全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 31(6)：725— 729 2011年 I1月
DOI：10．3969／j．issn．1000—3142．2011．06．005
扎龙芦苇遗传多样性 ISSR分析
杨晓杰1 ，佟守正 ，程加春 ，李 娜
(1．齐齐哈尔大学 生命科学与农林学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006；2．中国
科学院 东北地理与农业生态研究所 ，长春 130012)
：
摘 要：采用 ISSR分子标记技术对扎龙湿地的 5个野生芦苇居群进行了遗传多样性研究。从 75条 ISSR引
物中筛选出1O个特异性强、稳定性好的引物进行 ISSR分析。共获得 96个位点，其中多态位点 94个，多态位
点百分率为 97．92 。PopGene分析结果表明：居群的平均多态位点百分率为 56．46 ，Shannon’S多样性指
数(D平均值为o．4783，具有较高的遗传多样性，居群间存在一定程度的基因流(N 为 0．9249)和遗传分化
(Nei’S信息多样性指数平均值为 0．3150，Gst平均值为 0．3509)，居群内的基因多样度占总居群的64．91 ，
居群间占35．09 ，表明芦苇居群的变异主要来源于居群内。聚类分析的结果表明：5个芦苇居群分为两类，
克钦湖居群(K)和唐土岗居群 (T)最近聚在一起 ，然后和稍远的局址居群(J)聚为一类 ；满代居群(M)和赵凯
居群(Z)聚为一类。以上结果可为芦苇种质资源的保护和利用以及物种分化研究提供基础资料。
关键词：芦苇；居群遗传结构；遗传变异 一
中图分类号：Q949．67 文献标识码：A 文章编号：1000—3142(2011)06—0725—05
Genetic diversity of Phragmites australis populations
from Zhalong based on ISSR analysis
YANG Xiao—Jie ，TONG Shou-Zheng ，CHENG Jia-ChunI，LI Na1
(1．College of Life Science and Agriculture and Forestry Qiqihar univeisity，Qiqihar 161006，China；2．Northeast Institute of
Geography and Agricultural Ecology，Chinese Academy of Sciences，Changchun 130012，China)
Abstract：The genetic diversity of 5 wild Phragmites australis populations from Zhalong was estimated using inter-
simple sequence repeat(ISSR)markers，using ten specific and stable primers selected from 75 primers．A total of 96
sites were generated，94 of which(97．92％)were polymorphic．The data was analyzed by PopGene．The average per—
centage of polymorphicloei of populations was 56．46 and demonstrated high genetic diversity(the average value of
Shannon’S index(I)was 0．4783)．To some extent，both gene flow and genetic diversity were present among popula—
tions(Nm was 0．9249，average Nei’S index was 0．3150，and average Gst was 0．3509)．The gene proportion of diver—
sity reached 64．91 within population but was 35．09％ among populations．This demonstrated that genetic variation
of P．australis populations was mainly within populations．According to cluster analysis，the populations were elassi—
fied into two large groups：the populations(K，T and J)grouped together，whereas populations(M and Z)grouped tO—
