全 文 ：23株豆科木本植物根瘤菌 16S rDNA序列分析
李　东 ,黄莉莉 ,韩素芬＊
(南京林业大学森林资源与环境学院 , 江苏　南京　210037)
摘　要:为研究和利用华东地区豆科植物根瘤菌的种质资源多样性 , 对从华东地区豆科木本植物根瘤分离获
得的 23 个菌株进行了 16S rDNA 全序列分析 ,并与相关参比菌株的 16S rDNA 序列进行了比较及聚类分析 ,
建立了 23 株华东地区豆科木本植物根瘤菌的发育树状图 , 这一分析结果与来自形态学的鉴别结果吻合 , 初
步确定了 23 株豆科木本植物根瘤菌分类地位。
关键词:豆科木本植物;根瘤菌;16S rDNA;系统发育分析
中图分类号:S718.81　　　　文献标识码:A　　　　文章编号:1000-2006(2007)06-0117-04
16S rDNA Sequence Analysis of 23 Rhizobium Strains
Isolated from Leguminosae Woody Plants
LI Dong , HUANG Li-li , HAN Su-fen＊
(College of Forest Resources and Environment Nanjing Forest ry University , Nanjing 210037 , China)
Abstract:To study and make full use of Rhizobium diversi ty in east-area of China , the full
leng th 16S rDNA sequences o f 23 Rhizobium strains isolated f rom leguminosae w oody plants
in East China a rea w ere tested.At the same time , tho se of selected st rains dow nloaded from
GenBank we re compared.The phy logenetic t ree w as therefo re const ructed.T he analy sis re-
sult w as consistent wi th those f rom morpholo gy.T he taxonom ic posi tion of 23 Rhizobium
strains w as dete rmined.
Key words:Leguminosae w oody plants;Rhizobia;16S rDNA;Phy logene tic analy sis
　　　收稿日期:2007-07-07　　　　修回日期:2007-10-08
　基金项目:国家自然科学基金资助项目(30170765)
　作者简介:李　东(1967-),男 ,副研究员。
＊通讯作者(Corresponding Author):韩素芬 ,女 ,教授 ,博士生导师。
　　目前 ,16S rDNA 已被作为一个分子指标 ,广泛用于各种细菌的遗传特征和分子差异的研究[ 1] 。从
华东地区豆科木本植物根瘤中分离获得的 66个菌株 ,经形态 、生理生化和抗逆性等性状测定 ,得到它们
的聚类分析树状图 ,聚类分析结果表明 ,菌群划分的依据是表型特征 ,与寄主的种类 、来源没有相关性 ,
66个菌株在形态 、生理生化 、抗逆性以及交叉结瘤试验结果存在明显差异 ,表明了豆科树种根瘤菌的多
样性[ 2] 。
近几十年来 ,随着16S rDNA 序列分析 ,DNA/DNA 或 RNA杂交 、选择性分子标记技术(AFLP)和
随机扩增的 DNA 多态性技术(RAPD)等分子生物学技术在根瘤菌分类中的推广应用[ 1] ,新的分类系统
建立在生物学 、分子生物学和分子遗传学等性状测定的基础上 ,更真实全面地反映根瘤菌之间的亲缘关
系。笔者在前人研究的基础上[ 3-4] ,对华东地区豆科木本植物根瘤菌中分离获得的其中 23个菌株进行
16S rDNA全序列分析 ,从分子水平上探讨了它们的进化关系 ,为开发利用这些豆科根瘤菌的种质资源
提供理论依据。
1　材料和方法
1.1　供试材料
　　(1)供试菌株:研究所用的根瘤菌菌株由南京林业大学病理教研组从采集的根瘤中分离纯化并保
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　第 31卷第 6期
2007年 11 月 　
南 京 林 业 大 学 学 报 (自 然 科 学 版)
Journal of Nanjing Fo rest ry Unive rsity(Natural Science s Edi tion)　
Vo l.31 , No.6　
Nov., 2007　
存 ,采自华东地区豆科树种的根瘤具体情况见表 1。
表 1　供试菌株宿主及来源
Table 1　Hosts and sources of tested strains
编号
N o.
