全 文 ：兰坪铅锌尾矿区豆科根瘤菌遗传多样性
ARDRA分析*
李 彪 熊 智
＊＊
刘绍雄 缪福俊 孙 浩
(西南林业大学，西南山地森林资源保护与利用省部共建教育部重点实验室，昆明 650224)
摘 要 通过 16S rDNA扩增产物限制性片段长度多态性分析(ARDRA)，对兰坪铅锌尾矿
区豆科植物根瘤菌的遗传多样性进行了研究。采用限制性内切酶 HaeⅢ、HindⅢ、HinfⅠ和
TaqⅠ对 16S rDNA 扩增产物进行了酶切分型，根据 ARDRA 酶切图谱的不同，进行树状聚
类。结果表明:49 株根瘤菌在 40%的相似水平上按氮含量不同及铅锌含量的采集地不同
分别聚为 OTU1、OTU2 和 OTU3 3 个群，说明根瘤菌的遗传多样性及分布与土壤中的氮含量
和铅锌含量有关。代表菌株的 16S rDNA 测序结果分析表明，它们在系统发育树上属于
Rhizobium sp．、Sinorhizobium sp．和 Bradyrhizobium sp． 3 个系统发育分支，进一步说明兰坪
铅锌尾矿区豆科植物根瘤菌多样性较丰富。
关键词 ARDRA;根瘤菌;遗传多样性;铅锌尾矿
中图分类号 Q933 文献标识码 A 文章编号 1000－4890(2012)1－0112－07
ARDRA analysis of genetic diversity of rhizobia isolated from the nodules of leguminous
plants in Lanping lead-zinc mine tailings of Yunnan Province，Southwest China． LI Biao，
XIONG Zhi＊＊，LIU Shao-xiong，MIAO Fu-jun，SUN Hao (Key Laboratory for Forest Resources
Conservation and Use in the Southwest Mountains of China，Ministry of Education，Southwest For-
estry University，Kunming 650224，China)． Chinese Journal of Ecology，2012，31(1) :112－118．
Abstract:By the methods of 16S rDNA cloning，amplified ribosomal DNA restriction analysis
(ARDRA) ，and sequence homology comparison，this paper studied the genetic diversity of rhizo-
bia isolated from the nodules of leguminous plants in Lanping lead-zinc mining tailings of Yun-
nan． Sequence analysis revealed that among the 49 positive clones in the 16S rDNA library，3
operational taxonomic units (OTUs)were identified，based on the similarity of 40% ARDRA
banding profiles at the sampling sites where the nitrogen，Pb2+，Zn2+ contents were different，
suggesting that the genetic diversity and distribution of rhizobia could be related to the soil nitro-
