全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 28(3)：386— 389 2008年 5月
播娘蒿 hmgr基因保守区片段的克隆与分析
陈凤美 ，曹小迎1，蒋继宏1*，张小平 ，钱利武2，刘 群1
(1．徐州师范大学 江苏省药用植物生物技术重点实验室 ，江苏 徐州
221116；2．安徽师范大学 生命科学学院 ，安徽 芜湖 241000)
摘 要 ；通过比较 6种植物的 8条甲羟戊酸途径关键酶 3一羟基一3一甲基戊二酰辅酶 A还原酶(HMGR)基因同
源区域 ，设计简并引物，利用 RT-PCR技术成功地从播娘蒿叶中扩增 出 458bp的基 因片段 。通过 BlastP比
较，所推断的播娘蒿 HMGR蛋白序列与拟南芥(NP一177775)、萝 卜(CAA48610)、杜仲(AAV54051)、胡黄连
(ABC74565)、喜树(AAB69726)、龙胆草(BAE92730)的一致性分别达到 98 、96 、88 、89 、86 和 87 。
通过对蛋白质保守区、特征区以及进化树分析，证实该片段确为hmgr基因片段，该结果为首次报道。
关键词：播娘蒿 ；3-羟基一3一甲基戊二酰辅酶 A还原酶 ；基因克隆
中图分类号：Q781，Q943 文献标识码：A 文章编号：1000—3142(2008)03一t0386—04
Cloning and analysis of hmgr ne C0nSeI V
fragments in Descurainia sophia
CHEN Feng-Mei ，CAO Xiao-Ying ，JIANG Ji-Hong
ZHANG Xiao-Ping ，QIAN Li-Wu2，LIU Qun
(1．Key Laboratory of Biotechnology for Medicinal Plant，Xuzhou Normal University，Xuzhou 221116，
China；2．Colege of Life Sciences，Anhui Normal University．wuhu 241000，China)
Abstract：Based on the design of degenerated oligonucleotides according to the conservative regions of eight 3-hydrox-
y-3一methylglutaryl—CoA reductases(HMGRs)from six plants and total RNA extracted from Descurainia sophia，a
458bp fragment of hmgr was obtained by using reverse transcription PCR strategy．Through sequence analysis by
B1astP online，the resulting protein showed high homology to 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase，with 98 i-
dentification compared with Arabidopsis thaliana(NP一177775)，96 with Raphanus sativus(( A4861O)，88 with
Eucommia ulmoides(AAv 54051)，89 with Picrorhiza kurrooa(ABC74565)，86 with Camptotheca acuminata
(AAB69726)and 87％ with Gentiana lutea(BAE92730)．Deduced amino acid sequences were also analyzed by PRO—
SITE，ClustalX and M EGA Ver．3．1，and data present e~dence for the existence of 3-hydroxy-3一methylglutaryl-CoA
reductase in Descurainia sophia．This is the first report of the hmgr gene isolated from D．sophia．
Key words：Descurainia sophia；3-hydroxy-3一methyl—glutaryl—coenzyme A reductase(HMGR)；gene cloning
许多植物萜类化合物(如抗肿瘤药物紫杉醇和
抗疟药青蒿素)都具有很好的药理活性，为解决当前
西药毒副作用大及治疗癌症、艾滋病等疑难疾病提
供了一条新的药物来源，因此植物萜类化合物引起
了人们浓厚的兴趣。随着植物基因工程的飞速发
展，植物萜类代谢途径的研究取得了突破性的进展，
人们通过对关键酶基因的分离克隆，表达调控进而
对萜类次生代谢的合成途径和调控机制有了更为深
入的了解 (Newman 8L Chappell，1999；Eisenreich
等，1998)。现代研究认为萜类在植物体中的合成是
收稿日期：2006—12—20 修回日期 ：2007—03—28
基金项 目：徐州师范大学科研基金(04XLB34)[Supported by Science and Research Foundation of Xuzhou Normal University(04XLB34)]
