全 文 ：西北植物学报 , 2005, 25( 9): 1811— 1815
Acta Bot . Boreal .-Occident. Sin.
文章编号: 1000-4025( 2005) 09-1811-05
中国帕米尔高原豆科植物根瘤菌多样性研究
韦革宏 1 ,曹　鹏1 ,龚明福 1, 2 ,吕双庆 2 ,苏　鹏 1
( 1西北农林科技大学 生命科学学院 ,陕西杨陵 712100; 2塔里木大学 植物科技学院 ,新疆阿拉尔 843300)
摘　要: 从新疆帕米尔高原采集豆科植物根瘤 ,经分离纯化获得 68株供试根瘤菌 ,并选取 36株参比菌株 ,进行唯
一碳源利用、唯一氮源利用、对抗生素和染料抗性、耐盐性、初始 p H生长、温度生长范围及石蕊牛奶反应、氧化酶、
过氧化氢酶、脲酶共 117项生理生化性状测定 ,并进行比较分析 . 结果表明:帕米尔高原豆科植物根瘤菌在碳氮源
利用、抗生素敏感性、对染料抗性程度等方面存在着差异 . 该地区豆科植物根瘤菌均能耐受低温 ,并具有较强的耐
盐、耐碱能力 ,所有供试菌株均能在初始 p H 9～ 12的 YM A培养基上生长 , 84. 7%的菌株能耐受 3. 0%的 NaCl. 从
数值分类树状图可见 ,在 86%的相似水平上未知菌株构成了 4个新的表观群 . 第Ⅰ 、Ⅱ 、Ⅲ 、Ⅳ类群分别有 19、 5、 6、
8株菌 ,中心菌株分别为 NW HQLP412、 NW HQLP481、 NW TX1901、 NWTX952.
关键词: 帕米尔高原 ;根瘤菌 ;多样性
中图分类号: Q948. 9; Q949. 751. 9　　　文献标识码: A
Diversity of Leguminous Rhizobia in Pamirs Plateau of China
WEI Ge-hong
1 , CAO Peng
1 , GON G Ming-fu
1, 2 , L U Shuang-qing2 , SU Peng1
( 1 Col leg e of Life Sciences , Northw es t Sci-Tech University of Ag ricul tu re and Fores try, Yangling , Shaanxi 712100, China; 2 Col-
lege of Plant Science and Technolog y of Tarim University, Alar, Xin jiang 843300, China)
Abstract: 68 st rains o f rhizobia w ere isolated from the leguminous nodules collected in Pamirs Pla teau lo-
cated in Xinjiang , and 118 physio logical and biochemical cha racters of these st rains and 36 know n control
st rains such a s uses o f sing le carbon and nit rog en sources, antibio tic and dye resistances, salt and alkali to l-
erances, initial g row th pH, g row th temperature limi ts, li tmus and milk responses, oxidase, perox idase and
urease w ere determined and compared. The resul ts rev ealed that the leguminous rhizobia in Pamirs Plateau
di ffered in uses of sing le carbon and nit rog en sources, antibio tic sensi tivi ty, and dye resistance. All legumi-
nous rhizobia w ere capable of tolera ting low tempera ture and had high capabi li ties of salt and alkali to ler-
ances; all the st rains under study could g rew on YMA medium with i ts ini tial pH a t 9～ 12 and 84. 7% of
them can tolerate 3. 0% NaCl. The dendrog ram of numerical tax onomy show s that at the simi lari ty of
86% , the unknown st rains fo rmed four new appa rent clusters. clustersⅠ ,Ⅱ , Ⅲ andⅣ contained 19, 5, 6
and 8 st rains , respectiv ely , and the central strains w ere NWHQLP412, NWHQLP481, NW TX1901 and
NW TX952.
Key words: Pamirs Plateau; rhizobium; div ersi ty
收稿日期: 2005-01-17;修改稿收到日期: 2005-07-16
基金项目:国家自然科学基金 ( 30470040) ;全国优秀博士学位论文作者专项基金 ( 200254) ;教育部新世纪优秀人才支持计划 ( NCET-04-
0953) ;西北农林科技大学拔尖人才支持计划
作者简介:韦革宏 ( 1969- ) ,男 ,教授 ,博士 ,博士生导师 ,主要从事根瘤菌资源多样性研究 .