gen，Pb2+，and Zn2+ contents． Diverse phyla of the representative strains in the 16S rDNA library
were belonged to the three phylogenetic branches of Rhizobium sp．，Sinorhizobium sp．，and Bra-
dyrhizobium sp． The results suggested that there was a higher genetic diversity of rhizobia isolated
from the nodules of leguminous plants in the Lanping lead-zinc mine tailings of Yunna．
Key words:ARDRA;rhizobium;genetic diversity;lead-zinc mine tailings．
* 国家自然科学基金项目(30860067)和西南林业大学大型仪器设
备共享平台资助。
＊＊通讯作者 E-mail:zhix65． swfc@ gmail． com
收稿日期:2011-06-11 接受日期:2011-10-12
兰坪铅锌矿山经过数十年大规模的开采，矿区
山体中空，树木稀少，环境恶化，水土流失(新华网
云南频道，2006)。尾矿废弃地植被恢复的最重要
限制因子之一是重金属毒性和养分不足，而氮素的
极端不足又是养分不足的核心问题(Sorensen ＆ Fr-
esquez，1991)。目前，研究能共生固氮的豆科植物
作为重金属尾矿区的先锋植物是热点。
研究表明，根据最高的忍耐浓度，根瘤菌对重金
属的敏感顺序为 Azorhizobium ＞Rhizobium ＞Mesorhi-
zobium ＞ Sinorhizobium ＞ Bradyrhizobium (Matsuda et
al．，2002) ，这给如何通过接种根瘤菌来提高共生
体系的抗逆性提供了很大帮助。另外，有专家还开
展了一些有关重金属对不同豆科植物如苜蓿、三叶
生态学杂志 Chinese Journal of Ecology 2012，31(1) :112－118
DOI:10.13292/j.1000-4890.2012.0011
草等与根瘤菌共生固氮影响的研究(Biro et al．，
1998)。缪福俊等(2010a，2011)从兰坪铅锌尾矿区
筛选到 2 株高耐性菌株 LB3 和 LZ5，与种子拌种可
促进种子在铅锌胁迫下种子的萌发及生长能力，增
强种子抗逆性。同时从该尾矿区分到 1 株耐酸碱和
1 株耐受高温的根瘤菌，大多数菌株对铅、锌单盐和
双盐具有良好的耐性能力(缪福俊等，2010b)。研
究表明，在自然界中存在一些对尾矿废弃地环境条
件具耐(抗)性的豆科植物-根瘤菌共生体系，通过豆
科植物和根瘤菌遗传多样性或生态多样性来适应尾
矿废弃地的极端环境(陈文峰等，2004)。目前，根
瘤菌用于尾矿区植被恢复的研究几乎限于实验室阶
段，今后应该开展对根瘤菌与植物共生后对尾矿区
重金属的富集以及对尾矿区土壤改良方面的研究。
扩增 rDNA限制性酶切片段分析法(amplified ri-
bosomal DNA restriction analysis，ARDRA)是将 PCR
技术和 RFLP技术相结合衍生的分子技术，目前该方
法已广泛应用于多种生态系统中微生物多样性的研
究(吴少慧，2001;Kemp ＆ Aller，2004;Coton et al．，
2005;陈敏和方序，2006;李潞滨等，2008;宁华等，
2008;Paolo et al．，2009)。为了减少测序的数量，往
往可采用 ARDRA对文库进行酶切分型，然后根据分
型结果对代表菌株进行测序(Sun et al．，2008)。
本研究应用 ARDRA技术对兰坪铅锌尾矿区豆