作者简介：陈凤美(1953一)，女，江苏徐州人 ，副教授，主要从事药用植物生物技术方面研究。
通讯作者(Author for c0rresp0ndence，E-mail；jhjian~ @xznu．edu．cn)
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3期 陈凤美等：播娘蒿 hmgr基因保守区片段的克隆与分析 387
分为两部分的，一部分是甲羟戊酸途径，在细胞质中
进行，产生倍半萜和三萜(Newman 8L Chappel，
1999)；另一部分是丙酮酸一磷酸甘油醛途径，在细
胞的质体中进行，产生单萜、二萜和四萜(Eisenreieh
等，1998；Lichtenthaler，1999)。在 甲羟戊酸途径 中
3一羟基一3一甲基戊二 酰辅酶 A 还原 酶(3-hydroxy-3-
methylglutaryl CoA reductase，HMGR)是 主要 的
关键酶之一。目前 ，hmgr基 因已先后从甜瓜(Kato—
Emori等，2001)、红豆衫 (Liao等，2004)及杜仲
(Jiang等，2006)等植物中得到分离克隆。
播娘蒿(Descurainia sophia)隶属于十字花科
(Crueiferae)播娘蒿属(Descurainia)，为一或二年生
草本，除华南外全国各地均有分布。其成熟干燥的
种子俗称南葶苈子，为中药葶苈子的正品，具有止咳
平喘、消肿利尿、强心之功效 (国家药典委员会，
2000)。南葶苈子种子中萜类含量较丰富(王新芳
等，2005)。若能通过基因工程手段来调控萜类代谢
途径的关键酶如 HMGR等继而促进萜类活性代谢
产物的合成积累将是一件十分有意义的事件。但迄
今为止，国内外尚未见到有关播娘蒿萜类物质代谢
合成途径及其关键酶基因如 HMGR等的研究报
道。此外，从不同物种中分离克隆 hmgr基因，从而
进一步研究hmgr基因的结构特征、分子进化以及
生物学功能都是非常有意义的。本文首次克隆了播
娘蒿 hmgr基因的 cDNA片段，并用生物信息学手
段对其序列进行了分析。
1 材料与方法
1．1材料
播娘篙种子购自安徽毫州中药材市场，经安徽
师范大学植物研究室张小平教授鉴定为南葶苈子正
品。种子经过双氧水处理及升汞消毒处理后，播种
于MS0培养基，25℃培养 4周，长出的无菌苗置于
4℃处理 3 d。
1．2总 RNA的提取
按照 Trizol试剂盒(TaKaRa)说明书操作分离
总 RNA，提取的总 RNA经 1 甲醛变性琼脂糖凝
胶电泳和 260～280 nm波长的紫外光扫描来分析
其质量。
1．3兼并引物的设计与合成
兼并引物的设计依据 6种植物的 7条 HMGRs
保 守 序 列 设 计 (Genbank 中 的 序 列 号 为：
CAU72145，CM CHM GCoAR，AB021862，ATHH—
MG1，AY352338，AF429388，MAU437l1)。上游引
物序列为 5’一GG[G／C／T]GATGC[A／T／C]AT—
GGG[G／A]ATGAA[C／T]ATG，下游引物序列为
5，_AC[A／T／C]GT[A／C／G]CC[A／C]ACCT—
CAATNGAEA／T／G]GGCAT-3’。引物合成由北
京奥科生物技术有限公司完成。
1．4 eDNA克隆及序列分析
播娘蒿的总 RNA反转录成 cDNA通过 RACE
试剂盒(Clonteeh)完成，所有操作步骤均按试剂盒
说明书进行。以合成的 5’RACE cDNA为模板，用
两个上下游引物进行 PCR扩增。PCR反应条件为
94℃变性 3 min，然后是 35个循环 的 94℃ 1 min，
58℃ 1 min和 72℃ 2 min。最后再 72℃延伸 10
min。PCR产物经 1 琼脂糖电泳后，切下 目的片
段，经回收纯化后与 pGEM-T Easy载体连接，转化
DH5a大肠杆菌。在 LB／AMPr／IPTG／x-Gal平板
上筛选阳性克隆，然后随机挑选经 EcoR工酶切确认
的重组质粒并测序，测序工作由北京奥科生物技术
有 限 公 司 完 成。将 所 测 定 的 序 列 结 果 通 过
BLASTN和 BLASTP搜索 National Center for Bi-
otechnology Information(NCBI)的核苷酸和蛋 白质
数据库，将所测序列通过 DNAMAN软件翻译成氨
基酸序列并寻找做最大读码框，用 PROSITE软件
(Hulo等，2006)在线分析该蛋白质的基本结构域，
并通过 ClustalX分析软件(Thompson等，1997)与
其它植物的 HMGR氨基酸序列进行多重比对，用
生物信息学软件 MEGA Ver．3．1(Kumar等，2004)
构建进化树。
2 结果与分析
2．1 RNA提取
播娘蒿总 RNA的甲醛变性凝胶的电泳结果如
图 1。从图 1可以清晰地看出2条 rRNA条带(18S
rRNA、28S rRNA)，其中28S rRNA条带的亮度大
约为 18S rRNA的 2倍 ，说明了总 RNA 良好的完
整性。紫外 分 光光 度 法测 得 A。 。／Az。比值 为
1．998，为典型的 RNA吸收值。说明酚类、多糖、蛋
白质和无机盐等杂质已经排除。
2．2播娘蒿 hmgr基因克隆与序列分析
通过 RT-PCR，从播娘蒿总 RNA 中成功地克
隆到了一条片段，大小在 500 bp左右(图2)。PCR
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片段纯化后，TA克隆到 pGEMT—easy载体上，蓝
