全 文 ：文章编号:1001-4829(2009)02-0444-05
　　收稿日期:2008-05-11
　　基金项目:国家科技支撑计划(2007BAD45B01);国家自然科学
基金 (30160073);云 南 省 自 然 科 学 基 金 重 点 项 目
(2002C0002P);云南省人才培引项目(2006PY04)
作者简介:瞿素萍(1972-), 女 ,副研究员 ,从事花卉繁育与标
准化研究 , ＊为通讯作者。
亚洲百合种内杂交后代的多态性及其分离
瞿素萍 1 ,虞　泓 2, 4＊ ,吴学尉3 ,李永谊4 ,熊　丽 3
(1.农业部花卉产品质量监督检验测试中心(昆明),云南昆明　650205;2.云南大学生命科学院生态遗传学实验室 ,云南 昆明　
650091;3.云南省农业科学院花卉研究所 ,云南昆明　 650205;4.云南英茂生物技术实验室 ,云南昆明　 650212)
摘　要:利用 7对DALP引物组合对 5个亚洲百合杂交组合后代的多态性及分离方式进行了研究。结果表明 ,筛选出的 7对DALP
引物共检测出 136个位点 , 5个杂交组合共得到 680个位点 ,其中多态性位点为 379个 ,多态性位点出现的平均频率是 55.7%,呈
现出的多态性较高;DALP标记在杂交后代中的分离方式有不分离 、发生分离和异常分离 3种方式。 3种分离方式出现的平均频率
与数量分别为 44.3%、 60;41.8%、57;14.1%和 19。该研究结果可为进一步构建百合遗传图谱打下良好的基础 , 并提供了一定
的理论依据。
关键词:DALP;亚洲百合杂种系;多态性;分离方式
中图分类号:S644.1　　　文献标识码:A
PolymorphismandSegregationPatternsof
theProgeniesfromtheCrossofAsiaticLilyHybrids
QUSu-ping1 , YUHong2, 4＊ , WUXue-wei3 , LIYong-yi4 , XIONGLi3
(1.SupervisionandTestingCentreforFlowers, MinistryofAgriculture, YunnanKunming650205, China;2LaboratoryofEcologicalGenet-
ics, ColegeofLifeScience, YunnanUniversity, YunnanKunming650091, China;3FlowerResearchInstitute, YunnanAcademyofAgricul-
turalSciences, YunnanKunming650205, China;4InmolLaboratoryofBiotechnologyofYunnan, YunnanKunming650212, China)
Abstract:ThepolymorphismandsegregationpaternsintheprogeniesfromfiveCrosscombinationsofAsiaticlilyHybridswereinvestigated
using7primercombinationsofDALPmarkers.TheresultsshowedthatthepolymorphismoftheDALPmarkerswashigh.Totaly136DALP
lociweredetected, and680lociweredetectedfromthefivecrosscombinations, totaly, ofwhich379werepolymorphic, andthepercentageof
polymorphicloci(PPB)was55.7% onaverage.ThesegregationpatternsincludedNon-segregation, segregationandabnormalsegregation,
andthefrequencyandnumberwere, 44.3 %, 60, 41.8%, 57, 14.1%, 19, respectively.Allaboveweretheworkbaseandcouldprovide
sometheoreticalbasisforthefurtherworkoftheconstructionoflilygeneticmap.
Keywords:Directamplificationoflengthpolymorphisms;Asiaticlilyhybrids;Polymorphism;Segregationpatern
　　直接扩增片段长度多态性(directamplification
oflengthpolymorphisms,简称 DALP),是基于随意扩
增 PCR(AP-PCR)而发展起来的一种新方法 [ 1] ,
DALP标记不仅具有信息量大 、不需参考被分析样
品的基因组序列等 RAPD标记的优点 [ 2] ,而且由于