科植物根瘤菌进行多样性分析，获得有关该区豆科
植物根瘤菌遗传多样性的初步信息，为兰坪铅锌尾
矿豆科植物-根瘤菌共生关系改良土壤和植被与生
态恢复提供科学依据。
1 材料与方法
1. 1 尾矿土壤的采集及分析
采用棋盘式采样法采集土壤样品(缪福俊等，
2011) ，分别选取 3 处采样:1)中心 2 个采样点;2)
边缘 4 个采样点;3)边缘到中心的中间区域 4 个采
样点(图 1) ，采集土壤表层 5 ～ 10 cm 的土样，带回
实验室进行分析。采用凯氏定氮法测定土壤氮含
量，火焰原子吸收分光光度法测定铅、锌含量。
1. 2 根瘤菌的分离
研究的菌株分离自兰坪铅锌尾矿区自然发生的
9 种优势豆科植物根瘤。表面消毒后用无菌玻棒压
破根瘤，稀释根瘤悬液在 YMA 平板上涂布分离，28
℃下培养;根瘤菌菌落表面光滑、突起、有多糖产生，
纯化后革兰氏染色镜检阴性、无芽孢、短杆状，YMA
图 1 土壤采集点示意图
Fig． 1 Location of soil sampling spots
斜面接种保藏，根瘤菌用刚果红染色初步判断为根
瘤菌(Vincent，1970)。
1. 3 DNA提取
DNA的提取用细菌 DNA 提取试剂盒(上海天
根)。
1. 4 16S rDNA扩增
1)引物选择。正向引物:5’-AGA GTT TGA TCC
TGG CTC AGA ACG AAC GCT-3’;反向引物:5’-TAC
GGC TAC CTT GTT ACG ACT TCA CCC C-3’(Weis-
burg et al．，1991) (由上海生工生物工程有限公司合
成)。2)反应体系:正向引物10 μmol·L－1、反向引物
10 μmol·L－1、10×Bμffer 5 μL、MgCl2 75 μmol·L
－1、
dNTP 3. 125 μmol·L－1、DNA 模板 2. 5 ng、Taq DNA
Polymerase 2. 5 mol·L－1、加灭菌水至 50 μL(Taq
DNA Polymerase 在预变性之后 4 ℃冰浴上加入)。
3)反应程序。预变性:94 ℃ 5 min，变性:94 ℃ 1
min，退火:56 ℃ 1 min，延伸:72 ℃ 3 min，30 cycles，
终延伸:72℃ 5min。4)PCR 产物检测:PCR 产物 10
μL用 EB染色的浓度为 0. 8%的琼脂糖凝胶电泳检
测，用凝胶成像仪照相。
1. 5 16S rDNA限制性酶切
本实验用了 4 种限制性内切酶(按高频和低频
分为两组)分别对 16S rDNA 扩增产物进行酶切，首
先用低频限制性内切酶组合(HaeⅢ + HindⅢ)对上
述的 16S rDNA扩增产物进行酶切，其反应体系为:
HaeⅢ 15 U;HindⅢ 15 U;10×M Buffer 2 μL;DNA 10
μL (≤1 μg) ;灭菌水补充到 20 μL。37 ℃下过夜酶
切后，用 EB染色的浓度为 0. 8%的琼脂糖凝胶分离
酶切片段。同时采用高频限制性内切酶组合(Hinf
Ⅰ+TaqⅠ)对上述的 16S rDNA扩增产物进行酶切，
其反应体系为:Hinf Ⅰ 15 U;Taq Ⅰ 15 U;10×TaqⅠ
Basal Buffer 2 μL;0. 1% BSA 2 μL;DNA 10 μL (≤1
μg) ;灭菌水补充到 20 μL。37 ℃下反应 2 ～ 3 h 后
311李 彪等:兰坪铅锌尾矿区豆科根瘤菌遗传多样性 ARDRA分析
再于 65 ℃下反应 2 h，用 EB染色的浓度为 0. 8%的
琼脂糖凝胶分离酶切片段。
1. 6 数据分析
用 Total Lab TL100 凝胶图像分析软件对琼脂
糖凝胶电泳图谱进行分析，将电泳图谱上出现的
DNA按“出现”记为 1，“不出现”记为 0，进行统计
(＜100 bp的片断比较模糊，难以估算它们的片断大
小，所以在本试验中未被考虑)。根据统计结果，采