菌株
St rains
寄主　　
Hosts　　
快 、慢生类
型 Type
采集点
Source s
编号
No.
菌株
St rains
寄主　　
Hosts　　
快 、慢生类
型 Type
采集点
Sources
92-112 崖豆藤属
Mil lettia
鸡血藤
M.ret icul ata 慢 福建清流
89-31 金合欢属
Acacia
娟毛相思
A.holosericea 慢
南京林业大
学苗圃
92-1-8 刺槐属
Robini a
刺槐
R.pseudoaca-
cia
快 山东定陶
93-158 槐蓝属
Indi gogera
马棘
I.pseudotinctoria 慢 黄山
92-1-6 刺槐属
Robini a
刺槐
R.pseudoacacia 慢 徐州林业站
87-2 槐属
Sophora
马蹄针
S.day idii 慢
南京林业大
学树木园
92-124 金合欢属
Acacia
金合欢
A.f arnesiana 快 厦门植物园
92-101 锦鸡儿属
Caragana
黄荆条
C.f rulex 快 青岛
92-99 葛藤属
Puerari a
葛藤
P.lobata 慢 山东青岛
89-22 金合欢属
Acacia
台湾相思
A.richii 慢
南京林业大
学苗圃
92-78-1 胡枝子属
Lespedeza
铁马鞭
L.pilosa 快
南京林业大
学树木园
84-17 紫穗槐属
Amorpha
紫穗槐
A.f rul icosa 慢
南京林业大
学苗圃
93-82 槐属
Sophora
苦参
S.f layescens 慢
南京林业大
学树木园
93-149 红豆树属
Ormosia
花榈木
O.henry i 快 黄山树木园
92-58-1 槐蓝属
Indigogera
华东木蓝
I.f orlunei 快 南京灵谷寺
92-73 马鞍山树属
Maack ia
毛叶怀槐
M.amurensis 快
南京林业大
学树木园
92-104 胡枝子属
Lespedeza
截叶胡枝子
L.cuneata 慢 青岛
92-90 胡枝子属
Lespedeza
二色胡枝子
L.bicolor 慢
山东泰安林
校
92-59
杭子稍属
Campylot-
ropis
杭子梢
C.macrocar-
pa
慢 南京灵谷寺
92-65 山蚂蟥属
Desmodium
山蚂蟥
D.racemosum 慢 南京灵谷寺
92-1-14 刺槐属
Robinia
刺槐
R.pseudoaca-
cia
快 安徽黄山林校
93-144 胡枝子属
Lespedeza
铁马鞭
L.pi losa 慢 安徽祁门
92-1-11 刺槐属
Robinia
刺槐
R.pseudoaca-
cia
快 山东青岛
　　(2)培养基为 YEM 培养基[ 11] 、T Y培养基[ 12]和 PA 培养基[ 4] 。
(3)试剂为:溴酚蓝 ,琼脂糖 ,西班牙进口分装;蛋白酶 K ,溶菌酶购自南京生兴生物技术有限公司;
TaqDNA 聚合酶购自宝生物工程(大连)有限公司;DNA 提取试剂均为分子生物学级;PCR反应试剂购
自上海代理的 Promega 。
(4)实验仪器包括:DK-600型电热恒温水槽(上海精宏实验设备有限公司),DYY-6B型稳压稳
流电泳仪(北京六一仪器厂), D-1型自动蒸汽灭菌锅(北京发恩科贸有限公司), Heraeus台式高速冷
冻离心机(Biofuge primo R),凝胶成像系统(Bio rad)。
1.2　根瘤菌培养方法
冰箱保存的根瘤菌在 YEM 斜面培养基活化后 ,移接到 T Y或 PA 液体培养基 。28℃恒温振荡培
养 ,培养至生长对数期或中后期 ,收集菌体。快生型根瘤菌的培养时间一般为 2 ～ 5 d ,慢生型根瘤菌的
培养时间一般 5 ～ 10 d。
1.3　供试菌株的总 DNA提取