　　中国帕米尔高原位于我国新疆西南部塔什库尔
干塔吉克自治县 (以下简称塔县 )境内 ,平均海拔
4 000 m ,年平均温度不足 - 6℃ ,年均降雨量为 248
～ 350 mm ,风沙大 [1 ] . 在这种地形和气候条件下 ,植
被和土壤具有寒冷、干旱的大陆性特点 .该地区植物
种类比较丰富 ,据调查共有植物 531种 ,隶属 48科
204属 ,其中豆科有 10属 64种 [2 ] .
根瘤菌能与豆科植物共生固氮 ,在提高土壤肥
力、改善生态环境方面发挥着重要的作用 . 目前 ,高
寒区豆科植物根瘤菌的数值分类研究尚属空白 ,在
帕米尔高原特殊的生态环境下 ,豆科植物根瘤菌是
否具有一些新的特性? 在分类上与已知根瘤菌有何
联系? 为了弄清帕米尔高原寒区豆科植物根瘤菌的
特征 ,本研究于 2003年 7月至 8月对中国境内的帕
米尔高原进行了豆科植物资源调查 ,并对相应的根
瘤菌资源进行了采集、分离及纯化 ,在此基础上对所
采样本根瘤菌的表型性状进行分析和数值分类 ,为
根瘤菌多样性研究提供依据 .
1　材料和方法
1. 1　供试菌株
　　在新疆塔县采集新鲜的豆科植物根瘤 ,无菌水
洗涤 , 95%酒精浸泡 5 min,再用 0. 1%升汞消毒 5
min,用无菌水冲洗数次 . 采用平板划线法分离、纯
化菌株 ,挑取单菌落 ,革兰氏染色 ,镜检 ;菌株的回接
采用水培法 [3 ] . 选取 68株快生型根瘤菌及 36株已
知参比菌株进行生理生化研究 . 参比菌株分别属于
Rhizobium、 Sinorhizobium、 Mesorhizobium 和 Al-
lorhizobium 4个根瘤菌属 .
1. 2　性状测定
共测定了 117项生理生化指标 ,其中: ( 1)唯一
碳源利用 24项 ,包括甘露糖、半乳糖、鼠李糖、山梨
糖、 D-核糖、 D-木糖、葡萄糖、 D-果糖、盐酸氨基葡萄
糖、树胶醛糖、肌醇、山梨醇、赤丝草醇、蔗糖、蜜二
糖、麦芽糖、乳糖、棉子糖、糖原、马尿酸钠、丙酮酸
钠、柠檬酸钠、乙酸钠、琥珀酸钠 ; ( 2)唯一氮源利用
17项 ,包括甘氨酸、丙氨酸、 L-半胱氨酸、 L-甲硫氨
酸、天冬酰胺、 L-谷氨酸、 L-赖氨酸、 L-精氨酸、 L-酪
氨酸、 3, 5-溴酪氨酸、 L-色氨酸、 L-苯丙氨酸、 DL-组
氨酸、α-鸟氨酸、 L-正百氨酸、 L-白氨酸、 L-胱氨酸 ,
碳氮源的终浓度均为 0. 1% ; ( 3)抗生素测定 32项 ,
8种抗生素分别为红霉素、白霉素、青霉素、链霉素、
磷雷霉素、洁霉素、卡那霉素、庆大霉素 ,每种抗生素
设 4个浓度: 5、 50、 100、 300μg· mL- 1; ( 4)染料及
化学试剂的抗性测定 20项 ,包括中性红、去氧胆酸
钠、亚甲基蓝、刚果红、孟加拉红、孔雀石绿、甲基绿、
甲基红、甲基橙、百里香酚兰 ,浓度分别为 0. 1%和
0. 2% ; ( 5)其它测定项目 7类 24项 ,包括耐盐性、初
始 pH值 ( 4～ 12)、温度生长范围 ( 4、 40℃ )、石蕊牛
奶反应、氧化酶、过氧化氢酶、脲酶等 . 每个指标设 3
次重复 ,具体实验方法和培养基的配制按韦革宏
等 [4 ]的方法 .
