全 文 ：广西植物Guihaia32(6)：822—827 2012年11月
DOI：10．3969／j．issn．1000一3142．2012．06．020
莲瓣兰DALP遗传多样性研究
贾 琳1，史云东1*，虞泓2，骆 扬2，李永谊2
(1．玉溪师范学院资源与环境学院，云南玉溪653100；2．云南大学生命科学学院生态遗传学实验室，昆明650091)
摘 要：采用DALP(Directamplificationofle gthpolymorphism)检测莲瓣兰5个居群的遗传结构。5个引
物组合共检测到103个多态位点。和其它具有相似生活史(多年生草本、以动物为媒介的杂交、种子随风散
布)的物种相比，莲瓣兰原变种水平(PPB一88．18％，A一1．8818，AP一1．4880，H—o．2911，卜=o．4412)和物
种水平(PPB一93．64％，A一1．9364，AP一1．5262，H—o．3129，J—o．4732)均具有较高的遗传多样性；各居群
问(G。一o．3292)存在较大的遗传分化。基因流的估计值(N。一1．0186)表明莲瓣兰物种水平上各居群间每代
有1．0186个移居个体。地理隔离和选择压力可能是造成莲瓣兰居群间基因流动受到限制的原因。在这些研
究的基础上，探讨了野生莲瓣兰资源的保护问题。
关键词：莲瓣兰；DALP；遗传多样性；遗传分化；保护
中图分类号：Q948文献标识码：A 文章编号：1000—3142(2012)06一0822一06
JIALinl，SHIYun-Don91*，YUHon92，LUOYang2，LIYong-Yi2
(1IG。￡￡曙eD，Nn￡M化R∞o“rc酷口ndE咒谢r0砚仇绷￡，M“iNor脚z踟i郴i砂，Yu】【i653100，CKna；2．k60m￡o叫o，
Eco￡ogic丑￡G删盯如，C0纨gPo厂Li扣&i研卯s，h以彻九‰izE坩赴y，Kunr血增650091，china)
Abstract：DALPwasappliedtoevaluategeneticvariationandstructureof5populationsofC3舯26idi。mz￡onisPpnf“m．
Theresultswereasfollows：103DALPpolymorphiclociweredetectedinfourpopulationsusi g5randomprimers．
Cbmparedwithotherlonglivedherbaceousperenmals，njmalpollinatedoutcrossingpeciesandwinddispersal
seeds，thetotalgeneticd versityofC．￡o仃i卵夕盘Z“mwasrelativelyh遮hbothatthesubspecies(PPB一88．18％，A—
1．8818，AP一1．4880，H一0．2911，J—O．4412)andspecieslevels(PPB一93．64％，A一1．9364，AP一1．5262，H—
O．3129，j—O．4732)；andtherew smuchgeneticd fferentiationamongp pulation(G口一O．3292)．Anindirectesti—
mateofthenumberofmigrantspergeneration(Nm一1．0186)suggestedabout1．0186migrantsineverygeneration．
Theisolationfromparentpopulationandtheselectivepressuremightbe hecausesleadingtotherestrictionofge e
flow．Basedontheser sults，theconservationstrategiesofthisspeciesw red veloped．
Keywords：(汐m6趔i“研￡o疗is已夕nZ“Ⅲ；DALP；geneticvariation；geneticdifferentiation；conservation
