全 文 ：非豆科固氮树种-沙棘与微生物
联合共生体的纯培养研究＊
吴清风　田春杰　何兴元＊＊　周玉芝　韩桂云
(中国科学院沈阳应用生态研究所 ,沈阳 110016)
Study on the Symbiotic Association of Hippophae rhamnoides L.(Non-leguminous Nitrogen-fixing trees)and Microbies
in Pure Artificial Culture.Wu Qingfeng , T ian Chunjie ,He Xingyuan , Zhou Yuzhi , Han Guiyun(Instit uteof Applied Ecolo-
gy , Chinese Academy of Sciences , S henyang 110016).ChineseJournal of Ecology , 2002 , 21(2):22～ 23.
Symbiosis between Frankia , VA mycorrhizal f ungi and Hippophae rhamnoides L.was studied in lab.The characteristic
structures-arbuscules of VAM and nodules were confirmed in the root of H.rhamnoides L., which was inoculated with
VAMF and Frank ia in pure artificial culture.Evaluated by the stimula tion on the grow th of the host plant , VAH is a better
associated fungi and HR16 is a better Frankia for Hippophae rhamnoides L.
Key words:Hippophae rhamnoides L., VA mycorrhizae , frank ia , joint symbiosis.
关　键　词:沙棘 , 菌根真菌 ,弗兰克氏放线菌 , 联合共生
中图分类号:Q93-33　　　文献标识码:A　　　文章编号:1000-4890(2002)02-0022-02
1)黄家彬 ,等.非豆科树木共生固氮研究[ R] .中国科学院林业
土壤研究所 , 1985。
＊中国科学院项目(KZ951-B1-101)资助。
＊＊通讯联系人。
作者简介:吴清风 , 27岁 , 女 ,中国科学院沈阳应用生态研究所
在读硕士 ,从事木本固氮植物与菌根真菌共生的研究。
　　Frankia-非豆科树木共生固氮体系是自然界中
重要的固氮生物资源 ,具有与 Rhizobium-豆科植物
相似的固氮能力 ,在自然界能量循环和生态平衡中
起着重要作用 ,而且与形成共生固氮的非豆科植物
其抗逆性强 ,耐干旱 、盐碱 ,抗高寒 、瘠薄 ,能在一般
豆科植物不能生长的环境下正常生长结瘤固氮。非
豆科固氮树种-沙棘是三北地区重要垦荒先锋树
种1),其果实富含多种维生素 ,具有重要的经济开发
价值。同时 ,沙棘又是具有内生菌根真菌的固氮树
种[ 1] 。本文通过对沙棘菌根 、根瘤联合共生体人工
构建技术以及沙棘联合共生的增效作用的研究 ,选
择出沙棘的最适共生菌根菌 、固氮菌 ,为下一步的盆
栽实验奠定了基础 ,同时也为具有较高经济价值和
生态价值的优良固氮树种沙棘的联合共生体接种技
术 ,在造林生产实践尤其是在逆境条件下的应用提
供理论依据。
1　材料与方法
实验培养基质选用珍珠岩 、泥碳藓 , 分别过
2mm 筛 ,珍珠岩留取筛面上的大粒而泥碳藓要的是
下面粒性均一的碎屑 ,按 7∶1的质量比用 M.M.N
营养液搅拌 ,固液比为 1∶1.2。拌匀后以 2/3 高度
装入 500ml三角瓶 ,高压蒸气灭菌 1.5h 。VA 菌根
菌主要是 Glomus aggregatum ,其中 VAR分离于刺
槐根际土 ,VAH分离于沙棘根际土。接种时先在基
质中接入 VA菌孢子 ,然后每瓶移载 5 棵长至两片
子叶的沙棘无菌苗 。接种量为每瓶 50个孢子(所用
的孢子由扩繁土筛出)。
弗兰克氏放线菌 HR16 ,HR18和 HR37分离于
新民沙棘林下;HR32 分离于建平沙棘林下。将其
离心后的菌体按 1ml·100 棵苗-1 的量接种
(1000min-1 , 5 ～ 10min),移苗一周后接入弗兰克氏
放线菌 。