1. 3　聚类方法
利用平均连锁法 ( U PGMA) ,采用中国科学院
微生物所的 M IN TS软件包 ,聚类结果用树状图表
示 [5 ] .
1. 4　表观群中心菌株的确定
采用最大平均数法 ,计算群内菌株的相似性系
数 ,求平均值 .平均值最大的即为该表观群的中心菌
株 [5 ] .
2　结果与分析
2. 1　生理生化性状测定
2. 1. 1　唯一碳源利用　细菌能否利用某些化合物
作唯一碳源 ,反映该菌是否产生代谢这种碳化合物
的有关酶 . 结果显示 ,所有未知菌株都能利用蔗糖、
山梨醇、蜜二糖、甘露糖 ;有 98. 6%的菌株能利用肌
醇、乙酸钠、乳糖、葡萄糖、柠檬酸钠、 D-核糖、山梨
糖 ,而 NW TX462不能利用肌醇 , NWTX1241不能
利 用 乙 酸 钠 , NWHQLP912 不 能 利 用 乳 糖 ,
NWHQLP881不能利用葡萄糖、柠檬酸钠、 D-核糖 ,
NWTX201不能利用山梨糖 ;所有供试菌株均不能
利用棉子糖 .这一结果表明 ,供试菌株糖酵解底物范
围比较广泛 ,而 NW HQ LP881只能利用 25种碳源
中的 9种 ,说明该菌株糖酵解底物范围较窄 .
2. 1. 2　唯一氮源利用　对 17种氨基酸利用的测定
结果表明: 帕米尔高原根瘤菌对所选氮源利用情况
良好 . 其中 63. 9%的菌株可以利用所有氮源 ,长势接
近于 在 YM A 平 板 上的 生 长 情 况 . 10 株 菌
( NW TX111、 NW HQLP781、 NW HQLP872、 NWHQLP881、
NW HQLP912、 NWTX462、 NW TX501、 NWTX591、
NW TX642、 NWTX761)对所选氮源利用较差 (与利用
甘露醇相比 ) ,其中 NW TX761不能利用所有氮源 .
2. 1. 3　抗生素抗性及染料抗性的测定　 68株未知
1812 西　北　植　物　学　报 25卷
菌株对 8种抗生素 4种不同浓度 ( 5、 50、 100、 300
μg· mL- 1 )抗性的测定表明 ,所有菌株都不能耐受
100～ 300μg· mL- 1的庆大霉素和卡那霉素 ,这说
明庆大霉素和卡那霉素对帕米尔高原豆科植物根瘤
菌有较强的抑制作用 . 大多数菌株可耐受 5
μg· mL- 1浓度的抗生素 .
所有未知菌株均不能耐受 0. 1% 、 0. 2%的亚甲基
蓝和孔雀石绿 , NW TX1861、 NW TX1861、 NWHQLP741
可耐受 0. 1%及 0. 2%甲基红 , NW TX1901可耐受
0. 1%及 0. 2%甲基绿 ,其余菌株不能耐受甲基绿和
甲基红 . 所有菌株都可耐受 0. 1%及 0. 2%的去氧胆
酸钠、中性红、孟加拉红 ;除 NW HQ LP3不能耐受
0. 1%及 0. 2%的甲基橙、百里香酚兰外 ,其余菌株
都可耐受 .
2. 1. 4　耐盐碱性测定　Mchammad等一些国外学者
认为耐盐性很强的菌株一般也具有很强的抗旱能
力 [6 ] . 通过对供试盐类物质的抗性测定表明 ,有 15
株菌 (NWTX292、 NWTX1551、 NW TX1572、 NW HQLP851、
NWHQLP951、 NWTX1052、 NW TX1132、 NW TX1241、
NW TX1312、 NWTX 471、 NW TX912、 NWTX462、
NW TX491、 NWTX 501、NW TX42)能耐受 6. 0%的
NaCl, 84. 7%的菌株可耐受 3. 0%的 NaCl, 87. 5%
的菌株可耐受 1. 0%的 NaCl.