莲瓣兰(Cy研6idi“研￡o儿i5Pp以z“m)，又名菅草
兰，是兰科(()rchidaceae)兰属(Cym6idi“m)下一个
独试的种，其包括原变种莲瓣兰和变种春剑(C．for—
fisPp“z“mvar．zo行gi6，．nffP口￡“m)。莲瓣兰分布范围
狭窄，仅在中国台湾、云南西北部、四川西南部有分
布。在云南主要分布于金沙江、澜沧江、怒江三江流
域，98。～101。E，24。～28．4。N(刘仲健等，2006；陈
心启等，2011)。莲瓣兰形态变化多样，奇花和线艺
品种有较高的观赏价值和经济价值，使之成为云南
最具代表性的兰花种类之一。
收稿日期：20120319 修回日期：2012一08-26
基金项目：厶|{!『大。7：竹级牛物技术人才培养基地项目；云南大学植物学博士点基金[supportedbytheBaseProjectofBiotechnologylentsofYunmn
universily；theFundofl如tanyDoctoralsubjectofYuImanuniversity]
作者简介：贤琳(1980)，女，云南K溪人，博士研究生，讲师，主要从事植物生态遗传学的研究，(Email)jl@yxnu．net。
通讯作者(～儿horforcorrespondence，E-mail：sydon92011@126．com)
万方数据
6期 贾琳等：莲瓣兰DALP遗传多样性研究 823
目前莲瓣兰研究主要集中于分类地位的探究
(Liu等，2009；陈心启等，2011)、人工驯化栽培、种
问杂交育种(李海峰等，2009，2012)、种子萌发特性
(庞惠仙等，2010)及野生资源的保护利用(维饶箐
等，2008)。作为一种形态变化丰富的观赏植物(陈
于敏等，2005)，从分子水平对其居群遗传多样性进
行研究还鲜有报到。直接扩增片段长度多态性(Di—
rectamplificationof le gthpolymorphisms，
DALP)是1998年由法国科学家E．Desmarais，I．
Lanneluc和J．Lagnel发展起来的一种检测DNA
多态性的新方法。该方法采用双引物对未知序列的
基因组DNA进行扩增，选择性引物采用M13测序
引物核心序列(一40USP)，并在37端加上2～4个选
择性碱基，反向引物采用M13反向测序引物，每对
引物组合都能产生一个特殊的多带的图谱(Desma—
rais等，1998)。研究表明，DALP适用于快速筛选
遗传多态性和等位位点变异。该技术与RFLP、
RAPD相比，具有在一次实验中同时检测出大量扩
增片段的优点；与AFLP相比，DALP具有操作简
单、扩增片段可直接测序的优点。本研究选取5个
莲瓣兰居群，采用DALP技术对其遗传多样性进行
研究，并结合已有繁育系统研究结果，共同分析莲瓣
兰居群的遗传结构，为制定合理的保护策略提供遗
传背景资料。
表1材料来源与生境
Table1 Habitatsand10cationofmaterials
选择性引物Selectiveprimer
反向引物Reverseprimer
DALP221(P1)
DALP231(P2)
DALP233(P3)
DALP235(P4)
DALP244(P5)
DALPRl(Pr)
GTTTTCCCAGTCACGACGC
GTTTTCCCAGTCACGACAGC
GTTTTCCCAGTCACGACACG
GTTTTCCCAGTCACGACCAC
GTTTTCCCAGTCACGACCTGA
5’一TTTCACACAGGAAACAGCTATGAC一3
1 材料与方法
1．1研究材料
实验材料来自云南沁兰园艺公司引种基地(表
1)。每一个实生植株，剪取一片新鲜幼嫩叶片，放置
于干净的纸袋中，保存于4℃待用。材料来源见表1。
1．2方法
1．2．1总DNA提取本文采用改良后的CTAB法
(DolyeJJ&D01yeJL，1987)提取基因组DNA，每
株选取o．3～o．5g新鲜叶片。总DNA用含o．5
“g／mL溴化乙锭(EthidiumBromide，EB)的1％的