接种处理包括单接 HR37 , 单接 HR32 , 单接
HR18 ,单接 HR16 ,单接 VAR ,单接 VAH 和双接
VAR+VAH;每种处理重复 3次。接种后盖上口径
50mm 的塑料小杯 ,室温条件下培养 5个月 ,自然光
照为主 ,辅以人工光照(105000 LUX),每瓶定期浇
20 ～ 30ml无菌水 ,在小苗高度长至瓶口时打开杯
盖 。
6个月以后对沙棘小苗的苗高 、地径 、菌根侵染
率 、生物量(植株干重)、结瘤干重 、固氮活性等进行
测试。其中菌根侵染率采用压片染色法计数统
计[ 1] 。根部菌根特征也采用压片法进行显微观察。
固氮活性测定采用国际通用的乙炔还原法及按照沈
善敏等[ 5]改进方法测定 ,于实验室在 100 型气相层
生态学杂志　2002 , 21(2):22 ～ 23
Chinese Journal of Ecology 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
DOI :10.13292/j.1000-4890.2002.0027
析仪上检测乙炔含量 。
2　结果与分析
2.1　沙棘联合共生的确认
作者参考了 Philips等[ 6]染色法 ,根据根样鲜嫩
的特点适当缩短加热时间 。在接种 VA菌根菌的沙
棘根系皮层组织细胞中 ,发现有泡囊及内生菌丝 ,泡
囊是出现在 VA菌感染的后期的结构[ 5] 。在根际培
养基质中筛选出了孢子;在根系表面也观察到了
VA菌外生菌丝的结构。观察结果充分确认了沙棘
与菌根菌形成了共生体。
同时 ,接种 Frankia 的沙棘能够结瘤 ,观察结果
确认沙棘与弗兰克放线菌形成了共生体 。
2.2　菌根真菌对于沙棘生长的增效作用
菌根作为一种高等植物和真菌之间互利共生的
活体营养现象 ,是真菌与植物长期协同进化的结果 。
菌根为共生双方提供了更加广阔的生存和发展的可
能性。许多实验中都发现 ,接种 VA 菌根菌可显著
的促进植物对土壤 P 素的吸收 ,进而改善植物的生
长状况[ 4] 。该实验证实了接种菌根菌对宿主植物
的生长具有明显的促进作用(表 1),接种不同的 VA
菌对宿主植物生长的改善作用是有差别的。其中接
种从沙棘根际土分离的 VA 菌根真菌(VAH)的植
株表现出较好的生长状况 ,其株高 、地径 、生物量分
别比对照高出 38.71%, 126.09%和 87.5%。而接
种从刺槐根际土中分离得到的内生菌根真菌
(VAR)的植株虽然未体现出十分明显的促进作用 ,
但这三项指标与对照相比也分别增长了22.58%,
3.48%和25%。而混接两种内生菌根真菌的植株并
没有表现出优势 ,与对照相比 ,其株高 、地径 、生物量
分别高出 3.23%, 10.43%和 25%,不如单接 VAH
的效果好 。可见对沙棘来说 ,VAH 是相对较好的共
生菌株。
接种效果可以从主根长 、侧根数和侵染率这些
反映菌根菌发育状况的指标上体现出来 ,单接 VAH
的植株其主根长 、侧根数分别高出对照 31.43%和
122.25%,菌根侵染率为 55%,而单接 VAR的植株
要高出对照 25.71%和 66.67%, 菌根侵染率为
40%,双接菌的植株的主根长和侧根数分别高出对
照25.71%和 122.2%,其侵染率为 45%。这说明
了宿主植物良好的生长状况是由于菌根侵染造成
的。
接种 VAH 好的原因在于:VAH 分离于沙棘林
下 ,经过长期的协同进化 ,菌根菌与宿主植物之间彼
此适应 ,相互获益;而 VAR 来自于刺槐林下 ,在人
工构建中虽也能形成共生体 ,并体现出一定的促进
作用 ,但共生体是长期进化的结果 ,人为的建立共生
体不符和进化规律 ,因而 ,起不到明显的增效作用。
当两种内生菌根真菌混合时 ,增效作用也不十分明
显 ,可能是两种菌之间存在着竞争 ,因而限制了其作
用的发挥。
表 1　菌根对沙棘生长的促进作用
Tab.1　Mycorrhhizal stimulation on the grow th of host
plant under pure art ifical culture
菌种
宿主植物
株高(cm) 地径(cm) 生物量(g 干重)
菌根
主根长(cm) 侧根数(个) 侵染率(%)
VAR 19.0 0.119 0.10 11.0 15 40
VAH 21.5 0.260 0.15 11.5 0 55
VAR+VAH 16.0 0.127 0.10 11.0 20 45
对照 15.5 0.115 0.08 8.75 9 0