通过 68株未知菌株对初始 pH值 ( 4～ 12)的测
试表明 ,所有供试菌株均不能耐受 pH 4的环境 ,
NW HQLP851、 NWHQLP951和 NW TX901不能耐
受 pH 5的环境 ,其余菌株均能在 pH 5环境下生
长 ,但不及在 pH 7下长势好 ,而在碱性环境 ( p H
9～ 12)下所有菌株都能生长 ,只是比 pH 7下的长
势差 . 这一结果表明供试菌株普遍具有较强的耐碱
能力 .
2. 1. 5　生长温度范围测定　通过对菌株在 4℃、
40℃两个温度梯度的测定表明 ,在 4℃时所有菌株
都长出 ,在 40℃下 ,有个别平板有菌长出但长势远
差于对照 ( 28℃ ) .这说明供试菌株普遍抗寒 ,而不耐
受高温 ,这与根瘤菌长期所处的生态环境条件有关 .
2. 2　聚类分析结果
对供试菌株所测定的 117项表型性状数据 ,采
用平均连锁法进行聚类分析 ,获得数值分类树状图
(图 1) . 从图 1中可以看出 ,同一种的两个不同参比
菌株具有较高的相似程度 . 如: R . gall icum 中的
FL27和 USDA2918,相似性达到 93% ; R. tropici中
的 BR853和 CIAT899, 相似 性达到 89% , M .
huakuii 中的 CCBAU2609和 A106相似性达到
90% .
全部供试菌株在 64%的相似水平上聚在一起 ,
在 86%的相似性水平上 ,参比菌株能够按种的不同
彼此很好的分开 . 它们依次为木兰根瘤菌 ( R. in-
digoferae )、柯斯梯中华根瘤菌 ( S. kostiense )、岩黄
芪根瘤菌 ( R. sul lae )、菜豆根瘤菌 ( R. etli )、紫穗槐
中慢生根瘤菌 (M. amorphae )、撒哈拉中华根瘤菌
( S. sahel i )、蒙古根瘤菌 (R . mongolense)、热带根瘤
菌 ( R. t ropici )、海南根瘤菌 ( R. hainanense )、鸡眼草
中华根瘤菌 ( S. kummerowiae )、瓦尔特拉根瘤菌
( R. huautlense )、黄土根瘤菌 ( R. loessense )、华癸中
慢生根瘤菌 (M . huakui i )、山羊豆根瘤菌 ( R. gale-
gae )、木本中华根瘤菌 ( S. arboris )、杨凌根瘤菌 ( R.
yangl ingense )、新疆中华根瘤菌 ( S. x inj iangense )、
S. medica、弗雷德根瘤菌 ( S. f redii )、水生根瘤菌
( Allorhizobium undicola )、鹰嘴豆中慢生根瘤菌
(M. ciceri )、天山根瘤菌 (M. tianshanense )、高卢根
瘤菌 ( R. gall icum )、 USDA3392、豌豆根瘤菌 ( R.
leguminosarum )、百脉根瘤菌 (M . lot i )、苜蓿中华根
瘤菌 ( S. melilot i )、广布中慢生根瘤菌 (M . plurif ari-
um )、多宿主中华根瘤菌 ( S. terangae )、贾氏根瘤菌
( R. giardinii ) .这些结果与现行的分类结果相一致 ,
证明本实验在生理生化性状测定及数值分类方面的
测定结果是可靠的 .