琼脂糖凝胶(agarosegel)电泳检测，用20、40、60、
100ng的入DNA作为标定标准。模板DNA工作浓
度平衡为20ng／肚L。
1．2．2反应体系和扩增程序的优化20肚L反应体
系：模板DNA3肛L(60ng)，25mm01／LMgCl22．5
“L，10×Buffer(酶配套)2“L，2．5mmol／LdNTP
Mixture(上海生工分装)2弘L，o．5U／plTaq酶(上
海生工分装)3．5肚L，5pmol／L选择性引物(上海生
工合成)1且L，5pmol／L反向引物(上海生工合成)3
肛L，灭菌超纯水4肛L。扩增程序：使用PE9700扩
增仪(美国PE公司)。94℃预变性5min，94℃变
性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，共40个循
环。最后，72℃延伸10min完成整个PCR扩增。
1．2．3引物筛选从5个居群中各取出1份DNA
样品进行预备实验，从22组引物组合中选出5组能
获得清晰条带，反应稳定的随机引物组合：PrPl、
PrP2、PrP3、PrP4、PrP5(引物名称序列见表2)。
1．2．4DALP扩增及检测使用上述优化体系和引
万方数据
824 广西植物 32卷
物组合扩增所有的50个样品。扩增产物用含o．5
肚g／mLEB的1％琼脂糖凝胶电泳，电泳缓冲液为1
×TBE。电泳结果采用KodakImageStation
440CF凝胶成像系统，初步检测扩增效果，再进行聚
丙烯酰胺凝胶电泳及银染。
1．2。5聚丙烯酰胺电泳取5％非变性丙烯酰胺胶
(丙烯酰胺：甲叉双丙烯酰胺一29：1)40mL，用
真空泵抽气20min。加入256肛L过硫酸胺
((NH4)2S208)和17．6肚LTEMED(N，N，N，N’，
四甲基乙二胺)，开始制胶。上样量5肚L(样品：6
×上样缓冲液=5：1)，电泳条件：Dyy—Z型垂直电
泳仪，电压800v，电泳时间2．5h。
1．2．6DALP银染本实验采用快速银染法：①固
定液(10％乙酸)洗脱直至溴酚兰颜色褪去，用蒸馏
水洗3次，每次不少于2min。②染色液(o．1％的硝
酸银，染色前加入o。4％的甲醛)染色40min；蒸馏
水洗2s立即拿出。③在显影液(3．0％碳酸钠，显
影前加入o．4％甲醛，o．02％硫代硫酸钠)中显影至
条带清晰。④固定液(10％乙酸)固定5min，蒸馏
水洗10min。
‰-：。。二⋯一溺羚。删嗣攀¨㈧删⋯’
i职二|j薹嚣露蠢君主；冀露：量辱髫蘸垂萱；p鞲茎
；垂誊二：：：蓄茎二喜
图1 DALP引物组合对莲瓣兰EA、EB、Ec、ED、EE居群扩增的DNA指纹图谱
Fig．1DNAfingerprintsof5populationsof(≯m6idi“m￡o川i5e户口Z“mbyusingDALPprimergroup
1．2．7数据统计分析电泳图谱中根据分子量标准
对照反应产物在胶上的位置，估计扩增产物及其分
子量。有带记为(1)，无带记为(o)，形成0／1矩阵图
输入计算机。采用POPGENE软件计算出各居群
的Nei’s基因多样性指数(H)、Shannon’s多态性
信息指数(j)、多态位点百分率(PPB)、基因分化系
数(G。)、居群内基因多样度(H；)、居群间基因多样
度(H。)、Nei’s遗传距离(D)和遗传一致度(J)；同
时结合treeview软件对得到的遗传距离矩阵进行
非加权配对算术平均法(UPGMA)聚类分析，构建
聚类图。
2 结果与分析
2．1遗传多样性
莲瓣兰5个居群，5组DALP引物扩增得到
110条清晰条带，其中103条为多态条带，平均每个
引物扩增多态条带数为20．6。从表3看出，莲瓣兰
原变种各居群的遗传多样性水平差异不大，其中保
山(SD)居群的PPB值(66．36)、Shannon’s指数
(O．3659)和Nei’s基因多样性指数(O．2039)均为最
高；大理(YL)居群的PPB值(60．Oo)、Shannon’s
指数(0．3074)和Nei’s基因多样性指数(0．2241)较
低。然而，变种春剑的兴隆居群(XL)的PPB值