gether．These results would supplement the information for protection and utilization of P．australis and also provide
further data for the study of genetic variation and species differentiation of P．australis．
Key words：Phragmites australis；population genetic structure；genetic variation
收稿 日期 ：2011—02—18 修回日期：201卜08—19
基金项 目：国家自然科学基金(4Dg71O53)[supported by the National Natural Science Foundation of China(40971053)]
作者简介：杨晓杰(1962一)，女，辽宁法库人，硕士，教授，从事植物学教学和科研工作
，(E—mail)yangxiaojie1980@163．eom o
通讯作者(Author for correspondence)
726 广 西 植 物 31卷
芦苇 (Phragmites australis)为禾 本科多年 生
高大草本，是世界广布的重要湿地物种，通常在池
沼、泉边、河旁、湖边、河口等浅水湿地形成密集的单
优群落，影响着湿地的外貌、结构与功能(徐卫华等，
2005)。在长期的适应不同生境中，个体及居群间发
生了分化和变异，构成了种内丰富的生态型(林文芳
等，2007)。尽管对不同生态型芦苇已进行了大量资
源分布、形态结构、生理生态、居群特征以及细胞学
等方面的研究(赵可夫等，1998；李修仓等，2008；柳
新伟，2009)，然而针对芦苇变异规律及其形成机制
仍然存在很多分歧(王仁卿等，2000；王振庆等，
2006；刘斌斌等，2009；庄瑶等，2010)。基因型是影
响芦苇变异的关键因素，Kuhl和 Zemlin(2000)将
生长在不同河域的芦苇居群移栽到同质的生境中，
芦苇在表型和居群结构上依然差异显著，这种表型
差异都可认为是遗传结构不同引起。芦苇的形态分
化由环境引起还是基因型不同导致，在早期无法确
定，因此表型的差异往往被认为是划分生态型的依
据(Clevering Lissner，1999)。Saltonstal(2003)
运用 SSR标记技术分析了北美、欧洲以及引进种等
3个芦苇世系的遗传多样性，认为三者在遗传水平
上存在差异。林文芳等(2007)基于 ISSR和 RAPD
分子标记分析，发现河西走廊四种不同生态型芦苇
间表现出水生芦苇一盐渍芦苇一沙丘芦苇逐渐演替
趋势。刘斌斌等(2009)用 RAPD标记技术分析了
甘肃临泽县内的 4种生态型芦苇，认为不同生态型
的差异是遗传分化的结果。深入开展芦苇遗传学及
分子生物学等研究，从微观角度分析不同生态型芦
苇发生变异的原因，从根本上解释物种发生变异的
机制是十分必要的(王萌等，2010)。
扎龙湿地是黑龙江省芦苇大面积分布的主要区
域，被列入《国际重要湿地》名录，但近年来湿地退化
现象较严重，对芦苇的生长状态和产量产生严重影响
(吴长申，1999；佟守正等，2008)。对扎龙湿地芦苇的
研究多限于生理生态、生物量、生态补水及形态结构
等方面(张爱勤等，2005；王永洁等，2005；杨晓杰等，
2008)。ISSR分子标记能有效地评价物种的亲缘关
系(张利等，2006)，为探讨扎龙湿地芦苇居群的多样
性水平及不同生态型形成的机制，本研究运用 ISSR
分子标记技术，对扎龙芦苇的5个居群进行遗传多样
性分析，以揭示扎龙芦苇的遗传多样性和进化距离，
为合理利用和保护芦苇资源提供科学依据。
1 材料和方法
1．1植物材料
研究材料样地设置按照经纬度分布广泛，不同
功能分区，不同水分梯度原则在扎龙保护区内取 5
个样地，即局址(J)、赵凯(Z)、满代(M)、唐土岗(T)
和克钦湖(K)5个居群，为了反应水分、盐分对芦苇
生长的联合影响，结合实测值将水分和盐分对芦苇
的适宜度分为五级，并用水分与盐分适宜度的乘积
作为各样地中水分和盐分对芦苇的联合影响因子，
水盐适宜度随水盐联合影响因子数值的增加而降低
(张淑萍，2001)，样地信息见表 1。
每个样地选取长势均一相距 20 m以上的植株
各 10株，分别取其顶端嫩叶及叶芽用封口袋装好放
入冰盒，尽快带回实验室放人-80℃冰箱冷冻保存。
表 1 样地信息
Table 1 Th information of plot
Lo
⋯
ngitud Ne
1．2 DNA提取与 PCR扩增
芦苇总 DNA 的提取 采用改进 后 的 CTAB法
(Doyle& Doyle，1987)，每次取 0．5 g干燥的叶片
组织。PCR反应在 MG48十PCR仪(杭州朗基科学仪
器有限公司制造)上进行。经比较和优化确定最佳的
25 j上L反应体系：10×bufer 3．0 tL，M 1．0 tL，