用 POPGENE Version 1. 31 软件(Yeh et al．，1997)
对全部家系以及单个家系分别计算了多态位点百分
率(percentage of polymorphic bands，PPB)、各个水
平的 Shannon 指数(I) (Lewontin，1972) ，此外还计
算了基因多样性(H)以及居群内各家系间的 Nei 遗
传距离(Nei，1978) ，并 MVSP软件构建树状聚类图。
根据聚类树选举代表菌株测序后用 MEGA 4 软件进
行系统发育树构建，以确定代表菌株的系统发育
地位。
2 结果与分析
2. 1 根瘤菌采集地植被及土壤分析结果
从表 1 可以看出，3 个采样地的土壤中总氮、铅
离子、锌离子的含量有所差异，其总氮含量的大小顺
序是哨上尾矿坝北坡＞哨上尾矿坝南坡＞尾矿后南
厂，铅锌离子含量的大小顺序是尾矿后南厂＞哨上
尾矿坝南坡＞哨上尾矿坝北坡。哨上尾矿坝北坡的
植物种类和数量最多，其次是哨上尾矿坝南坡，最少
的是尾矿后南;同样地，从哨上尾矿坝北坡分离得到
的菌株数量最多，其次是哨上尾矿坝南坡，最少的是
尾矿后南厂。
2. 2 核糖体 DNA酶切(ARDRA)结果
将 49 株根瘤菌纯培养物分别制备 PCR 简易模
板，扩增近全长的 16S rDNA，并用限制性内切酶
HindⅢ及 HaeⅢ对 PCR 产物进行 ARDRA(amplified
rDNA restriction analysis)多态性分析。结果显示，通
用引物对根瘤菌的 DNA 进行 16S rDNA 扩增后，均
有 1500 bp左右的扩增条带(图 2)。
从 49 株根瘤菌的 16S rDNA PCR 产物经低频
限制性内切酶组合(HindⅢ+HaeⅢ)进行酶切后的
琼脂糖凝胶电泳图谱(图 3A)可看出，供试的 49 株
根瘤菌中，除 SWFU 71、SWFU 39、SWFU 78、SWFU
55、SWFU 08、SWFU 52、SWFU 51、SWFU 36 这 8 株
外，其余菌株均在600 bp处有共有带，此时所获酶
表 1 兰坪铅锌尾矿区自然生长的豆科植物根瘤菌
Table 1 Leguminous rhizobia grown in natural environments in lead-zinc mining tailings of Lanping
菌株 寄主植物 采集地 土壤氮含量
(g·kg－1)
土壤铅含量
(g·kg－1)
土壤锌含量
(g·kg－1)
SWFU08、SWFU18、SWFU61、
SWFU30、SWFU35、SWFU37、
SWFU64、SWFU66、SWFU70、
SWFU72、SWFU77、SWFU78、
SWFU79、SWFU56
三叶草(Trifolium repens L. ) 哨上尾矿坝北坡 1. 89±0. 13 3. 5±0. 1 3. 7±0. 4
SWFU01、SWFU19、SWFU38 三叶草 哨上尾矿坝南坡 0. 19±0. 02 4. 5±0. 2 9. 3±1. 0
SWFU02、SWFU11、SWFU12、
SWFU13、SWFU14、SWFU24、
SWFU39、SWFU41、SWFU55
白刺花 (Sophora vicifolia Hance) 哨上尾矿坝北坡 1. 89±0. 13 3. 5±0. 1 3. 7±0. 4
SWFU03、SWFU10、SWFU17、
SWFU52、SWFU53、SWFU71
美丽胡枝子 (Lespedza formosa
(Vog. )Koehne)
哨上尾矿坝北坡 1. 89±0. 13 3. 5±0. 1 3. 7±0. 4
SWFU40、SWFU73 美丽胡枝子 哨上尾矿坝南坡 0. 19±0. 02 4. 5±0. 2 9. 3±1. 0
SWFU04 蝴蝶花豆 (Clitoria ternatea L. ) 哨上尾矿坝北坡 1. 89±0. 13 3. 5±0. 1 3. 7±0. 4