(42．73)、Shannon’s指数(O．2345)和Nei’s基因多样
性指数(o．1577)均远低于莲瓣兰原变种的各居群。
莲瓣兰居群水平的多态位点比率64．4％，物种
水平的多态位点比率93．64％；居群水平的Nei’s
基因多样性指数为o．2098，物种水平的Nei’s基因
多样性指数为o．3129；居群水平的Shannon’s指数
为o．3131，物种水平的shannon’s指数为0．4732。
2．2遗传分化
莲瓣兰物种水平总基因多样度(H，)为O．3128，
居群内基因多样度(H，)为o．2098，基因分化系数
嗍
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万方数据
6期 贾琳等：莲瓣兰DALP遗传多样性研究 825
表3莲瓣兰各居群的遗传变异
Table3 GeneticvariationoffivepopulationsofC． ￡orfisPp口Z“，挖
居群
Population
翼笔絮蝥^I徽!篓。毒变g守等位基因有效等位N。i，。基因sh。。。。。，。
T警{竺’ N0‘≮；p：粤甜矿鼍坌譬 可茹豸幽 霎看蚕荒 1；藉霉嚣“茗茹：8ofloci hicloci PPB 默n 歪日取八c 歹什I工“ 】日姒1
大理云龙(YL) 110 66 60．oO 1．6000 1．3452 o．2039 o．3074
保山施甸(SD) 110 73 66．36 1．6636 1．4281 O．2469 O．3659
迪庆维西(wX) 110 67 60．91 1．6091 1．3939 0．2263 O．3348
怒江福贡(FG) 110 69 62．73 1．6273 1．3603 o．2142 o．3230
春剑兴隆(EE) 110 47 42．73 1-4273 1．2699 O．1577 0．2345
平均值Averagevalue 110 64．4 58．55 1．5855 1．3595 o．2098 o．3131
物种Species llO 103 93．64 1．9364 1．5262 O．3129 O．4732
PPB=Theperc ntageofp01ymorphicloci；A：allelenumber；AP：effectiveall lenumb r；H=N西’sgenediversity；J—Shannon’sinformationindex
G为O．3292。这表明莲瓣兰物种的遗传变异有
32．92％来自居群间，67．08％来自居群内。而莲瓣
兰原变种水平上，则有23．38％的遗传变异存在于
居群间，76．62％的遗传变异存在于居群内。
表4不同居群间的遗传分化分析
Table4 Analysisofgeneticd fferentiationamong
populationsinC． ￡orfis已户口Z“m
Hr—Totalgenediversity；H：一Genediversityw thinpopulation
G口一Thecoefficientofgenedifferentiation；SD—Standarddevia ion
Nm—EstimateofgeneflowfromG口orGcs
表5 莲瓣兰各居群的遗传一致度以及遗传距离
Table5 Nei’sgeneticidentityandgeneticd stance
amongpopulationsofC．for矗5Fp以Z“研
Nei’sgeneticidentity(遗传一致度)(above1ine)andgeneticd s
tance(遗传距离)(belowlln )
根据基因分化系数G。计算出每代居群的移居
者数量N。。在物种水平，N。为1．0186；原变种水
平上，N。为1．6384。
2．3遗传关系
表5列出5居群的遗传一致度(Nei’sgenetic
identity)以及遗传距离(geneticdistance)。大理云
龙居群(EA)与保山施甸居群(EB)之间遗传距离最
小为o．0803，香格里拉维西居群(EC)与春剑的贵州
EE
EA
EB
EC
