全 文 ：为TIR区的自由能绝对值每增加 1.4kcal/mol , 基因的翻译起始率即会下降 10%[ 6] 。但
是TIR的范围尚无明确定义 , Ganoza 认为应包括起始密码子上下游 70 个核苷酸的范
围[ 7] , 考虑到本研究中起始密码子上游的序列为载体序列 , 已经过优化 , 我们将重点放
在ATG下游的序列 , 并将调整范围延长到 60 (即 20个氨基酸)个核苷酸 。同时我们也
考虑到密码子的偏好性 , 大肠杆菌稀有密码子的存在会造成很多严重后果:mRNA 的半
衰期降低 , 翻译提前终止 , 和移框突变等[ 8] 。综上所述 , 我们在降低 GC 含量的同时 ,
尽量采用大肠杆菌偏好的密码子。
本研究中菌株No.6的自由能与原始序列相同且较前 5种序列为低 , 但表达量在所
有序列中位居第二 , 与计算机的预测结果并不完全一致 , 可能是由于 TIR内部的碱基有
可能与外部的碱基发生配对 , 形成更大范围的二级结构 , 超出了计算机的分析范围 , 因
此人为地适当延长 TIR范围可以增加预测的可靠性 。
参考 文 献
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　　＊国家自然科学基金资助项目 (No.39970029)
Project Granted by Chinese National Natural Science Fund(No.39970029)
　＊＊联系人　E-mail:zxping@sicau.edu.cn
收稿日期:2001-11-21 , 修回日期:2002-01-10
从豆科植物的根瘤中直接提取根瘤菌 DNA的方法＊
陈　强1 , 2 　张小平1＊＊　李登煜1 　陈文新2 　K.Lindstrm3 　Z.Terefework3
(四川农业大学农学院微生物学系　雅安　625000)1
(中国农业大学生物学院微生物学系　北京　100094)2
(Department of Applied Chemistry and Microbiology , University of Helsinki , Finland　00014)3
摘要:豆科植物的新鲜根瘤经表面灭菌 、 破碎后直接加入 200μL 4mol/L异硫氰酸胍(GUTC)
裂解液混匀 , 离心去掉根瘤残留物 , 再加入适量 RNA 酶 , 37℃温育 30min后 , 加入 20μL硅
藻土吸附液 , 室温处理 15min 离心去掉上清 , 沉淀经 GUTC 裂解液二次处理 , 再分别用洗涤
液 、 70%酒精洗涤。最后 , 硅藻土沉淀经真空干燥 , 加入 20μL超纯水洗涤硅藻土沉淀 , 即
可获得类菌体根瘤菌 DNA。所获得的 DNA可以用于AFLP、 16S rRNA PCR反应。
关键词:豆科植物 , 根瘤 , DNA提取 , AFLP指纹图谱
中图分类号:Q93 　　文献标识码:A 　　文章编号:0253-2654 (2002)06-0063-05
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DOI :10.13344/j.microbiol.china.2002.06.016
ISOLATION OF DNA FROM THE ROOT NODULE OF LEGUME PLANT
Chen Qiang[ 1, 2] 　Zhang Xiao-Ping1　Li Deng-Yu1　ChenWen-Xin2 K.Lindstrm3　Z.Terefework3
(Department of Applied Microbiology , Sichuan Agricultural University Yaan　625000)1
(Department of Microbiology , China Agricultural University Beijing　100094)2
(Department of Applied Chemistry and Microbiology , University of Helsinki , Finland　00014)3
Abstract:The fresh root nodule from the legume plant was surface sterilized, and crashed in an Eppendorf tube , then
mixed with 200μL of GUTC buffer thoroughly , and spinned briefly , the upper phase was transferred to a new Eppendorf
tube , and RNase was added , and the mixture was incubatedat 37℃ for 30min , and 20μL of diatomaceous earth solution
was added andmixed properly.The mixture was incubated at room temperature for 15min, then centrifuged , and discard-
ed the upper phase.The sediments were treatedwithGUTC buffer described as above again, and followed by 3 time rins-
ing of new wash buffer.The sediments were washed by 70%ethanol , and dried in vacuum.20μL of ultrapure water was
used to dissolve the DNA absorbed by diatomaceous earth sediments.After centrifuge , the upper solution was transferred
to another tube , and used as template DNA to do the AFLP and 16S rRNA PCR.The results showed that high quality of
DNA can be obtained by this method.