dNTP(10 raM／each)0．65／,L，Primer(10 P mol／／zL)
2．3 L，TemplateDNA(20 ng／p．L)1．0 L，Taq poly—
merase(5 U／uL)0．35 tL，ddH2O 16．7 L。扩增程
序：94℃预变性 7 min；循环，94℃变性 30 S，48～55
℃退火(温度视不同引物而定)45 S，72℃延伸 1 min，
循环 40次；72℃延伸 7 mim最后 4℃保存。
实验所用 ISSR引物均由上海生物工程技术服
务有限公司合成，引物序列参照加拿大哥伦比亚大
学公布的序列设计。每个居群选取 8个模板，在 25
“L反应体系中进行引物筛选及可重复性试验。从
75个引物中选出 lO个扩增条带清晰、反应稳定的
一
攀
能区 m lc 功分 _兰_一
6期 杨晓杰等：扎龙芦苇遗传多样性 ISSR分析 727
引物用于全部 5个居群样本分析(表 2)。
电泳条件：PCR扩增产物在 1．7 的琼脂糖凝
胶上电泳(0．5×TBE，4～5 V／cm)分离，以 DNA
Marker GM335(上海生工 1OO～2 000 bp)为分子标
记，溴化乙锭(EB)染色显带。DNA片段通过凝胶
成像系统(UVP GDS-8000)观察记录。带的有无分
别以 1和 0的格式记录并输入计算机，构成 ISSR
表型数据矩阵输入 PopGene 1．32软件 (Yeh等，
1997)进 行 分 析。分 别 计 算 多 态 位 点 百 分 率
(PPL)、有效等位基因数 Ne、Nei S基因多样性指
数(He)、Shannon信息指数(D、群体总基因多样度
(Ht)、群体内基因多样度(Hs)、群体间的遗传分化
系数(Gst)、遗传距离 (D)和遗传一致度 (D。将
PopGene1．32软件生成的遗传距离数据带入 Sta-
tistica 6．0软件，利用欧氏距离加权配对算术平均
法建立居群遗传关系聚类图。
表 2 ISSR引物序号与序列
Table 2 ISSR primer codes and their sequences
引物序号 引物序列(5 一3 )
Primer codes Primer sequences
AgAgAgAgAgAgAgAgT
AgAgAgAgAgAgAgAgC
AgAgAgAgAgAgAgAgG
AgAgAgAgAgAgAgAgYC
CTCTCTCTCTCTCTCTRA
CACACACACACACACART
CACACACACACACACAAC
ACACACACACACACACYT
HBHAgAgAgAgAgAgAg
CATggTgTTggTCATTgTTCCA
2 结果
2．1遗传变异和遗传多样性
通过 1O条 ISSR引物对 5个芦苇居群共 4O个
个体(每个样地取 8株)进行 ISSR分析(图 1)，共检
测到 96个位点，其中94个是多态的，总多态位点百
分率(PPL)为 97．92 。各居群的多态位点百分率
见表 3。其 中 M 居 群 的 ISSR 多 态 性最 高 为
60．42 ，居 群 Z 的 多 态 位 点 百 分 率 最 低 为
5O．O0 ，各居群的多态性排列顺序为：M>J>K>
T>Z。各引物扩增的条带数在 6～14之间，平均每
个引物扩增的条带数为 9．6条，扩增片段大小全部
在250~1 500 bp之间。ISSR标记检测到较多的多
态条带比率表明这 5个芦苇居群问存在着丰富的遗
传变异。
由表 3可知，遗传多样性参数在各个居群之间
存在一定的差异。居群内的等位基因数(Na)和有
效等位基 因数 (Ne)的平均值分别为 1．5646和
1．3558，变动 范 围分别 为 1．5000～ 1．6042和
1．3111～1．4280。这两个多样性指数均是在 M 居
群最高，而在 Z居群中 Na最低，J居群中 Ne最低。
5个居群间总的等位基因数和有效等位基因数分别
为 1．9792和 1．5302。Nei S基 因多样性指数和
Shannon S信息指数是度量居群遗传多样性的重要
指标，居群间总的 Nei S基 因多样性为 0．3150，
Shannon S信息指数为 0．4783，可见 Shannon S信
息指数反映的遗传多样性比 Nei S的值稍高，但在
居群内，二者表现出的变化趋势是相同的，M>T>
K>J> Z。
M 1 2 3 4 5 6 7 8
图 1 引物 807对赵凯居群(Z)样品扩增产生的谱带
Fig．1 ISSR bands of Zha0kai(Z)p0pulation samples
amplified with primer 807
2．2居群的遗传结构与遗传分化
5个 居群 总的基 因多样度 (Ht)平均值 为
0．3150，居群内的基因多样度(Hs)为 0．2045，居群
间的基因多样性 Dst(Dst=H —Hs)为 0．1105。基
因分化系数 Gst(Gst—Dst／Ht)在 0．0269～1之间，
平均值为 0．3509。说明这 5个芦苇居群发生了一
定的遗传分化。其中居群问的遗传变异占总的遗传
