
bp
5000
M 1 2 3 4 5 6
图 6 转化愈伤组织的 PCR扩增结果
Fig.6 PCR amplification result of transgenic calli
M.DNA Marker;1.阳性对照 Positive control;2.阴性对照
Negative control;3-6.转化愈伤组织 Transgenic cali。
2.8抗性细胞系的获得及其检测
抗性愈伤组织经过原代和继代悬浮选择培养后
得到的抗性细胞系,再经无选择压力下继代培养 2
次,培养物在含 Kan和不含 Kan的平板中培养,其
植板率没有明显差别,进一步用 npt 1I基因特异引
物进行 PCR扩 增 ,均得 到 预期 扩增 片段 ,大 小 约
620 bp(表 1和图 7)。说明转化细胞系的 NPT 1活
性能稳定表达和遗传。
表 1 Kan抗性细胞 系的遗传稳定性检测
Table 1 Detection of genetic stability of
Kan resistant cell lines
3 讨论
利用基因工程技术将外源基因导入植物细胞是
现代遗传育种的重要途径。目的基因转化并整合到
受体植物细胞基因组中是植物基因工程地主要环
节。根癌农杆菌 Ti基因转化系统是目前研究最多、
理论机理最清楚、技术方法最成熟的基因转化途径。
但相对而言,这条途径的影响因素也是最多的,其中
关键的是用于转化的农杆菌菌株、目标植物受侵染
的部位和共转化的方法。
农杆菌作为植物遗传转化的工具,其属性对转
化的成功有决定性的影响。有研究表明(Kazuhito
等,1992),不同植物对农杆菌侵染的敏感性不同,而
同一种植物对不同的农杆菌菌株也具有不同的敏感
性。在本研究中,普通株 LBA4404的转化率明显高
于超毒株 EHA105,这可能与植物细胞的内源激素
及细胞壁的结构等有关。
bp
2000
1000
750
500
250
100
M 1 2 3 4
图 7 转化细胞系的PCR扩增结果
Fig.7 PCR amplification result of transgenic cell lines
M.DNA Marker;1.阳性对照Positive control;2.阴性对照
Negative control;3-4.转化细胞系Transgenic cel lines
在本研究中,还发现玫瑰茄的生理状态对转化
效果影响是比较大的。因此,在进行愈伤组织继代
培养时,除了改变培养方法外,通过调整继代培养基
中植物激素的浓度和配比(使用 2 mg/L 2,4一D和
0.1 mg/L KT),发现愈伤组织的生长状态得到明显
改善,愈伤组织变得更加干爽、颗粒性好,略呈淡黄
色,转化后褐化率有了很大的降低。
在整个转化过程中农杆菌与外植体共培养是非
常重要的环节,因为农杆菌的附着、T—DNA的转移
及整合都在共培养时期内完成,因此,除了共培养时
间外,共培养方法对转化率也有较大影响。在本研
究中,发现在共培养前后愈伤组织的适当干燥是遗
传转化操作中的一个关键环节,因为农杆菌在愈伤
组织表面的适当生长是遗传转化所必需的,但又要
抑制其过度生长,以免引起愈伤组织的活性降低甚
至死亡,同时还要保证共培养后的除菌效果。如何
把握干燥的程度还是一个问题。太干会使愈伤组织
本身生理状态降低,太湿又为农杆菌提供生长环境。
另外,尽管对是否在共培养基上加无菌滤纸还有争
论,但在本研究中我们发现在共培养基上加一张无
菌滤纸,有利于控制愈伤组织上农杆菌过度增殖。
在愈伤组织与农杆菌共培养后,为了提高脱菌
维普资讯 http://www.cqvip.com
908 广 西 植 物 27卷
效果,李东栋等(2002)用无菌水将愈伤组织轻轻漂
洗数次,直至洗液变清为止,然后再加入含有 400
mg/L头孢霉素的无菌水浸泡20 min。我们也采用
过这一方法,尽管脱菌效果不错,但一直没有获得转
化愈伤组织,可能是跟所用的愈伤组织的质地有关。
对于一些结构稍微疏松的愈伤组织,经过多次洗涤
后,其表面上生长活跃而易受侵染的细胞已被洗掉,
剩下的只是一些结构致密而没被侵染的愈伤组织。
因此,后来我们改用共培养后将愈伤组织置于无菌
滤纸上适当干燥就直接转到脱菌培养基上培养。
通过研究,我们初步建立了一套根癌农杆菌介
导的玫瑰茄愈伤组织遗传转化体系。该体系的操作
程序如下:①挑选颜色新鲜、生长旺盛的颗粒状愈伤
组织在继代培养基上培养 8~10 d,置培养皿上适当
干燥后;②浸泡在 OD ∞约为 0.55的根癌农杆菌
LBA4404的菌液(内含 100t~mol/L AS,PH5.6)中
10 min,取出,用无菌滤纸吸干菌液;③置含 100
t~mol/L AS的共培养基上,于黑暗条件下 25℃共
培养 3 d;④转移到附加 300 mg/L Kan和 300 mg/
L Cefo的愈伤组织继代培养基上,于 25℃选择培
养,2~3周继代一次;⑤取适量抗性愈伤组织接入
悬浮培养基中,25℃,100 r/rain培养2~3周后,继
代培养获得抗性细胞 系;⑥用组织化学法或/和
PCR扩增法鉴定转化愈伤组织和细胞系。
利用上述转化体系,我们成功地将外源基因导
入玫瑰茄细胞,获得稳定表达 GUS活性的转化愈
伤组织和稳定表达 NPT I活性的转化细胞系。抗
性愈伤组织生成率达 8 ,其中 GUS活性阳性率为
5O ,总转化率为 4 。相对于用玫瑰茄下胚轴作
受体材料的转化系统(谢秀祯等,2006)来说,这一转
化率是比较低的,但由于得到的抗性愈伤组织嵌合
体较少,而且由转化愈伤组织获得悬浮培养细胞系
所需时间较短,因此这一转化方法不失为玫瑰茄品
种改良和细胞株选育的一条可供选择的途径。
参考文献:
王关林,方宏筠.2002.植物基因工程[M].北京:科学出版社
的:739~740;776—777;742
Chang Y C,Huang H P,Hsu J D,eta1.2005.Hibiscus anthocya—
nins rich extract-induced apoptotic cell death in human promyelo—
cytic leukemia cels[J].Toxicology and Applied Pharmacolo—