2.3　不同的放线菌对沙棘生长的促进作用
放线菌结瘤固氮树种是一类较适宜的先锋树
种 。它们可与弗兰克氏菌形成共生体 ,具有很强的
固氮能力 。我国的放线菌结瘤树木资源十分丰富 ,
生态条件不一 ,遗传特性各异。与其共生的弗兰克
氏菌种类繁多 ,特异性强 ,为充分挖掘非豆科固氮树
木资源 ,选择固氮力高 ,抗逆性强的优良菌株 ,组建
高效菌株与寄主的最佳组合 ,我们选择了 4株优良
的 Frankia 菌株对沙棘进行了接种试验(表 2)。
表 2　不同的弗兰克氏菌对沙棘生长的促进作用
Tab.2　St imulation on the grow th of host plant
of di fferent Frankia
菌种
宿主植物
株高(cm) 地径(cm) 生物量(g干重)
根瘤结瘤固 N
结瘤量
(g·株-1)
固 N 活性
(μmolC2H4·mg-1·min-1)
HR16 28.50 0.183 0.51 0.005 3.555
HR18 20.50 0.126 0.30 0.002 2.175
HR32 26.67 0.156 0.37 0.004 3.010
HR37 29.50 0.189 0.48 0.004 3.210
对照 19.50 0.115 0.25 0 0
1)见 22页 1).
　　一些研究表明 ,弗兰克放线菌可以通过形成根
瘤来固定 N 素 ,满足宿主植物的 N 素需求 ,因而促
进了宿主植物的生长[ 2] ,1)。实验证实了这一点(表
2),从表 2可知 ,不同的弗兰克氏菌对沙棘的生长的
促进作用是不同的 ,这也说明了非豆科固氮树木沙
棘与弗兰克放线菌联合共生体的建立很有必要进行
优良菌株的筛选 。HR16和HR37是两株较好的共
(下转第 39页)
23吴清风等:非豆科固氮树种 沙棘与微生物联合共生体的纯培养研究
相信群众 ,做到人人参与 ,提高水资源可持续利用的
意识 ,避免水资源使用过程中的各种浪费现象[ 7 ,8] 。
3.7加强国际与区域间的合作
主要包括 ,全方位引进人才 、技术和资金;在辽
河等流域的治理上 ,要加强与内蒙 、吉林的合作;鸭
绿江及江口的治理 ,要与朝鲜方面达成共识;临近海
域的治理 ,更要注意与河北 、山东 、天津和北京等省
市及朝鲜 、南韩和日本等近邻的合作。
参考文献
[ 1] 　孙铁珩 ,周思毅.城市污水土地处理技术指南[M ] .北京:中国
环境科学出版社 , 1997.
[ 2] 　周启星 ,史建华.小城镇建设中水资源的利用及持续再生的生
态学方法[ A] .见:严力蛟 ,等.生态研究与探索[ C] .北京:中
国环境科学出版社 , 1997.295～ 299.
[ 3] 　周启星 ,王如松.乡村城镇化水污染的生态风险及背景警戒值
的研究[ J] .应用生态学报 , 1997 , 8(3):309～ 13.
[ 4] 　Cosgrove ,W J.and Rijsberman , F.R.“World Water Vision[ M] .
London:Earthscan Publications Ltd., 2000.
[ 5] 　Franks , F.Water:A Matrix of Life[ M ] .London:Royal S ociety
of Chemist ry ,2000.
[ 6] 　Gleick , P.H.The World s Water:The Biennial Report on
Freshwater Resources [ C] .London:Island Press , 2000.
[ 7] 　Loucks ,D.P.and Gladwell , J.S.Sustainability Criteria for water
Resource Systems[M ] .Cambridge:Cambridge University Press ,
1999.
[ 8] 　Mays , L.W.Water Resources Engineering[ M ] .New York:Wi-
ley , John & Sons , 2001.
[ 9] 　Nw ezi , E.U.Water Resources[ M] .New York:McGraw -Hill
Professional Book Group , 2001.
[ 10] 　Revelle , C.Opt imizing Reservoi r Resources [ M ] .New York:
Wiey , John &S ons , 1999.