其引物序列较 RAPD引物长 7 ～ 10个碱基和采用了
双引物 ,使其具有更高的重复性和稳定性 ,能有效克
服 RAPD标记重现性低的缺点 [ 3] 。
百合(Liliumssp.)由于花型花色丰富多彩 ,品
种多样 ,花期长 ,其种球和切花销售量一直居世界前
列。随着分子标记技术的发展与应用 ,已有 RAPD
应用于百合品种间遗传关系的分析 [ 4 ～ 5] 。 Straathor
等[ 6]用田间鉴定存在抗性差异的亚洲百合回交后
代作为试验材料 ,通过 RAPD的分析表明 ,亚洲百合
对尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)的抗性并不完
全符合孟德尔遗传规律 ,但发现其中 71条 RAPD标
记与约 24 %的抗性表型相关联。 Obata[ 7]也利用
RAPD标记对百合 L.nobilisimum和 L.regale种间
杂交形成的胚和胚盘进行了鉴定 。虞泓等 [ 8] 应用
ITS技术开展了亚洲系百合 9个品种的亲缘关系研
究。柴卫淑等 [ 9]开展了 ARP-PCR法早期鉴定百合
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西　南　农　业　学　报
SouthwestChinaJournalofAgriculturalSciences　　　　　　　　　　　　　　
2009年 22卷 2期
Vol.22　　No.2
DOI :10.16213/j.cnki.scjas.2009.02.059
远缘杂种的技术研究 ,但目前未见杂交后代分离和
遗传方面的报道 。李守丽等 [ 10] 也提出国内在百合
新品种选育及育种技术方法等方面虽有一定创新 ,
但在濒危物种的保护 、育种过程中杂交不育机理等
基础理论研究以及分子生物学辅助育种的开展等方
面还比较薄弱 ,有待进一步加强 。鉴于此 ,本文研究
了 DALP标记在 5个杂交组合中杂交后代的多态性
水平与分离方式 ,为今后开展育种工作和进一步构
建百合遗传图谱打下良好的基础 ,并提供了一定的
理论依据。
1　材料与方法
1.1　供试材料
材料取自云南省农科院花卉所基地 ,共取 5个
杂交组合 ,每个组合有 2 ～ 3个杂交后代 ,每个个体
均是已培育开花 ,并经稳定性和一致性测定的杂交
后代 。供试材料编号及花部特征见图 1。
1.2　试验方法
1.2.1　DNA的提取　每个个体取约 0.5 g幼嫩叶
片 , DNA提取采用改良的 CTAB法 (瞿素萍等 ,
2005)[ 11] 。
1.2.2　DALP技术方法　①DALP引物设计。引物
参照 Marie等 [ 12]进行设计 ,从 26组引物中筛选出条
带较清晰 ,多态性较好的 7对引物 ,选择性引物分别
是 DALP221 (5 -GTTTTCCCAGTCACGACACGC-
3 )、DALP232(5 -GTTTTCCCAGTCACGACACGAC-
3 )、DALP234(5 -GTTTTCCCAGTCACGACACCAG-
3 )、DALP235(5 -GTTTTCCCAGTCACGACACCAC-
3 )、 DALP241 (5 -GTTTTCCCAGTCACGACACT
CAG-3 )、DALP2 43(5 -GTTTTCCCAGTCACGA
序号为不同的杂交组合 ,箭头左方为亲本(母本 ×父本),箭头右方为杂交后代
Numberdenotesdiferentcrosscombinationthephotographsatarrowslefthandareparents(femaleparent×maleparent), thephotographsat
arowsrighthandaretheprogtnies
图 1　供试材料的花部特征
Fig.1　Flowercharacteroftheexperimentalmaterial
4452期 　　　　　　瞿素萍等:亚洲百合种内杂交后代的多态性及其分离
图 2　亚洲百合亲本及杂交后代的 DALP标记(引
物为 DALP235/DALP2)
Fig.2　DALPmarkersintheparentsandprogeniesfromthe
crossofasiaticlilyhybrids(primerisDALP235 /
DALP2)
CACTCGA-3 )和 DALP245 (5 -GTTTTCCCAGT-
CACGACACCCAC-3 ), 均对应反向引物 DALPR2
(5 -TTTCACACAGGAAACAGCTATGAC-3 )。 ②
DALP反应体系 。在优化 DALP体系的基础上 ,选择
条带清晰 、稳定的反应体系 ,总体积为 20 μl,其中
ddH2O2.5 μl, 10 ×TaqBufer2.0 μl, Mg2+(25
mmol/L)2.5μl, dNTP(各 0.25 mmol/L)2.0μl,选
择性引物(5 μmol/L)1.0 μl,反向引物(5μmol/L)