gY,205:2O1— 212
Chen C C,Hsu J D,Wang S F,el a1.2003.Hibiscus 8ab&【rifa
extract inhibits the development of atherosclerosis in cholesterol-
fed rabbits[J].J Agric Food Chem,51:472—477
Dafal1ah A A,al-Mustafa Z. 1996.Investigation of the anti-in—
flammatory activity of Acacia nilotica and Hibiscus sabdariffa
[J].AmJ Chin Meal,24:263~269
Haji FM,Haji TA.1999.The eff~t of sour tea(Hibiscus sabdar—
iffa)on essential hypertension[J].J Ethnopharmacal,65:231~
236
Kazuhito A,Hideaki S,Shozo O,eta1.1992.Efficient transforma—
tion of Arabidopsis thaliana:eomparison of the efidencies with
variOHS organs,plant ecotypes and Agrobacterum strains[J].
PlantCell Rep,12:7~ l1
Li DD(李东栋),Shi w(石玮),Deng XX(邓秀新),et a1.2002.
Influence of different strai13s on Agrobacterium-mediated calus
transformation efficiency in Citrus(不同根癌农杆菌菌株对柑
橘愈伤组织遗传转化效率的影响)[J].J Huazhong Agric
Univ(华中农业大学学报),21(4):379—381
Lin H H,Huang H P,Huang C C,et a1.2005.Hibiscus polyphe-
nol-rich extract induces apoptosis in human gastric carcinoma
cels via p53 phosphorylation and p38 MAPK/FasL cascade
pathway[J].Molecular Carcinogo~esis,43(2):86—99
Lin QH(林俏慧),Xie XZ(谢秀祯),Guo Y(郭勇).2005.Study
on the amplification and sequencing of AtPSK3 from Arabidop—
sis(拟南芥 A~SK3基因的克隆及序列分析)[J].Cruihaia(广
西植物),25(7):349—352
Li YP(李玉萍).2003.Hibiscus sabdari 凡 and its utilizations
(玫瑰茄及其利用)[J].Tropical Agriculture Information in
the World(世界热带农业信息),(11):24—26
Pi-Jen Tsaia,John Mclntoshb,Philip Pearceb,et a1.2002.Antho—
cyanin and antioxidant capacity in rosele(HiSses Sabdariffa)
extract[J].Food Research International,35:351—356
Ruan Q(阮茜),Guo Y(郭勇).1999.Dynamics on the growth of
Hibiscus sabdariffa cel and the formation of anthocyanin in
phosphorus-limted culture(磷限制培养中玫瑰茄细胞生 长及
花青苷形成动力学)[J].J South China Univ Tech(Nat Sci
Edi)(华南理工大学学报(自然科学版)),27(1):86-90
XieXZ(谢秀祯),Lin QH(林俏慧),Guo CS(郭成栓),et a1.
2006. Genetic transformation of rosele cell mediated by
Agrobacteriumtumefaciens(根癌农杆菌介导的玫瑰茄细胞遗
传转化)[J].J South China Univ Tech(Nat Sci Edi)(华南理
工大学学报(自然科学版)),34(5):43—47
Yang H,Matsubayashi Y,Hanai H,et a1.2000.Phytosulfokine-
a。a peptide growt h factor found in higher plants:its structure,
functions,precursor and receptors[J].Plant Cell Physiol,41
(7):825—830
Zheng SP(5~穗平),Guo Y(郭勇).1998.Effects of staple nutri—
ent on cel growt h and anthocyanin production in suspension cul-
ture of Hibscus sabdariffa(主要营养成分对悬 浮培养玫瑰茄
细胞生长和花青素合成的影响)[J].Guihaia(广西植物),18
(1):70~74
Zhu XG(朱新贵),Guo Y(郭勇).1998.Monochromic efects on
anthocyanin synthesis in rosele(Hibiscus sabdariffa)(单色光
对玫瑰茄悬浮细胞合成花青索的影响)[J].Guihaia(广西植
物),18(4):322—324
维普资讯 http://www.cqvip.com