菌株的总 DNA 提取步骤如下:菌悬液在 4℃下 ,5 000 r/min离心 10 min收集菌体。收集洗涤后得
到的 2 ～ 3 g 菌体 ,加入 50 mL 1×TES 缓冲液 ,在涡旋振荡器上振荡 ,充分打散菌体 。在同样条件下离
心洗涤 ,重复 2 ～ 3次 。加入溶菌酶(0.5 ～ 2 mg), 37℃水浴振荡 ,保温 30 ～ 60 m in ,温和振荡。加入5 mL
20%的 SDS ,使终浓度为 2%,60℃水浴保温 10m in。加入 10 ～ 14 mL 的 5 mo l/L N aClO 4 ,使终浓度为
1 mol/L ,振荡混匀。加入等体积的苯酚+氯仿+异戊醇(体积比为25∶24∶1)混合液 ,充分振荡使其呈乳
浊液 ,在 4℃下以 12 000 r/min离心 25 min ,用大口枪头吸取上层水相 ,转移至另一离心管中。重复上述
步骤抽提 2 ～ 3次 ,直至上下两相间无蛋白膜出现 。吸取上层水相至另一离心管中 。每毫升菌液加入蛋
白酶 K 50μg ,37℃水浴保温 30 ～ 60 min ,温和摇动 。加入等体积的氯仿/异戊醇(体积比 24∶1)混合液 ,
充分振荡;在 4℃下 ,12 000 r/min离心20min。吸取该混合液上层水相转移至另一离心管中 ,按每毫升
菌液加入 30 ～ 70μg 的 RNase , 37℃水浴保温 30 ～ 60 min ,再加入等体积氯仿/异戊醇(体积比 24∶1)混
合液 ,充分振荡;在 4℃下 ,12 000 r/min 离心 20 min。吸取混合液上层水相转移至另一离心管 ,置于冰
浴中 ,加入 1/10体积冰预冷的 3 mol/ L 醋酸钠(NaAc)+1 mmo l/L EDTA-Na2 及等体积冰预冷的异
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南 京 林 业 大 学 学 报 (自 然 科 学 版)　　　　　　第 31 卷　第 6 期　
丙醇 。充分混匀后冰浴 2 ～ 3 h ,使 DNA 充分沉淀 。加入 70%乙醇 ,离心 10 min(8 000 r/min)。
重复上述步骤 ,去除有机试剂及无机盐 。再加入无水乙醇脱水 10 min。弃去乙醇将 DNA自然风
干后溶于适量 TE中 。-20℃保存备用。
1.4　16S rDNA的 PCR扩增及测序
以总 DNA 为模板 ,用引物 P1和 P6经 PCR反应扩增出 16S rDNA 。其中引物 P1和 P6的序列参
见文献[ 1] 。扩增体系为:10×Buf fer 5μL ,MgCl2 3μL , dN TP 1μL , Taq po lymerase(Promega)0.5μL ,
P1 2μL ,P6 2μL , template 2.5μL ,H 2O 34μL 。扩增条件为:94℃预变性 3min ,然后是 35个循环的扩
增(94℃1 min , 60℃1 min ,72℃2 min),最后在 72℃延伸 10 min。
然后将 PCR反应产物经纯化后直接测序 ,测序工作在中国农业科学院作物科学研究所完成 。
1.5　多序列比较及进化树的建立
将测序结果通过美国国立生物信息中心和欧洲生物信息所的国际网站进行 BLAST 分析 ,进一步
验证测序结果 ,并进行多序列比较 ,建立系统进化树。
序列分析所用参比菌株来自GenBank ,其菌株名称分别为 Brad yrhizobium geno sp.AH(登录号:
AJ810378),Mesorhizobium amorphae (登录号:AY491077), Agrobacterium rhizogenes (Rhizobium
rhizogenes)(登录号:AB247603), Rhizobium sp.Glm-9 (登录号:AF510376), S inorhizobium f redi i