3.0μl, Taq酶(0.5 μ/μl)4.0 μl, DNA(20 ng/μl)
3.0μl,除引物由上海生工合成外 , Taq酶和配套试
剂均购自 Promega公司。 ③DALP反应程序 。反应
程序 94℃ 5min;94℃ 30s, 50℃ 30s, 72℃ 60s, 40
个循环;72 ℃10 min,反应在 PE9700(美国 PE公
司)扩增仪上进行 。每次扩增均设无模板的对照 1
个 。④电泳及染色。将 DALP反应产物用 5 %聚丙
烯酰胺凝胶进行垂直板电泳 ,电压为 600V,时间约
5.5h。电泳结束后常规银染 。⑤数据处理和分析 。
数据分析选择清晰可辨的电泳带 ,有此带时赋值为
“1”,无此带时赋值为 “0”,应用 “PopGen32”进行数
据的处理与分析。用 TreeView软件完成各组合中
亲本和杂交后代间的聚类分析。
2　结果与分析
2.1　DALP标记效果和多态性水平
在本试验中 ,所筛选出的 7对引物均得到清晰
的标记 ,共得到 136个位点 ,每个引物得到了 17 ～
25条带 ,平均为 19条 ,无模板的对照均无带产生
(图 2),从所得标记情况反映出了本实验技术与结
果的可靠性。 5个杂交组合共得到了 680个位点 ,
其中多态性位点为 379个 ,出现的平均频率是 55.7
%(表 1), DALP标记表现出的多态性较高 ,丰富的
多态性为构建遗传图谱及遗传性状标记提供了丰富
的资料。
2.2　DALP标记在杂交后代的分离方式
标记在杂交后代的分离方式有 3种类型 (表
1):a.在杂交后代不分离:就是指双亲有 ,则杂交后
代也有 ,而双亲无 ,杂交后代也无的条带 ,每个组合
的数量与比例各不相同 ,数量为 49 ～ 77条 ,平均为
60.2条 ,所占百分比为 36 % ～ 56.6%,平均不发生
分离的比例为 44.3 %。 b.杂交后代发生分离 ,有 2
种情况 ,一种为双亲 1个有 , 1个无 ,子代也是 1个
有 , 1个无或 2个有 , 1个无或 2个无 , 1个有的情
况 ,另一种是双亲都有 ,而子代 1个有 , 1个无 ,或 2
个有 , 1个无或 2个无 , 1个有的情况。每个组合的
数量与比例各不相同 , 数量为 43 ～ 68条 ,平均为
56.6条 ,所占百分比为 31.6% ～ 47.8 %,平均不发
生分离的比例为 41.8 %。 c.发生异常分离 ,表现为
双亲均无 ,但在杂交后代出现的标记 ,以及双亲或单
亲有 ,而杂交后代不出现的标记 。每个组合的数量
与比例各不相同 , 数量为 11 ～ 34条 ,平均为 19.2
条 ,所占百分比为 8.1 % ～ 25 %,平均不发生分离
的比例为 14.1 %。
表 1　DALP标记在亚洲百合亲本与杂交后代中的多态性水平及分离方式
Table1　PolymorphismandsegregationpatternsofDALPmarkersintheparentsandprogeniesfromthecrossofliliumasiatichybrids
项目 杂交组合 Crosscombination
1 2 3 4 5
合计
Total
总谱带 Totalbands 136 136 136 136 136 680
多态性带 Polymorphicbands 65 59 84 87 84 379
多态性水平(%)Polymorphism 47.8 43.4 61.8 64.0 61.8 55.7
不分离 Non-segregation 71 77 52 49 52 301
分离 Segregation 54 43 65 53 68 283
异常分离 Abnormalsegregation 11 16 19 34 16 96
446 西　南　农　业　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　22卷
2.3　各杂交组合中的杂交后代和亲本的聚类分析
　　本试验所得到的遗传聚类有以下几种情况:①2
个杂交后代聚在一起 ,又与母本聚 ,最后才与父本相
聚 ,如杂交组合 1,结合图 2花部特征分析 ,可看出 2
个子代的性状很相似 ,其次遗传母本的性状较多 ,本
试验得出的结果也证实了这一点。②双亲先聚在一
起 ,再与 1个杂交个体 LCA18相聚 ,最后才与另 1
个杂交个体 LCA17相聚 ,如杂交组合 2,结合花部特
征分析 ,双亲的花型很相似 ,其中 1个个体 LCA18
与母本的花色较接近 ,花型为双亲的中间型 ,但无斑
又遗传了父本的性状 ,另一个体 LCA17的花色为双
亲的综合 ,大量斑点又遗传了母本的性状 ,说明仅花
部特征也可能是几对基因所控制 ,遗传关系比较复
杂 。③1个子代 LCA8与父本相聚后与母本相聚 ,最
后与另 1子代 LCA7聚合 ,如杂交组合 3,从花部特
征也可看出 LCA8的花色与父本很相象 ,花型也较
接近 ,而 LCA7从花色性状来看 ,与双亲的性状差异