白斑筛选获得阳性转化子，进一步提取质粒，验证转
化子大小，然后将分子量明显增大的重组质粒作为
模板，用原引物进行 PCR扩增，验证重组质粒插入
的片段的大小 ，表 明重组质粒 中插入的片段为 RT-
PCR克隆得到的片段。测序结果为一大小为 458bp
的片段，将序列在 NCBI网站上通过 BLASTN在线
比较，结果显示这条序列与其它植物的 hmgr基因
有很高的同源性，说明扩增到的序列就是播娘蒿的
hmgr基因序列 。
图 1 总 RNA 电泳
Fig．1 Total RNA gel electrophoresis
M
- 3Kb
一 2Kb
一 1 Kb
． 5Kb
图 2 保守区片段扩增产物
Fig．2 Product of conservation fragment
M：DNA Marker(GeneRulerTM lkb DNA
Ladder)；1．PCR product．
2．3推断的 HMGR氨基酸序列的同源 比较 、功能域
及结构分析
由获得的hmgr基因序列推断出的 HMGR氨
基酸序列通过 BLASTP在线比较，播娘蒿 HMGR
氨基 酸 序 列 与 拟 南 芥 (NP一177775)、萝 b
(CAA48610)、杜 仲 (AAV54051)、胡 黄 连
(ABC74565)、喜 树 (AAB69726)、龙 胆 草
(BAE92730)的一致性分别达到 98 、96 、88 、
89 、86 和 87 。用 PROSITE软件在线分析
(http：／／us．expasy．org／prosite／)，发现播娘蒿推导
的 HMGR氨基酸序列具有 HMGR家族中的保守
区域 ，并发现 了下 列特征位点 ：一个蛋 白激酶 C磷
酸化位点，两个酪蛋白激酶 Ⅱ磷酸化位点，六个 N
端豆蔻酰化位点 (图 3)。同时分 析了不 同来源
HMGR蛋白质序列的结构特点，发现它们同样拥有
这些结构特点。
I I I Il IV V
— I}_—— iI．
VI 礓 镥 IX
图 3 推断的HMGR中152aa的 prosite分析结果
Fig．3 Analysis of HMGR deduced 152aa by prosite
Proteinkinase C ph0sph0ry1ati0n site：38—40 SdK(I)}Case—
inkinaseⅡ ph0sph0ry1ati0n site：113—116 TqqD(V)；128—131
TmmE(Ⅸ)}N-myristoylation site：31—36 GisgNY(I)}34—39
GnycSD(V1)}88-93 GsavAG(HI)；93—98GSlgGF(Ⅶ)；96一101
GgfnAH(N)}114-119 GqdpAQ(Ⅶ)．
图 4 18种植物 HMGR部分氨基酸序列系统发育关系
Fig．4 Phylogenetic analysis of amino acid sequences
of HM GR from Descurainia sophia and other
1 7 plants in GenBank database
2．4推断的 HMGR蛋 白的进化分析
不同植物 HMGR氨基酸序列所得出的系统演
化关系虽不能真实反映植物在历史长河中的自然进
化关系，但其结果对判断不同植物间的亲缘关系仍
具一定的借鉴意义(李嵘等，2006)。本实验对 Gen—
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Bank同源性搜索获得的 18种植物的 HMGR氨基
酸序列进行了系统发育分析，通过 MEGA3．1软件
用 Neighber-joining方法 构建 系统发 育树 ，按 自展
法(boostrap)运行 1 000次，结果显示播娘蒿和拟南
芥(NP一177775)亲缘关 系最近，它们最先与萝 b
(CAA48610)聚在一起，然后与杜仲(AAV54051)、
穿心莲(AAP14352)和胡黄连(ABC74565)聚类合
并，再与苜蓿(ABE88827)、万寿菊(AAC15475)、喜
树 (AAB69726)、野 生 烟 草 (AAO85554)、烟 草
(AAL54878)、美 花 烟 草 (CAA45181)、马 铃 薯
(Q41437)、番茄(AAB62581)、龙胆草(BAE92730)、
苹果(AAK95406)、陆地棉(AAC05089)及橡胶树
(AAU08214)聚类 。
3 讨论
本实验首次从播娘蒿中扩增出甲羟戊酸途径的
关键酶基因 hmgr的保守区序列，通过同源性比较、
保守性区域比较以及蛋白特征性位点分析，发现与
已报道的 HMGR蛋白特性很相似，因此可推断克
隆得到的片段就是播娘蒿 HMGR的 cDNA片段。
RACE技术是近年来发展较成熟的一种 cDNA
末端快速扩增技术，其原理是利用全长 cDNA中间
部分已知序列通过 PCR技术扩增出 cDNA 3’端和
5’端。它具有快捷，方便和高效等特点。本实验已
通过 RACE试剂盒得到了播娘蒿叶的 5’RACE cD-
NA，并通过兼并引物获得 了播娘蒿 HMGR 的 cD-
NA的保守区片段 ，这为克隆播娘蒿 HMGR的全长
基因进而利用基因工程技术提高播娘蒿中的有效化
学成分的研究和应用奠定了坚实的基础。
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(上接第 426页 Continue from page 426)
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