参考已知参比菌株的聚类情况并按 Snea th的
建议 [7 ] ,相似性在 80%以上者 ,可以归为同一种 . 未
知菌株在 85%的相似水平上 ,聚为第Ⅰ 、Ⅱ 、Ⅲ 、Ⅳ
共 4个新类群 . 第Ⅰ 类群共有 19株菌 ,在 87%的相
似水平上聚合 ,中心菌株为 NWHQLP412. 这一类
群可在 89%的相似水平上分为两个亚群 ,第Ⅰ 亚群
有 13株菌 ,在 91%的相似水平上聚合 ;第 2亚群有
6株菌 ,在 89%的相似水平上聚合 . 第Ⅱ类群共有 5
株菌 ,在 89%的相似水平上聚合 ,中心菌株为
NWHQLP481. 第Ⅲ类群共有 6株菌 ,在 86%的相
似水平上聚合 ,中心菌株为 NW TX1901. 第Ⅳ类群
共有 8株菌 ,在 86%的相似水平上聚合 ,中心菌株
为 NW TX952. 除上述 4个类群外 , NWTX992和参
比菌株 U SDA2914具有较高的相似水平 ( 88% ) ,这
一菌株很可能属于山羊豆根瘤菌 ( R. galegae) .其余
30株供试菌株在 86%的相似水平上未聚合而各自
18139期 韦革宏 ,等: 中国帕米尔高原豆科植物根瘤菌多样性研究
独立 . 这 4个新类群是否为新的分类单元有待进一 步深入研究 .
图 1　数值分类树状图
Fig. 1　 Dendrog ram o f the rhizobium strains in th e numerical tax onomy
1814 西　北　植　物　学　报 25卷
3　小结与讨论
( 1)分离自帕米尔高原的 68株根瘤菌大多数
菌株能利用较为广泛的碳氮源 ,对供试抗生素及染
料有较好的抗性 ,所有的菌株都能耐受低温 ,具有较
强的耐盐碱能力 ,可能与这些菌株长期生长的生态
环境条件有直接的关系 . 这些菌株的宿主植物生长
的土壤环境都是高寒荒漠土 ,部分地区盐碱化程度
很高 ,当地年平均温度不足 - 6℃ ,年均降雨量为
248～ 350 mm ,长期的高海拔、低温、盐碱等选择性
压力使得这些地区的根瘤菌具有以上特性 ,而这些
特性中所蕴含着的丰富的基因资源 ,对高寒地区的
荒漠化治理具有重要的意义 .
( 2)通过对 68株供试菌表型性状的数值分类分
析表明 ,这 68株供试菌可以在 86%的相似水平上
聚为 4个新的类群 . 除 USDA2914与类群Ⅰ 具有
83. 4%的相似水平外 ,其它参比菌株与未知菌株的
相似性都非常低 ,表明帕米尔高原豆科植物的根瘤
菌与其它地区的根瘤菌差别较大 ,未知菌株所形成
的 4个新类群可能属于新种 ,需要进行分子杂交及
DNA测序分析等研究进一步确定 .
( 3)对这 4个新类群的菌株来源进行分析表明 ,
新类群的构建与豆科植物的种类及采集样点之间均
具有关系 . 同一采集样点不同种豆科植物的根瘤菌
可以聚在同一类群内 ,如第Ⅰ 类群菌株分离自同一
采集样点的冰河棘豆、蚕豆、黄花草木樨、棘豆 ,第Ⅳ
类群菌株分离自同一采集样点的冰河棘豆、蚕豆、藏
黄芪 . 不同采样点或同一采样点的同一种豆科植物
其根瘤菌可以聚在不同的类群内 ,如不同采样点冰
河棘豆的根瘤菌分别聚在了第Ⅰ 、Ⅳ类群 ,而同一采
样点蚕豆的根瘤菌 ( NWTX1561、 NW TX1551)则分
别聚在了第Ⅰ 、Ⅳ类群 ,只有第Ⅱ类群的菌株来自于
同一种豆科植物—— 宽爪棘豆 ,但这些植物分布于
不同采样点 .上述现象表明 ,根瘤菌与豆科植物之间
的共生结瘤关系非常复杂 ,受多种因素的影响 ,植物
的种类及区域地理环境的差异都会影响到根瘤菌的
种类及分布 ,根瘤菌与豆科植物的共生关系是细菌、
植物及环境三方面相互作用的结果 ,而不只是细菌
与植物之间的简单组合 ,这一结果与陈文新等 [8 ]的
观点相吻合 .
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