较大 ,因此 LCA7在聚类中与双亲和 LCA8的遗传关
系较远 。④双亲聚合在一起 , 2个杂交后代又聚合
在一起 ,最后两类再聚合在一起 ,如杂交组合 4,分
析其花部特征 ,可看出 2个杂交后代的花色为复色 ,
且均是桔黄底色 ,花瓣尖及边缘为红色 ,只是 LCA5
为暗红色 , LCA6稍淡 ,为父母本花色的嵌合 ,斑点
也很相似 ,因此从性状上也可看出 2个子代亲缘关
系更接近 , DALP标记所得的结果与性状特征得到
了相互验证 。⑤杂交后代中的 LCA9和 LCA10聚在
一起 ,另 1个体 LCA19与父本聚到一起 ,最后才与
母本相聚 ,如杂交组合 5,从花部特征可看出 LCA9
和 LCA10的花色 、斑点 、花型很相似 ,用 DALP标记
也得出两者的亲缘关系较近 ,而 LCA19与父本的花
型 、斑点较相似 ,两者聚在一起(图 3)。
图 3　DALP分析的聚类树状图(序号为不同的杂交组合)
Fig.3　DendrogramonDALPmarkers(Numberdenotesdiferentcross
combination)
3　讨　论
3.1　揭示的分离方式
3.1.1　不发生分离　由于 DALP标记为显性标记 ,
在杂交后代不发生分离的标记符合孟德尔分离规
律 ,揭示出当双亲为 4种标记组合时 ,即 AA×AA、
AA×Aa、Aa×AA与 AA×aa(A、a分别表示同一标
记位点的显 、隐性标记),在杂交后代同样表现为不
发生分离 ,也就是父本或母本表现为存在或缺失的
标记(存在为显性 ,缺失为隐性),在杂交后代中同
样表现为存在或缺失 ,此类标记可进一步用来构建
百合的遗传图谱。
3.1.2　发生分离　在发生分离的位点中 ,可能存在
两种情况 ,一种是符合孟德尔分离规律 ,即分离比例
为 1∶1或 3∶1时 ,此类位点可进一步用来构建遗传
图谱 。另一种是偏孟德尔分离 ,即分离比例偏离了
上述比例 ,此类位点不可用来构建遗传图谱。由于
本次试验所选材料均为已开花的子代 ,从杂交至开
花需 3 ～ 4年 ,在此过程中不断有死亡和淘汰的株
系 ,致使所选的杂交后代个体较少 ,所得到的比例不
能完全代表分离的比例 ,未能将两种情况清楚地分
开。
3.1.3　异常分离　此类标记出现的频率为 14.1
%, 5个杂交组合均出现了此类情况 ,只是比例不完
全一致。异常分离在杂交中的存在曾有过很多报
道[ 13 ～ 15] ,只是在不同作物及种类中所占的比例不
同。其中双亲没有 ,而杂交后代具有的类型 ,从已有
的研究报道可推测这可能是来源于不同长度的等位
核苷酸序列之间形成的异源双链体 ,或者是由于配
子形成过程中染色体的不等价交换产生的新序列。
至于双亲有 ,而后代无的情况 ,可能是由于配子形成
过程中染色体的交换及 DNA分子碱基修饰引起的
突变等原因所造成的位点丢失 [ 15 ～ 16] 。不过 ,上述现
象的确切原因还有待进一步的深入研究 。
3.2　聚类分析
本试验证明了利用 DALP等标记可从分子层面
更深层次地了解杂交后代与亲本间的遗传关系 ,有
助于提示亲本的遗传特征在经过基因交换和多代选
择后在子代中的分布规律 ,有利于揭示品种性状是
如何进行遗传重组的。可通过结合分子标记对百合
杂交遗传规律作进一步的深入研究 ,了解亲本优良
性状的遗传与分离规律 ,从而为优良亲本的选配和
子代鉴定等工作的开展提供直接而有价值的参考依
据。
3.3　标记与性状的联系
从本试验可观察到 DALP标记位点及遗传关系
4472期 　　　　　　瞿素萍等:亚洲百合种内杂交后代的多态性及其分离
与其性状存在着一定的相关性 ,有望通过进一步的
准确定位 ,找出控制花色 、斑点 、抗性和花粉等性状
的特征性位点 ,以便能准确地鉴定杂交后代 ,在早期
就将具优良性状的杂交后代个体筛选出来 ,大大提
高育种效率 ,并且可有针对性地对亲本进行选配 ,减
少选配的盲目性 ,这项研究对于百合这类育种周期
长的作物具有非常重要的现实意义。
3.4　生物多样性的保护与利用
自绿色革命以来 ,由于品种遗传改良的巨大成
功和少数高产品种的大面积集约化生产 ,造成了农
作物品种严重的 “基因流失 ”(geneticerosion),极
大地降低了农作物的遗传多样性 [ 17 ～ 20] 。因此 ,现代
育种观念已由传统育种逐渐转变到更为关注生物多
样性 ,其中发生了变异的基因和表现出变异的个体 ,
是丰富的物种和复杂生态系统形成的条件 ,也是维
持生物多样性的最基础的成分 [ 19] ,为此 ,在实际的
育种过程中 ,不仅要注意提高单一的遗传增益 ,而且
要注意保护育种或自然形成的各种变异。
致　谢:感谢云南英茂生物技术实验室的和锐 、朱荣
勋和倪念春等工作人员在实验过程中给予的帮助!
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(责任编辑　王家银)
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