ED
图2莲瓣兰5居群UPGMA聚类图
Fig．2Dendrogramof5populationsofC．
forfisP户口2“7咒byUPGMA
兴隆居群(EE)之间遗传距离最大为o．2847。各居
群的UPGMA聚类分析见图2。
3 结论与讨论
3．1莲瓣兰居群遗传结构及进化因素的探讨
与其它具有相似生活史特征(多年生草本、以动
物为媒介的杂交、地区分布)的物种相比(PPB=
49％，A一1．89，H一0．131)(Hamrick等，1989)，莲
瓣兰居群水平(PPB一58．55％，A一1．5855，AP一
1．3595，H—o．2098，J—o．3131)和物种水平(PPB
一93．64％，A一1．9364，AP一1．5262，H—o．3129，工
一o．4732)均具有较高的遗传多样性，莲瓣兰在长期
的进化过程中形成了丰富的遗传多样性和进化潜力。
物种的繁育系统、遗传变异水平、进化历史、自
然选择和基因流的强弱等进化因素共同作用，使物
种形成了不同的居群遗传结构(Hamrick，1989)。
交配系统是影响居群遗传结构最关键的生物学因素
之一，因为交配系统不仅决定居群未来世代的基因
型频率，而且还影响到植物居群的有效大小和基因
流等其它进化因素(Barrett等，1990)。莲瓣兰是多
年生草本植物，在野外可以通过有性或无性方式进
万方数据
826 广西植物 32卷
行繁殖。有性繁殖依靠昆虫传粉，开花多而结果少。
授粉试验表明：莲瓣兰自体授精结实率为1％，人工
授粉的自交结实率为96％，人工杂交结实率为90％
(贾琳等，2006)。莲瓣兰虽然自交亲和，但要依靠传
粉媒介，其主要的交配方式是杂交。
在植物中，花粉的扩散和种子的传播是基因流
的两种最主要的形式(Hamrick，1987)。莲瓣兰花
粉的传播距离取决于传粉媒介，而昆虫的飞行距离
是有限的。但莲瓣兰微小的种子却可以借助风力远
距离散布，是莲瓣兰基因流的主要形式。莲瓣兰物
种的遗传分化系数G。为o．3292，高于以动物为媒
介的杂交物种(G。一o．197)和依靠风力散布种子的
物种(G—o．14)(Hamrick等，1989)，也高于其近
缘种春兰(G。一o．098)(Chung等，1999)。这表明
虽然莲瓣兰的种子可以借助风力散布，但是居群间
的基因流动仍然受到一定因素限制。遗传漂变、奠
基者效应、地理隔离和选择压力都是导致居群遗传
分化原因。通过G。估算出莲瓣兰原变种水平上各
居群间基因流眠一1．6384，居群的每一代个体中，
有1．6个遗传个体，略高于其它以动物为媒介的杂
交物种(N一一1．15)(Hamrick，1987)。眠>1，基因
流可以阻止遗传漂变导致的中性等位基因的固定
(Raijmann等，1994)。在这些居群中，遗传漂变不
是影响居群结构的主要因素(Slatkin，1987)。
然而，兰花种子典型的散布距离为5～10km
(Rasmussen，1995)，而莲瓣兰分布的三江并流地区
又多高山河谷，山脊的阻挡和隔离可能成为限制基
因流的因素之一。另外，即使居群之间存在不断的
基因流，但强有力的选择也能使彼此相距很近的居
群保持遗传上的差别(Bradshaw，1984)。莲瓣兰的
保山施甸居群的平均海拔为1500m，气候温暖湿
润；而维西居群的平均海拔为2500m，气候寒冷。
这种较大的环境差异产生的选择压力也可能成为导
致居群分化的因素。
综上所述，杂交和种子随风散布使得莲瓣兰居
群问产生基因流动，但是横断山区高山河谷的阻挡
和地理隔离限制了基因流动，而不同的生态环境则
选择了不同的基因型和表型，并固定了这种差异。
因此，杂交、种子散布机制和地理隔离、选择压力互
为制约因素。一方面，杂交和种子散布机制倾向于
不断消除居群间的遗传差异，避免居群间出现分化；
另一方面，地理隔离和选择压力则导致居群的分化。
而正是这两方面因素的制衡作用共同构建了莲瓣兰
居群的遗传变异式样。
需要注意的是，多年生植物，由于较长的世代和
不同世代的重叠，其遗传多样性的丧失速度将会减
缓。而一年生植物则会对影响遗传多样性的因素做
出更快的回应(Ouborg等，1999)。因此存在这样的