SWFU05 丁葵草 (Zornia diphylla Pers. ) 哨上尾矿坝北坡 1. 89±0. 13 3. 5±0. 1 3. 7±0. 4
SWFU09 黄槐决明 (Cassia suffruticosa
Koen. ex Roth)
哨上尾矿坝北坡 1. 89±0. 13 3. 5±0. 1 3. 7±0. 4
SWFU16、SWFU36 长波叶山蚂蝗 (Desmodium se-
quax Wall)
哨上尾矿坝北坡 1. 89±0. 13 3. 5±0. 1 3. 7±0. 4
SWFU46、SWFU60、SWFU65、
SWFU07、SWFU44
野豇豆 (Vigna vexillata (Linn. )
Rich)
哨上尾矿坝北坡 1. 89±0. 13 3. 5±0. 1 3. 7±0. 4
SWFU51、SWFU28 三 点 金 (Desmodium triflorum
(L. )DC)
尾矿后南厂 0. 09±0. 01 5. 2±0. 4 11. 2±1. 5
SWFU48、SWFU57、SWFU06 三点金 哨上尾矿坝北坡 1. 89±0. 13 3. 5±0. 1 3. 7±0. 4
平均值±标准差。
411 生态学杂志 第 31 卷 第 1 期
切片段较少，重复性好，稀有酶切位点，无法涵盖所
有样本，不能充分反映兰坪铅锌尾矿区豆科植物根
瘤菌多样性。所以本实验又选了另外 2 种高频限制
性内切酶(HinfⅠ+TaqⅠ)对 16S rDNA PCR 进行酶
切，结果显示 HinfⅠ及 TaqⅠ对 16S rDNA PCR进行
酶切后的琼脂糖凝胶电泳图谱(图 3B)与 HindⅢ及
HaeⅢ酶切后的完全不相同，没有明显的共有带，条
带丰富，多态性良好，基本涵盖了所有样本，充分反
映了兰坪铅锌尾矿区豆科植物根瘤菌多样性。
2. 3 豆科植物根瘤菌多样性
2. 3. 1 群居多样性 Nei和 Shannon遗传多样性指
数是进行居群遗传变异量度的指标，它们的计算结
果不受各居群样品数目的影响。通过 POPGENE 进
行多样性的计算和比较(表 2)表明，供试的 49 株根
瘤菌分别来自兰坪铅锌尾矿区三叶草等 9 种豆科植
物，按寄主将它们分为 9 个居群。9 个居群的多态
位点百分率(PPB)、基因多样性指数(H)及 Shannon
指数(I)如表 2。
表 2 表明，来自白刺花的群 1 的多态位点百分
率没有达到 90%，可能是因为该群的寄主和采样地
都相同，菌株或寄主植物之间有一定的基因交流，遗
传基因相似。寄主为长波叶山蚂蝗的群 4、寄主植
物为野豇豆的群 5 和寄主植物为三点金的群 6，它
们的多态位点百分率均没有达到 90%，可能的原因
与群 1 的相似。而寄主植物为三叶草的群 2 和寄主
植物为美丽胡枝子的群 3，它们的多态位点百分率
均在 90%以上，说明这 2 个群内的菌株 DNA 酶切
后条带多样性丰富，菌株间的遗传差异较大，其可能
图 2 部分扩增出的 16S rDNA片段
Fig． 2 Part of the 16S rDNA fragments amplified
的原因是采样地不同，寄主植物或菌株之间基因交
流较少，由于采样地的环境不同，菌株之间存在遗传
差异。居群 7、居群 8 和居群 9 由于每群只有 1 个样
本，所以没有多态位点百分率(PPB)、基因多样性指
数(H)及 Shannon指数(I)。
2. 3. 2 聚类结果 为了更明确地分析兰坪铅锌尾
矿区豆科植物根瘤菌的多样性，对 ARDAR 结果构
建了树状聚类图(图 4)。由图 4 可见，分别来自尾
矿后南厂、哨上尾矿坝南坡和哨上尾矿坝北坡 3 个
不同采样地的 49 株根瘤菌在 40%的相似水平上分
为 3 个操作分类单元(operational taxonomic unit，