变异的 35．09 ，居群 内的遗传变异 占总变异 的
64．91 ，说明遗传变异主要来自居群内部，基因流
系数 N (N 一0．5(1一Gst)／Gst)平均值为 0．9249，
表明居群间存在着一定程度的基因交流，基因流的
波动范围为 O～l8．1041，大部分的变异发生在居群
内部，小部分的存在于居群间。
2．3 5个居群间遗传一致度(I J与遗传距离(D J
由表 4可知，居群 Z和居群J的遗传距离最大，
为0．2419，即遗传一致度最小0．7851；而遗传距离
728 广 西 植 物 31卷
最小值存在于居群 K和居群 T之间，为 0．1241，最
大遗传一致度为 0．8833。
2．4聚类分析
根据Nei(1973)遗传距离利用UPGMA法对供
试材料进行聚类分析。由图 2可以看出，5个芦苇
句群居群分为两类，K和 T最近聚在一起，然后和
稍远的J聚为一类；M 和Z聚为一类，最后 5个居群
聚在一起 。
表 3 居群间的遗传多样性指标
Table 3 The genetic variation statistics among populations of reed
居群 多态位点数 多态位点百分率 等位基因数 有效等位基因数 Neis基因 shann0n
Population No．of polymorphic loci PPL(％) NP 多样性指数 HP 信息指数 J
M
Z
J
K
T
平均值 Average
总计 Total
0．237O
0．1869
0．1932
0．2015
O．2O38
0．2045
0．315O
表 4 居群间的遗传一致度与遗传距离
Table 4 Genetic identity and Genetic
distance of populations
注：遗传一致度(上三角)，遗传距离(下三角)
Note：Genetic identity(above diagona1)and genetic distance(below
diagona1)
0．24 0．20 0．16 0．1 2 0．08 0 04 0
图 2 聚类分析图
Fig．2 Cluster chart of among five populations
3 讨论
对植物进行分子标记的大量研究显示，同种植
物不同居群之间的遗传相似性与其地理分布直接相
关，地理位置分布较近者，遗传相似度也较高，多数
能聚类合并(庄瑶，2010)，而本研究结果显示地理位
置最近的局址居群 J和赵凯居群 Z并没有首先聚为
一 类，而水盐联合因子较大的唐土岗居群 T和克钦
湖居群 K的遗传距离最小，说明其生境的相似度对
其遗传相似性影响更大，即地理距离最近的居群不
一 定都归为一类，更重要的是其生境的相似度(刘惠
芬等，2004)。
芦苇是广布于世界各地的物种，在对不同生境
的长期适应过程中，个体及种群间发生了分化和变
异，构成了种内丰富的生态型。Clevering(1999)用
遗传多样性作为克隆间等位基因变异的测度，认为
芦苇的动态特征(扩张、衰退等)主要与克隆多样性
和遗传多样性有关。随着人类活动的日益频繁，扎
龙生境的片断化不断加剧，形成～些基因流(Nm一
0．9249)不连续分布的居群，但各居群间分化小，导
致了在居群水平上遗传多样性相对较低；而扎龙芦
苇的种群 内遗传 多样性高于种群间，与郭卫华
(2003)对黄河三角洲芦苇的研究结果一致；扎龙芦
苇的遗传多样性与林文芳(2007)利用 ISSR技术对
甘肃河西走廊临泽县芦苇所进行的遗传多样性分析
结果(PPL一51．52 9／6)相比，多样性水平更高(PPL
一97．92％)。物种具有高水平遗传多样性的因素有
很多，如新种形成、繁育系统、形态突变、多次奠基者
效应等。甘肃省河西走廊部分地区土壤盐渍化严
重，再加上戈壁沙漠的分布，使得植物的生存环境十
分恶劣，由于其 4种生态型的芦苇常同时分布在方
圆5 km。的范围内，所处的生境条件相似甚至相同
(林文芳等，2007)，遗传基础趋于一致。扎龙芦苇居
群内的基因多样性高，能为成功的适应新环境提供
足够的表型变异，所以，应在各居群内进行适量的采
样用于保护研究。由于各个居群间存在一定的遗传
分化，如满代居群(M)遗传多样性水平较高，因此，
建议重点保护遗传多样性水平较高的满代居群；为
6期 杨晓杰等：扎龙芦苇遗传多样性 ISSR分析 729
保护和恢复芦苇种群，遗传多样性水平较低的赵凯
居群，应该给予特别重视。同时为防止瓶颈效应，有
必要对不同居群间进行混合繁殖和相互移栽的方
法，以提高遗传多样性水平(黄姝博等，2010)。在扎
龙一定的空间范围开展表型变异的研究，并进一步基
于居群水平的分子标记研究，可为芦苇生态型的鉴
定、划分提供更为可靠的参考数据，并且可以甄别生
境差异和遗传变异对芦苇不同生态型分化的贡献。
参考文献：
Clevering O八 1999．The effects of litter on growth and plasticity
of Phragmites australis clones originating from infertile，fertile