可能性：由于这种多年生的习性，莲瓣兰从遭受严重
破坏至本研究取样期间，经历的世代很少，以至于现
阶段并没有检测到遗传多样性的降低。将来，莲瓣
兰的基因库可能会对这些过度采集和生境破坏事件
做出延迟的回应。
3．2保护策略
兰科植物多为珍稀濒危植物，全世界所有野生
兰科植物均被列入《野生动植物濒危物种国际贸易
公约》的保护范围，全球范围内的生境退化和丧失加
上人为破坏是导致大量兰花变为稀有、濒危以致灭
绝的主要原因(IUCN／SSCOrchidSpecialist
Group，1996)。而对于莲瓣兰，最主要的原因就是
过度采集。虽然莲瓣兰在物种和居群水平上都具有
较高的遗传多样性，但过度采集和生境破坏使得莲
瓣兰居群的个体数量急剧减少，这可能导致遗传衰
退，从而影响物种的长期生存和适应能力。对一个
遗传多样性主要存在于居群之内的物种和一个遗传
多样性主要分布于居群间的物种应采用完全不同的
取样策略和保护方法(邹喻苹等，2001)。根据取样
的原则o．99—1一(GSr)”(行为取样居群数)(Ceska
等，1997)，为维持莲瓣兰物种99％的遗传多样性，
则至少要选取3个居群进行保护。莲瓣兰在云南主
要分布在三江并流区域，而该地区现已被列为世界
自然遗产。将莲瓣兰的保护和三江并流地区多个自
然保护区 保护工作相结合，将莲瓣兰列为该保护
区的重点保护植物。这样既保护了莲瓣兰的生境，
也防止了滥采滥挖。
莲瓣兰是云南兰花产业中的重要种类之一。许
多花卉公司和个人对莲瓣兰进行大量收购和种植。
这被认为是一种变相的迁地保护。但是，在这种人
工栽培条件下，莲瓣兰只有一种繁殖方式，即分株繁
殖。而长期的无性繁殖，没有居群内和居群间的基
因流动，将会导致物种多样性减少，环境适应能力降
低，进化潜能衰退和抵抗病虫害的能力下降。因此
这并不是一种真正意义上的迁地保护。此外，建立
莲瓣兰的人工繁殖体系，通过杂交选育特异品种，通
过组织培养大量优良品种，是对其保护策略的重要
补充。但是莲瓣兰生长周期长，种子萌发率很低，仍
万方数据
6期 贾琳等：莲瓣兰DALP遗传多样性研究 827
是该技术发展的主要限制因素。
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万方数据
莲瓣兰DALP遗传多样性研究
作者： 贾琳， 史云东， 虞泓， 骆扬， 李永谊， JIA Lin， SHI Yun-Dong， YU Hong， LUO Yang， LI
Yong-Yi
作者单位： 贾琳,史云东,JIA Lin,SHI Yun-Dong(玉溪师范学院资源与环境学院,云南玉溪,653100)， 虞泓,骆扬
,李永谊,YU Hong,LUO Yang,LI Yong-Yi(云南大学生命科学学院生态遗传学实验室,昆明,650091)
刊名： 广西植物
英文刊名： Guihaia
年，卷(期)： 2012,32(6)
被引用次数： 4次

参考文献(24条)
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引证文献(4条)
1.黄永艺,唐敏,叶广,张青华 花期调控技术在莲瓣兰产业化中的应用[期刊论文]-北方园艺 2015(08)
2.黄永艺,唐敏,张志荣,李枝林,毕玉芬 云南莲瓣兰主栽品种SSR指纹图谱的构建和遗传差异分析[期刊论文]-热带亚热带植物学
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3.黄永艺,唐敏,张志荣,李枝林,毕玉芬 云南莲瓣兰主栽品种SSR指纹图谱的构建和遗传差异分析[期刊论文]-热带亚热带植物学
报 2015(03)
4.魏霜,袁俊杰,程文杰,林利平,李小健,鄞杰平,黄锦炎,刘碧琳,刘晓莹 兰花的分子标记研究进展[期刊论文]-检验检疫学刊
2014(02)


引用本文格式：贾琳.史云东.虞泓.骆扬.李永谊.JIA Lin.SHI Yun-Dong.YU Hong.LUO Yang.LI Yong-Yi 莲瓣兰DALP遗传多样性
研究[期刊论文]-广西植物 2012(6)