OTU) ，且 OTU1、OTU2 及 OTU3 的采样地土壤平均
总氮含量分别为 0. 097、0. 192、1. 895 g·kg－1，说明
根瘤菌的遗传类型与土壤环境中的氮含量有关。同
样地，OTU1、OTU2 及 OTU3 的采样地土壤中铅锌平
均含量分别为 0. 52%和 1. 12%、0. 45%和 0. 93%、
图 3 部分根瘤菌的 16S rDNA PCR产物经 HindⅢ、HaeⅢ及 HinfⅠ、TaqⅠ酶切后的电泳图谱
Fig． 3 Agarose gel electrophoresisof amplified 16S rDNAs digested with HindⅢ，HaeⅢ and HinfⅠ，TaqⅠ from several rhi-
zobia
511李 彪等:兰坪铅锌尾矿区豆科根瘤菌遗传多样性 ARDRA分析
表 2 供试菌株群居遗传多样性
Table 2 Clusters’genetic diversity of strains used
群 样品数 寄主植物 多态位点百分率
(%)
Nei＇遗传指数
(H)
Shannon指数
(I)
1 9 Sophora vicifolia Hance 82. 4 0. 23 0. 37
2 17 Trifolium repens L. 95. 8 0. 24 0. 39
3 8 Lespedza formosa (Vog. )Koehne 91. 2 0. 22 0. 35
4 2 Desmodium sequax Wall 67. 7 0. 21 0. 33
5 6 Vigna vexillata (Linn. )Rich 73. 8 0. 22 0. 34
6 4 Desmodium triflorum (L. )DC 78. 2 0. 22 0. 34
7 1 Clitoria ternatea L. － － －
8 1 Zornia diphylla Pers. － － －
9 1 Cassia suffruticosa Koen. ex Roth － － －
图 4 ARDRA结果的树状聚类图
Fig． 4 Results of ARDRA in dendrogram
0. 35%和 0. 37%，OTU1、OTU2 及 OTU3 的采样地土
壤中铅锌平均含量大小顺序为 OTU1＞OTU2＞OTU3，
OTU1、OTU2 和 OTU3 3 个操作分类单元中包括的
菌株数量分别为 2 株、5 株和 42 株，说明采样地中
的铅锌含量越高，菌株的丰富度越低，高浓度的铅锌
对根瘤菌的共生关系的建立造成了极大的影响。
2. 3. 3 代表菌株测序结果 从 GenBank 中获取
Rhizobium、Sinorhizobium和 Bradyrhizobium 已知种的
部分菌株序列，与代表菌株的序列进行比较，以确定
兰坪铅锌尾矿区豆科根瘤菌的系统发育地位。应用
BioEdit、Clustalx和 MEGA 4. 1 等软件构建了供试菌
株与参比菌株的系统发育关系树状图(图 5)。从系
统发育树状图上看，选举的代表菌株属于不同的归
属，说明兰坪铅锌尾矿区豆科植物根瘤菌多样性很
丰富。来自不同采样地相同寄主(三叶草)的代表
菌株 SWFU64、SWFU01 和 SWFU70 均属于 Rhizobi-
um sp. 系统发育分支，说明在不同铅锌含量的生境
中 Rhizobium sp. 可以与寄主形成共生关系，由于这
3 株菌属于不同种，说明同一寄主中根瘤菌存在种
的多样性。来自不同采样地相同寄主(美丽胡枝
子)的代表菌株 SWFU71 和 SWFU40 均属于 Brady-
rhizobium sp. 系统发育分支，得出相同的结论。来
611 生态学杂志 第 31 卷 第 1 期
图 5 以 16S rDNA全序列为基础的系统发育树状图