or eutrophicated habitatsl-J]．Aquatic Bot，64(1)：35—5O
Clevering OA，Lissner J．1999．Taxonomy，chromosome numbers，
clonal diversity and population dynamics of Phragmites australis
rJ]．Aquatic Bot，64(3／4)：185—208
Guo WH(郭卫华)，Zhang SP(张淑萍)，Song BM(宋百敏)，eta1．
2003． Clonal structure of Phragmites australis in wetland
downstream the Yellow River marked by alozymes(黄河下游湿
地芦苇种群克隆结构的等位酶分析)[J]．J Shangdong Univ
(山东大学学报)，38(2)：89—96
Huang SB(黄姝博)，Hu YH(胡永红)，Wu D(吴冬)，et a1．2010．
Genetic diversity of Gnetum parvifolium of Fujian by ISSR
Markers(福建地区小叶买麻藤遗传多样性 ISSR分析)[J]．
Guihaia(广西植物)，30(5)：601—607
Kuhl H，Zemlin R．2000．Increasing the eficiency of reed planta—
tions on stressed lake and river shores by using special clones of
Phragmites australis[刀．Wetlands Ecol Management，8(6)：
415— 424
Liu BB(刘斌 斌)，Xing JJ(刑家 强)，Gong XJ(龚 晓 洁)，et a1．
2009．Genetic differences of different reed ecotypes adapted to
individual habitats(不同生态型芦苇生境适应性的遗传差异)
口]．Acta Prataculturae Sin(草业学报)，18(5)：250-255
Liu HF(刘惠芬)，Gao YB(高玉葆)，Wang D(王丹)，et a1．2004．
Genetic diferentiation in eight populations of Leymus chinensis in
Inner Mongolia steppe(内蒙古典型草原羊草种群遗传分化的
RAPD分析)[J]．Acta Ecol Sin(生态学报)，24(3)：423—431
Lin WF(林文芳)，Chen LJ(陈林娇)，Zhu xY(朱学艺)．2007．An
analysis of genetic diversity of diferent e~types of reed(Phrag—
mites communis)by molecular marker techniques(用分子标记技术
分析不同生态型芦苇的遗传多样性)[J]．J Plant Physiol Molec
Biol(植物生理与分子生物学报)，33(1)：77—84
Liu XW(柳 新伟)．2009．Effect of temperatures on leaf，sheath
and stem decomposition dynamic of Phragmites australis(温度
对芦苇不同部位分解动态的影响)[J]．Ecol Environ Sci(生态
环境学报)，18(3)：1 042—1 044
LiXC(李修仓 )，Hu (胡顺军)，Li YT(李岳 坦)，et a1．2008．
Study on the root distribution and soil water dynamics under
Phragmites arid area(干旱区旱生芦苇根系分布及土壤水分
动态)[J]．Acta Pratacult Sin(草业学报)，17(2)：17—25
Saltonstall K． 2003． Microsatellite variation within and among
North American lineages of Phragmites australis r J]
． Molec
Ecol，12(7)：1 689一 l 702
Tong SZ(佟 守正)，Lv XG(吕宪 国)，Su LY(苏 立 英)，et a1．
2008．Changing process and the impact factors of wetland eco—
system in Zhalong wetland(~L龙湿地生态系统变化过程及影响
因子分析)[J]．Wetland Sci(湿地科学)，6(2)：179—184