[ 11] 　Tsiou rt is , N.X.Water Resources Management under Drought or
Shortage C onditions[ M ] .New York:Ashgate Publishing Com-
pany , 1995.
[ 12] 　Zhou Qixing et al.Long -t erm changes of nit rogen and phos-
phorus loadings to a large lake in north-west Ireland[ J] .Water
Research , 2000 , 34(3):922～ 926.
[ 13] 　Zhou Qixing et al.W An integrated plan for tow n-enterprise
waste w ater reuse and w et land st rategy:A case study[ J] .Desali-
nat ion , 1996 , 106(1～ 3):439～ 442.
[ 14] 　Zhou Qixing.Application of biotechniques to w ater purif ication:
Principles and methods [ A] .In:Goosen , E.A.(eds).Water
Management , Puri fication and Conservat ion in Arid C limates
[ C] .Lancaster:Technomic Publishing Co., INC ., 2000 , 31 ～
44.
(收稿:2000年 0月 0日 ,改回:11月 15日)
　　(上接第 23页)
生菌株 ,接种HR16 、HR37的植株其株高 、地径及生
物量分别比对照高出 46.15%, 51.28%, 59.13%,
64.35%, 104%和 92%。分别接种 HR18 和 HR32
的植株也表现了一定的促生作用 ,但相对于 HR16
和HR37株菌来说 ,稍差一些。从反映固氮能力的
两项指标结瘤量 、固氮活性来看 ,接种 HR16的植株
最高 ,分别为 0.005和 3.555 ,反映了较强的固氮能
力;接种 HR37 的植株也较高 ,分别为 0.004 和 3.
210。而接种HR32和 HR18的植株稍差一些 ,分别
为0.004和 3.210 ,0.002和 2.175。这表明宿主植
物沙棘良好的生长状况与弗兰克放线菌的作用是紧
密相关的 。
3　结　论
通过人工纯培养实验 ,对沙棘根部形态解剖学
特性的观察证实 ,非豆科固氮树木沙棘能够被 VA
菌根真菌侵染形成 VA菌根 ,也能够被弗兰克放线
菌侵染形成根瘤 ,为联合共生体的研究提供了现实
依据 。
菌根菌对宿主植物沙棘的生长具有促进作用 ,
不同来源的菌根真菌对沙棘的生长的促进作用是不
同的 ,从沙棘树下分离的内生菌根真菌(VAH)对沙
棘生长的促进作用要好于从刺槐林下分离的内生菌
根真菌(VAR),这说明菌根真菌侵染宿主植物具有
一定的选择性 ,土著共生菌种的筛选择对于联合共
生体的建立具有重要的意义 。
弗兰克氏放线菌对沙棘的生长具有促进作用 ,
来源于不同地点的弗兰克氏菌对沙棘生长的促进作
用不同。实验表明 ,对非豆科固氮树种沙棘来说 ,
HR16和 HR37是较好的共生菌种。
参考文献
[ 1] 　弓明钦 ,陈应龙 ,仲崇录.菌根研究及应用[ M] .北京:中国林
业出版社 , 1997.37～ 41.
[ 2] 　何兴元 ,张成刚 ,杨思河 ,等.固氮树种在混交林中的作用研
究:沙棘混交林内根瘤固氮与林木生长[ J] .应用生态学报 ,
1996 , 7(4):354～ 358.
[ 3] 　李晓林.植物根际营养特性及其在植物生长中的作用[ A] .
见:李晓林.土壤资源的特性与利用[ C] .北京:北京农业大学
出版社 , 1992.339～ 346.
[ 4] 　沈善敏 ,等.乙炔还原技术应用的改进[ A] .中国科学院林业
土壤研究所集刊(第 6)[ C] .科学出版社 , 1983.203～ 209.
[ 5] 　Cox , G.and Tinker , P.B.Translocat ion and t ransfer of nut rients
in vesicular-arbuscular mycorrhizae.I.The arbuscular and phos-
phorus t ransfer:a quanti tative ult rast ructural study [ J] .New
phytol., 1976 , 77:37～ 378.
[ 6] 　Pillips , J.M.and Hayman , D.S.Imp roved procedures for clearing
and at taining parasitic and vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi
for rapid assessment pf infection[ J] .Trans.br.Mycol.Soc ,
1970 , 55:158～ 161.
(收稿:2001年 2月 13日 ,改回:6月 5日)
39周启星:从第二届世界水资源论坛看辽宁的水资源危机及对策