Fig． 5 Phylogenetic tree of representative strains and related reference strains based on the full-length of 16S rDNA sequence
菌株编号后面为其寄主植物拉丁名，参比种属后面的为其 GenBank登录号。
自哨上尾矿坝北坡的不同寄主的几株代表菌株，如
SWFU04、SWFU36、SWFU12 和 SWFU05 均属于 Si-
norhizobium sp. 系统发育分支，同样说明在铅锌胁
迫下，不同寄主都可以与 Sinorhizobium sp. 建立共
生关系，寄主对根瘤菌的多样性影响明显下降。
3 讨 论
低频限制性内切酶组合(HindⅢ+HaeⅢ)对根
瘤菌的 16S rDNA 扩增产物酶切后，无法涵盖所有
样本，不能充分反映兰坪铅锌尾矿区豆科植物根瘤
菌多样性;而高频限制性内切酶(HinfⅠ+TaqⅠ)能
充分反映该地区的根瘤菌多样性。兰坪铅锌尾矿区
豆科植物根瘤菌的少数菌间有一定的亲缘关系，由
于生境铅锌含量的差异，它们之间存在丰富的遗传
多样性。陈文新(2004)在对自然生态系统的根瘤
菌系统发育中发现，根瘤菌与豆科植物的共生关系
因生态环境的差异而具有种的多样性。在铅锌胁迫
的退化生境中有同样的规律，即根瘤菌种的多样性
与生境中的重金属含量密切相关，铅锌重金属因子
是压低根瘤菌种多样性的重要胁迫因子。
在铅锌尾矿的退化生境中，由于铅锌含量差异
造成生境差异，寄主对根瘤菌种的多样性影响明显
减弱，同一种植物在不同铅锌含量环境中可与不同
的根瘤菌结瘤固氮。如三叶草可与 3 种 Rhizobium
属根瘤菌接瘤，美丽胡枝子可与的代表菌株
SWFU71 和 SWFU40 均属于 2 种 Bradyrhizobium 属
根瘤菌接瘤，Sinorhizobium 属的根瘤菌可以与不同
寄主的根瘤菌建立共生关系。兰坪铅锌尾矿区豆科
植物种类与土壤中氮含量呈正相关，土壤氮含量增
加似乎与豆科植物与根瘤菌的共生固氮密切相关，
在共生固氮关系中，根瘤菌和寄主植物都存在抗
(耐)铅锌的类型。豆科植物种类多，铅锌含量下
降，豆科植物-根瘤菌体系吸附、转化铅锌离子需要
进一步的研究。
朱毓华等(2006)从陕西太白金矿尾矿区分到
的根瘤菌在 85%的相似水平上按寄主聚成 5 个类
群，与本研究的按采样地聚为 3 个群有所不同。余
建福等(2007)从陕西太白金矿尾矿废弃地分离得
到的 55 株根瘤菌分为根瘤菌属、中华根瘤菌属、中
慢生根瘤菌属、土壤杆菌属 4 个群和 1 个未知群，且
由于生境的差异表现出了丰富的多样性，这与本研
究有相似的结果。无论是金矿尾矿，还是铅锌尾矿，
根瘤菌都能建立共生接瘤关系，豆科植物-根瘤菌共
生固氮体系是尾矿区植被恢复重要的资源，可能在
增加土壤氮素供应、降低重金属离子含量上起到关
键的作用。
711李 彪等:兰坪铅锌尾矿区豆科根瘤菌遗传多样性 ARDRA分析
在铅锌尾矿区种植豆科植物、进行根瘤菌选种
时，必须针对生态环境及宿主植物品种二者，选择出
最佳匹配的根瘤菌，本研究说明寄主植物不同品种
与不同根瘤菌共生，其增加土壤氮素供应，减低重金
属毒害的效应差异很大，所以利用豆科植物-根瘤菌
共生固氮体系恢复尾矿区植被，寄主植物与根瘤菌
的匹配十分重要。本研究所用的根瘤菌需要进行回
接，根据在豆科植物在铅锌胁迫下的结瘤情况来判
断其固氮效率。本实验所用菌株的铅锌耐性及其与
植物协同耐铅锌能力的相关数据另文发表。
应用 ARDRA方法对兰坪铅锌尾矿区豆科植物
进行分析，在一定程度上能反映出根瘤菌 16S rDNA
的遗传多样性，所提供的物种遗传背景信息对初步
分析种质资源遗传差异、兰坪铅锌矿豆科-根瘤菌共
生关系改良土壤和植被与生态恢复具有帮助。
致谢 西南林业大学何承忠教授在数据分析提供了大力帮
助，王娟教授在英文翻译部分提出宝贵意见，龚秀会实验师
对本实验提供了大力帮助，在此致以衷心的感谢!