Wu CS(吴 长 申)．1999．Natural Resources，Research and Man—
agement in Zhalong National Nature Reserve(扎龙 国家 自然保
护区自然资源研究与管理)[M]．Harbin：Northeast Fore Univ
Press
Wang M(T萌)，Wang YB(王玉彬 )，Chen ZH(陈章和)．2010．
Germplasm resource of Phragmites adans and its application in
Constructed wetlands(芦 苇的种质资 源及在人工湿 地 中的应
用)[J]．Chin J Appl Environ Biol(应用与环境生物学报)，16
(4)：590—595
Wang YQ(王 仁 卿)，Guo WH(郭 卫 华)，Zhang SP(张 淑 萍)．
2000．Research Advances of Phragmites Australis(芦苇研究进
展)[M]．Beijing：Higher education Press
Wang ZQ(王振庆)，Wang LN(王丽娜)，Wu DQ(吴大千)，et a1．
2006．The actuality and trend in the study of Phragmites aust—
ralis inChina(中国芦苇研究现状与趋势)[J]．J Shandong
Fore Sci Tech(山东林业科技)，(6)：85—87
Wang YJ(王永 洁)，Deng W(邓伟)．2005．Regeneration of
Phragmites communis in Zhalong wetland and ecological water
supplement analysis(~L龙湿地芦苇恢复与生态补水分析)I-J]．
F( Invent Plann(林业调查规划)，30(5)：27—30
XvWH(徐卫华)，Ouyang ZY(欧 阳志云)，Iris van Duren，et a1．
2005．Reed land change and its relationship to water level in
Baiyang Lake Since(白洋淀地区近 16年芦苇湿地面积变化与
水位的关系)[J]．J Soil Water Conserv(水土保持学报)，l9
(4)：181—189
Yang XJ(杨晓杰)，Cheng JC(程 加春)，Li XH(李学花)，et a1．
2008．The Relationship between microstructure of reed s leaves
and Ecological environment of Zhalong Wetland(扎龙湿地芦 苇
叶片结构与生境关系的研究)[J]．Heilongjiang Environ J(黑
龙江环境通报)，32(4)：36—4O
Zhang AQ(张爱勤)，Gao ML(高美玲)，Zhao H(赵宏)．2005．
Research on relationsh of reed growth and water in Zalong wet—
land(扎龙 湿 地芦 苇生 长与 水 因子关 系 的研 究)[J]．Hei—
longjiang Environ J(黑龙江环境通报)，29(4)：29—3O
ZhaoKF(赵可 夫 )，Feng LT(冯 立 田)，Zhang SQ(张 圣 强 )．
1998．Adaptive physiology of different ecotypes of Phragmites
Communis to salinity in the Yelow River Delta(黄河三角洲不
同生态型芦苇对盐度适应生理的研究)[J]．Acta Ecol Sin(生
态学报)，18(5)：465—469
Zhang L(张利 )，Zhou YH(周永 红)，Ding CB(丁春邦)，et a1．
2006．Study on genetic variation of genus Kengyilia by ISSR
markers(应用 ISSR标记研究仲彬草属植物的遗传变异)I-J]．
Guihaia(广西植物)，26(4)：375—380
Zhang SP(张淑萍)．2001．Study on molecular ecology of Phrag—
mites australis(芦苇分子生态学研究)[D]．PhD dissertation．
Harbin：Northeast Forestry University
Zhuang Y(庄瑶)，Sun YX(孙一香)，Wang ZS(王中生)，et a1．
2010．Research advances in ecotypes of Phragmites australi (芦
苇生态型研究进展)[J]．Acta Ecol Sin(生态学报)，30(8)：
2 173—2】8】