全 文 ：反相高效液相色谱法测定龙胆科藏药中齐墩果酸和熊果酸的含量
吴江1 , 祝存恩2 , 林鹏程2＊　(1.青海民族学院科技处 ,青海西宁 810007;2.青海民族学院化学系 ,青海西宁 810007)
摘要　建立了反相高效液相色谱法同时测定龙胆科藏药中齐墩果酸和熊果酸含量的方法 ,即采用Kromasil C18(250 mm×4.6mm, 5μm)色
谱柱 ,以流动相甲醇和水(含 0.04%磷酸)87∶13的比例线性洗脱 ,流速 0.8 ml/min ,检测波长 215 nm ,柱温 30 ℃。结果表明:2种成分均达
到基线分离 ,齐墩果酸的线性范围为0.055～ 0.550μg(r=0.9998),熊果酸的线性范围为0.041～ 0.410μg(r=0.9992);齐墩果酸的平均回
收率为 99.3%(RSD=0.63%),熊果酸的平均回收率为 97.6%(RSD=1.6%)。该方法简便、快速 ,结果准确 、可靠。
关键词　反相高效液相色谱法;齐墩果酸;熊果酸;龙胆科;含量
中图分类号　O657.7+2　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2006)11-2325-02
Determination of Content Ursolic Acid andOleanolic Acid of Tebitan Herbal Medicine Gentianaceae by RP-HPLC
WU Jiang et al　(The Department of Science and Technology of Qinhai Nationlities University , Xining , Qinhai 810007)
Abstract　 To establish a quantitative method of determination of ursolic acid and oleanolic acid of Tebitan herbal medicineGentianaceae simultaneously
by RP-HPLC , its samples were separated with the column of Kromasil C18(250 mm×4.6 mm , 5μm)which was eluted with methanol and water(0.04%
phosphoric acid)in 87∶13 with detected wavelength at 215 nm , flow rate at 0.8 ml/min , column temperature at 30 ℃.The results indicated two com-
pounds were basically insolated.The linear ranges of ursolic acid and oleanolic acid were 0.041 ～ 0.410μg(r=0.999 2), 0.055 ～ 0.550μg(r=
0.999 8)respectively;the average recoveries were 97.6%(RSD=1.6%), 99.3%(RSD=0.63%)respectively.The method was rapid and precise.
Key words　RP-HPLC;Oleanolic acid;Ursolic acid;Gentianaceae;Content
　　青藏高原龙胆科(Gentianaceae)植物是藏医广泛用来治
疗肝 、胆疾病的药物。其主要化学成分有番木鳖酸(loganic
acid)、獐牙菜苦甙(swertiamarin)、龙胆苦甙(gentiopicroside)、芒
果甙(mangiferin)、齐墩果酸(oleanolic acid)、熊果酸(ursolic
acid)等[ 1] 。熊果酸是一种存在于天然植物中的三萜类化合
物 ,具有镇静 、抗炎 、抗菌 、抗溃疡 、降低血糖等多种生物学效
应;齐墩果酸具有护肝 、抗炎 、强心利尿 、抗肿瘤等作用[ 2-4] 。
目前可同时测定龙胆科藏药中齐墩果酸 、熊果酸含量的方法
尚未见报道 。笔者建立了用反相高效液相色谱法同时测定 9
种龙胆科藏药中上述 2种有效成分含量的方法 ,对全面评价
药材质量及新药源的研究与开发具有重要意义。
1　材料与方法
1.1　材料　红直獐牙菜(Swertia erythrosticta Maxim.),采自青
海互助北山林场;抱茎獐牙菜(S .franchetiana H.Smith),采
自青海西宁;线叶龙胆(Gentiana farrer Balf.f.),采自青海祁
连县;四数獐牙菜(S .tetraptera Maxim.),采自青海互助北山