参考文献
陈 敏，方 序． 2006． 黄瓜青枯病内生拮抗菌株的分离及
ARDRA分析． 微生物学报，46(6) :984－987．
陈文峰，刘 杰，陈文新． 2004． 木本豆科植物根瘤菌资源
及多样性研究进展． 科学技术与工程，11(4) :954 －
958．
陈文新． 2004． 中国豆科植物根瘤菌资源多样性与系统发
育． 中国农业大学学报，9(2) :6－7．
李潞滨，刘振静，杨 凯，等． 2008． 青藏铁路沿线唐古拉
山口土壤微生物的 ARDRA 分析． 生态学报，28(11) :
5482－5487．
缪福俊，孙 浩，陈 玲，等． 2011． 兰坪铅锌尾矿土壤与
自然发生的 5 种植物的研究． 环境工程学报，5(1) :
189－194．
缪福俊，熊 智，李素婷． 2010a． 会泽铅锌尾矿区豆科植物
根瘤菌耐铅锌性及其生理生化特征研究． 农业环境科
学学报，29(10) :1943－1947．
缪福俊，熊 智，孙 浩，等． 2010b． 兰坪铅锌尾矿区豆科
植物根瘤菌耐受性研究． 安徽农业科学，38(21) :
11365－11367，11426．
宁 华，张荣先，陈 浩，等． 2008． 滇池中芽孢杆菌的
ARDRA分类及溶藻特性． 湖泊科学，20(5) :675－680．
吴少慧，张惠文，熊 智，等． 2001． ARDRA对植物根瘤内
共生放线菌 Frankia多样性的研究． 应用生态学报，12
(6) :883－886．
新华网云南频道． 2006． 兰坪县凤凰山铅锌矿资源整合见成
效［EB /OL］． ［2011-3-25］． http:/ /www． yn． xinhuanet．
com /newscenter /2006-12 /12 /content_8762810． htm．
余建福，韦革宏，丁小平，等． 2007． 陕西太白尾矿废弃地
豆科植物根瘤菌 16S rDNA PCR-RFLP 及全序列分析．
西北植物学报，27(3) :502－508．
朱毓华，韦革宏，陈卫民，等． 2006． 陕西太白尾矿区根瘤
菌多样性及抗性菌株筛选． 西北植物学报，26(7) :
1443－ 1448．
Biro B，Koves PK，Voros I． 1998． Toxicity of some field ap-
plied heavy metal salts to the rhizobial and fungal mi-
crosymbionts of alfalfa and redclover． Agrokemia es Tala-
jtan，47:265－276．
Coton M，Laplace JM，Coton E． 2005． Zymomonas mobilis sub-
species identification by amplified ribosomal DNA restric-
tion analysis． Letters in Applied Microbiology，40:152 －
157．
Kemp PF，Aller JY． 2004． Bacterial diversity in aquatic and
other environments:What 16S rDNA libraries can tell us．
FEMS Microbiology Ecology，47:167－177．
Lewontin RC． 1972． The apportionment of human diversity． Ev-
olutionary Biology，6:381－398．
Matsuda A，Moreira FM，Siqueira JO，et al． 2002． Tolerance
of rhizobia genera from different origins to zinc-copper and
cadmium． Pesquida Agropecuaria Brasileira，37:343 －
355．
Nei M． 1978． Estimation of average heterozygosity and genetic
distance from a small number of individuals． Genetics，89:
583－590．
Paolo C，Elena V，Diego P，et al． 2009． Soil humic compounds
and microbial communities in six spruce forests as function
of parent material，slope aspect and stand age． Plant and
Soil，315:47－65．
Sorensen DL，Fresquez PR． 1991． Nitrification potential in re-
claimed coal mine spoils and soils in the semiarid Southwest
USA． Journal of Environmental Quality，20:279－285．
Sun L，Qiu FB，Zhang XX，et al． 2008． Endophytic bacterial
diversity in rice (Oryza sativa L．)roots estimated by 16S
rDNA sequence analysis． Microbial Ecology，55:415－42．
Vincent JM． 1970． A Manual of the Practical Study of Root-
nodule Bacteria． Oxford，England:Blackwell Scientific
Publication．
Weisburg WG，Barns SM，Pelletier DA，et al． 1991． 16S ribo-
somal DNA amplification for phylogenetic study． Journal of
Bacteriology，173:697－703．
Yeh F，Yang RC，Boyle BT． 1997． A User-friendly Shareware
for Population Genetic Analysis． Edmonton:Molecular and
Biotechnology Center，University of Alberta．
作者简介 李 彪，男，1987 年生，硕士研究生，研究方向植
物学。E-mail:biaobiao201@ 163． com
责任编辑 魏中青
811 生态学杂志 第 31 卷 第 1 期