(Rhizobium f red ii)(登录号:AY260148), Azorhizobium sp.KNUC169(登录号:DQ424868), Phy l-
lobacterium sp.DSM 17640(登录号:DQ431466)。
　图 1　部分菌株由 PCR扩增的 16S rDNA 片段结果
　F ig.1　The result of the 16S rDNA PC R o f par t of the
rhizobia
(M:DNA Mark er (GeneRu ler TM 1kb DNA Ladder))
2　结果与分析
2.1　16S rDNA PCR扩增结果
　　部分菌株 16S rDNA 的 PCR扩增部分结果电
泳检测见图 1。从图 1可以看出 ,所扩增的 16S rD-
NA 片段大小为 1.5 kb 。
图 2　16S r DNA 全序列系统发育树状图
　Fig.2 　Phy logene tic tree de rived from the full-leng th
16S rDNA sequences
2.2　菌株 16S rDNA序列的系统进化树构建
根瘤菌科已发展到 7属[ 5] 。根据当前的分类从
GenBank上选取 5个参比菌株 ,连同该试验中所扩
增出来的 23 个菌株序列一起进行分析 。通过
MEGA3.1软件按自展法(Boost rap)运算 ,结果见
图 2。
从图 2可以看出 ,菌株 92-58-1 , 92-78-1
和 92-73 归为根瘤菌属 , 92-65 , 92 -99 , 92 -
101 , 89-22 , 92-1-11 ,92-90和 92-104成为
一支 ,大致为中慢生根瘤菌属 , 92-59和 92-158
成为一支 ,归为慢生根瘤菌属 ,其结果与来自形态
学的鉴别结果基本吻合 ,但 89-31 , 92-1-8 , 93
-114却归其他类群中 ,与来自形态学的鉴别有所
差别 ,研究结果表明:同一属的植物上的根瘤中分
离到的根瘤菌并不是同源性一定是最近的 ,甚至是
同一种植物上的根瘤中分离到的根瘤菌在进化树
上也是在不同分支上的 ,如刺槐属中的采自不同地
方的刺槐上分离到的根瘤菌 92-1-6 , 92-1-8 ,
一般认为根瘤菌分类地位与宿主密切相关[ 6]
但也有研究认为环境条件对根瘤菌的分类地
位的影响大于寄主专一性的影响[ 7-9] 。该研究结果
也支持这一结论 。可见在自然界中豆科树种根瘤
—119—
　2007 年　总第 132 期　　　　　　李　东等:23 株豆科木本植物根瘤菌 16S rDNA 序列分析
菌具有很高的多样性和复杂性 。
3　讨　论
许多研究表明 ,根瘤菌的表型特征和基因型特征常常出现明显的不吻合性[ 1 , 3-5] 。该研究结果与文
献[ 2]报道的对它们形态 、生理生化特征和抗逆性等方面的研究结果相比 ,二者有很大的相关性 ,但是不
完全吻合 。其原因可能与宿主甚至宿主生长的环境有关 。遗传图谱类型相同 ,表型性状反映有一定差
异的菌株 ,说明有着共同起源的菌株经过进化和环境的影响 ,其表型特征为了适应环境的变化而发生了
相应的改变。
笔者采用 16S rDNA 全序列分析 ,对华东地区的豆科树种分离到的 23株根瘤菌进行了系统进化树
研究 ,取得一些研究结果 ,确定了大部分菌株的分类地位 ,为豆科树种根瘤菌研究提供理论依据 ,为开发
和合理利用豆科树种根瘤菌种质资源奠定基础。当然单一的分类方法有一定的误差 ,各种分类方法互
相验证 ,共同构成多相分类体系[ 8] 对根瘤菌的分类也是必需的 ,这样才能更加系统化 、完整化 ,从而使得
系统发育研究有突破性进展。
[ 参 考 文 献 ]
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(责任编辑　郑琰燚)
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