林场;祁连獐牙菜(S.przewalskii Pissjauk),采自青海祁连县;
川西獐牙菜(S .mussotii Franch.),采自青海省玉树州;湿生扁
蕾[ Gentianopsis pacedosa (manro)Ma.] ,采自青海省麦秀林场;
椭圆叶花锚(Halenia ellipitica D.Don),采自青海省麦秀林场;
辐花肋柱花[ Lomatogonium rotatum(L.)Fries ex Nym] ,采自青
海省互助北山林场。
1.2　仪器与试剂　Agilent 1100高效液相色谱仪(配置:手动
进样器 ,在线脱气机 ,高压二元梯度泵 ,恒温柱温箱 ,DAD检
测器 ,Agilent 1100色谱工作站),KromasilC18(4.6mm×250mm ,
5μm)色谱柱;KQ3200超声波清洗器(昆仑超声仪器有限公
司);SZ-97自动三重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂)。
甲醇为色谱纯(山东禹王实业有限公司禹城化工厂);水
为自制三重蒸馏水;磷酸(AR)。
齐墩果酸和熊果酸对照品(购自中国药品生物制品检定所)。
基金项目　青海民族学院重点课题资助项目(2005-N-11)。
作者简介　吴江(1963-),男 ,浙江绍兴人 ,副教授 ,从事分析化学 、药
物分析的教学与科研工作。 ＊通讯作者。
收稿日期　2006-03-08
1.3　溶液配置
1.3.1　对照品储备液。精密称取对照品齐墩果酸 2.20mg 、
熊果酸 1.64 mg ,分别置于 1 ml容量瓶中 ,以甲醇溶解并定
容 ,配置成相应浓度的对照品储备液 ,使用时稀释成所需浓度。
1.3.2　样品溶液。精密称取粉碎至 80目的 9种样品各
0.5 g ,加入甲醇 10 ml ,超声提取 40min后抽滤 ,以 1ml甲醇
分 2次洗涤滤渣 ,合并滤液 ,滤渣重复操作 1次 ,滤液于 25
ml容量瓶中定容 ,过 0.45μm微孔滤膜 ,在选定的色谱条件
下测定有效成分的含量。
1.4　方法
1.4.1　色谱条件。Kromasil C18(4.6mm×250mm ,5μm)色谱
柱 ,流动相:甲醇和水(含 0.04%的磷酸)的比例为87∶13 ,流
速 0.8ml/min ,检测波长 215 nm ,柱温 30 ℃。在该色谱条件
下 ,齐墩果酸 、熊果酸能达到基线分离 ,保留时间分别为
23.76、25.10min(图 1、2)。
图 1　熊果酸和齐墩果酸混合对照品的 HPLC图谱
1.4.2　线性关系的考察。取熊果酸和齐墩果酸对照品储
备液 ,用流动相溶解并稀释成含熊果酸 0.016 4mg/ml、齐墩
果酸 0.022 0 mg/ml 的混合溶液 ,分别进样 2.5、5.0 、7.5、
10.0 、12.5、15.0、20.0 、25.0 μl ,按上述色谱条件测定峰面
积 。以对照品的绝对进样量为横坐标(X),峰面积的积分
值为纵坐标(Y),求得标准曲线的回归方程。熊果酸:Y =
821.48X -5.516 , r =0.999 2 ,进样量在 0.041 ～ 0.410μg的
范围内有良好的线性关系;齐墩果酸:Y =882.43X -43.69 ,
安徽农业科学 , Journal of Anhui Agri.Sci.2006 ,34(11):2325-2326　　　　　　　　　　　　　　　　　　责任编辑　金琼琼　责任校对　金琼琼
DOI :10.13989/j.cnki.0517-6611.2006.11.007
图 2　湿生扁蕾样品的 HPLC图谱
r=0.9998 ,进样量在 0.055 ～ 0.550μg的范围内有良好的线
性关系 。
1.4.3　检测限 。在选定的色谱条件下 ,以 0.440 mg/ml的
齐墩果酸 、0.164mg/ml的熊果酸标准溶液逐级稀释 ,每次
进样 5μl ,当信噪比 S/N=3时 ,测得齐墩果酸 、熊果酸的最
低检测限分别为 0.33、0.123 ng。
1.4.4　精密度试验。取 0.044 0 mg/ml齐墩果酸 、0.016 4
mg/ml 熊果酸 ,在选定的色谱条件下测定色谱峰的峰面积 ,
计算得 RSD 分别为 0.72%、0.90%(n=6)。表明仪器精密
度良好 。
1.4.5　回收率试验。精密称取已知含量的供试品约 1 g , 1
式 10份。前 5份分别精密加入熊果酸对照品溶液 ,后 5份
分别精密加入齐墩果酸对照品溶液 ,依“1.3.2”法提取 ,在
选定色谱条件下测定 ,计算回收率 ,结果见表 1 。
　　表1 加样回收率试验结果(n=5)
样品
种类
样品含量
mg
加入量
mg
测定量
mg
回收率
%
平均回收率
%
RSD
%
熊果酸　 1.017 5 0.8651 1.879 99.63 97.59 1.57
1.016 4 0.8651 1.851 96.47
1.018 8 0.8651 1.874 98.86
1.015 3 0.8651 1.850 96.48
1.019 2 0.8651 1.854 96.51
齐墩果酸 0.851 0 0.7239 1.573 99.67 99.25 0.63
0.850 8 0.7239 1.565 98.72
0.852 1 0.7239 1.575 99.81
0.853 3 0.7239 1.574 99.61
0.850 9 0.7239 1.564 98.44
2　结果与分析
2.1　龙胆科藏药样品中齐墩果酸和熊果酸的含量　分别
移取“1.3.2”项下的样品溶液 10μl进行分析 ,并测定峰面积
的积分值 ,按外标法计算 ,得 9种样品中齐墩果酸和熊果酸
的含量 ,结果见表 2。
　　表 2 龙胆科藏药中齐墩果酸和熊果酸的含量(n=3)
样品　　　 称样量
g
含量∥%
齐墩果酸 熊果酸
红直獐牙菜 0.5001 0.037 0 未检出
抱茎獐牙菜 0.5003 0.120 7 0.0601
线叶龙胆　 0.5000 0.308 6 0.1492
四数獐牙菜 0.5003 0.131 5 0.1447
祁连獐牙菜 0.5001 0.173 0 0.1309
川西獐牙菜 0.5001 0.091 0 未检出
湿生扁蕾　 0.5007 0.267 4 0.2002
椭圆叶花锚 0.5002 0.246 6 未检出
辐花肋柱花 0.5005 0.330 4 未检出
　　由表 2可见 ,各龙胆科植物所含齐墩果酸和熊果酸含
量不同 ,齐墩果酸含量以辐花肋柱花最高 ,熊果酸含量以湿
生扁蕾最高。
2.2　检测波长的确定　利用 DAD检测器在波长 190 ～ 400
nm内扫描其吸收光谱 ,各对照品均在波长 215 nm处有较高
的吸收 ,结合文献[ 5 ,6] ,确定检测波长为 215 nm 。
2.3　流动相的选择　齐墩果酸和熊果酸分离困难 ,经试
验 ,当在水中加入 0.04%的磷酸时可提高两者的分离度。
故选择甲醇和含 0.04%磷酸的水作为流动相。
3　小结
建立了反相高效液相色谱法同时测定龙胆科藏药中齐
墩果酸和熊果酸含量的方法 ,即采用Kromasil C18(250 mm×
4.6mm , 5μm)色谱柱 ,以流动相甲醇和水(含 0.04%磷酸)
87∶13的比例线性洗脱 ,流速 0.8 ml/min ,检测波长 215 nm ,
柱温 30 ℃。结果表明:2种成分均达到基线分离 ,齐墩果酸
的线性范围为 0.055 ～ 0.550μg(r=0.999 8),熊果酸的线性
范围为 0.041～ 0.410μg(r=0.9992);齐墩果酸的平均回收
率为 99.3%(RSD =0.63%),熊果酸的平均回收率为97.6%
(RSD =1.6%)。该方法具有简便 、快速 ,结果准确 、可靠等
优点 ,对于评价药材质量与新药源的研究有重要意义。
参考文献
[ 1] JACR D B.药物化学方面的最新进展 , 4喹诺酮类杀菌剂[ J] .国外医
学:药学分册 ,1987, 14(5):273-276.
[ 2] 沈红梅 ,程涛 ,乔传桌 ,等.乌梅的体外抗肿瘤活性及免疫调节作用初
探[ J] .中国药学杂志 ,1995, 20(6):365-368.
[ 3] 林鹏程 ,冶兆辉,卢永昌 ,等.藏药秦艽、麻花艽中落干酸和龙胆苦甙
的HPLC法含量测定[ J] .中药材 ,2004,27(11):819-821.
[ 4] 高光跃 ,李鸣 ,冯毓秀 ,等.11种獐牙菜及近缘植物中有效成分的高效
液相色谱测定[ J] .药学学报 ,1994, 29(12):910-914.[ 5] 袁珂,董留民.HPLC法测定冬凌草中熊果酸、齐墩果酸的含量[ J] .中
国实验方剂学杂志 ,1998, 4(6):1-2.
[ 6] 胡凤祖 ,宋娅莉,刘梅 ,等.青藏高原龙胆科植物药用有效成分的高效
液相色谱分析[ J] .色谱, 2003,21(1):63-65.
　　本刊提示　参考文献只列主要的、公开发表的文献 ,序号按文中出现先后编排 。著录格式(含标点)如下:(1)期刊———
作者(不超过 3人者全部写出 ,超过者只写前 3位 ,后加“等”).文章题名[ J] .期刊名 ,年份 ,卷(期):起止页码.(2)图书———编
著者.书名[M] .版次(第一版不写).出版地:出版者 ,出版年:起止页码.(3)论文集———析出文献作者.题名[C] //主编.论文
集名.出版地:出版者 ,出版年:起止页码 。
2326 　　　　　　　　　　　　　安徽农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2006年