Key words:Legume plant , Nodule , DNA Isolation , AFLP Fingerprinting
众所周知 , 土壤中的根瘤菌能够同豆科植物的根系形成根瘤 , 将大气中的氮转化为
NH3 , 供植物生长所需。通常 , 研究者们需要从豆科植物根瘤中分离纯化出根瘤菌 , 再
以纯化的根瘤菌为材料 , 研究其形态 、 生理及遗传特性 , 这些根瘤菌为腐生状态。然而
处于共生状态时 , 根瘤菌是以类菌体形式存在于同豆科植物形成的根瘤中 , 其形态及生
理特性均与腐生状态的根瘤菌有差别。因此 , 直接研究根瘤中类菌体形式的根瘤菌的遗
传特性 , 对于揭示根瘤菌与豆科植物 、 环境间共生行为及遗传信息交流具有特殊意义。
如何直接从根瘤中提取类菌体状态根瘤菌的 DNA , 至今未见报道。吴少慧等[ 1]曾
报道了从非豆科植物根瘤中提取痕量放线菌 DNA 的方法 , 可以获得符合质量要求的
DNA。Little[ 2]等介绍了用硅藻土吸附法提取细菌 DNA 的方法 , 该法已被证实可以有效
地提取细菌 DNA[ 3 , 4] 。我们对硅藻土吸附法改进后 , 获得了一种从豆科植物根瘤中快
速 、 简便地提取根瘤菌 DNA的方法 。
表 1　供试菌株及根瘤情况
编号 菌株 属 、 种 豆科植物 瘤重 (g) DNA含量 (ng/μL)
1 Spr2-9 Bradyrhizobium sp. 花生 0.0130 200
2 Spr3-5 Bradyrhizobium sp. 花生 0.0043 180
3 Spr3-7 Bradyrhizobium sp. 花生 0.0021 160
4 Spr4-5 Bradyrhizobium sp. 花生 0.0037 160
5 Spr7-1 Bradyrhizobium sp. 花生 0.0032 160
6 三叶草根瘤菌 Rhizobium sp. 三叶草 0.0039 200
1　材料与方法
1.1　供试根瘤的获得
研究材料为花生和三叶草根瘤 , 供试花生品种为天府花生 , 三叶草为野生品种 。用
于结瘤试验的慢生
花 生 根 瘤 菌 为
Spr2-9 、 Spr3-5 、
Spr3-7 、 Spr4-5 、
Spr7-1 , 其情况见
表 1。
取 7个容积为
·64· 微 生 物 学 通 报　　　　　　　　　　　　2002 年 29 (6)
500mL的玻璃瓶 , 洗净后装入干净的石英砂 , 瓶口用玻璃培养皿盖住 , 160℃干热灭菌
4h , 冷却备用。
取20粒天府花生 , 表面灭菌后用无菌蒸馏水浸泡种子 , 在 25℃培养箱中发芽 , 每
天用无菌蒸馏水换水一次 , 待胚根长出 1 ～ 2cm 后 , 将幼苗移栽到沙培玻璃瓶中 , 加入
适量灭菌的 Jensen营养液 , 25℃光照培养 。待花生的子叶展开后 , 其中 5瓶分别接种
5mL经镜检纯度合格的供试花生根瘤菌菌液 , 另 1 瓶不接菌 , 作对照 。光照培养 25d
后 , 分别采集接种根瘤菌的花生根瘤备用。
野生三叶草植株采集自芬兰赫尔辛基大学 Viiki实验农场 , 经洗涤后随即取根瘤 ,
将根瘤表面灭菌后提取 DNA和分离根瘤菌。
1.2　试剂的准备
1.2.1　GUTC缓冲液:称取 23.26g 异硫氰酸胍 (GUTC)、 0.087g 反式环己二胺四乙酸
(trans-1 , 2-Dianincyclohex-N , N , N , N , -Tetraacetic Acid , 简称 CTDA), 溶解于 20mL
浓度为40mmol/LTris-HCl (pH8.0)缓冲溶液中。待试剂完全溶解后 , 用相同浓度的 Tris-
HCl溶液定容至 50mL即成浓度 4mol/L的GUTC缓冲液。
1.2.2　洗涤缓冲液:按下列组成成分配制 500mL 洗涤缓冲液:无水乙醇 60%, Tris-HCl
(pH8.0)20mmol/L , EDTA (pH8.0)1mmol/L , NaCl 400mmol/L , 用超纯水定容至 500mL ,
贮藏于玻璃瓶中 。
1.2.3　硅藻土吸附缓冲液:称取 5g硅藻土 (Promega公司出品 , 商品名为 Celite), 用 1
×TE缓冲液洗涤硅藻土 3次 , 最后按 1∶1 (w/v)加入 1×TE缓冲液 , 配成硅藻土吸附
液。所有的缓冲液均室温保存备用 。
1.3　DNA提取
1.3.1　从根瘤中直接提取类菌体根瘤菌DNA:取单个根瘤 , 按标准方法进行表面灭菌 ,
将根瘤放入容积为 1.5mL的 Eppendorf管中 , 加入200μL的GUTC缓冲液 , 用无菌玻棒将
根瘤充分压破 、混匀 , 8 ,000 r/min离心 30s , 将上清液转入另一 Eppendorf管 , 加入 30ng
RNA酶 , 37℃温育 30min。
将硅藻土吸附缓冲液充分摇匀 , 每管加入 20μL ～ 30μL 该吸附液 , 振荡均匀后室温
放置 15min , 13 ,000 r/min离心 30s , 弃去上清 , 再加入 200μL GUTC 缓冲液 , 混合均匀
后室温放置 10min , 同上法离心处理。用洗涤缓冲液洗涤上述硅藻土沉淀 3 次 , 每次
300μL , 然后用200μL 70%的酒精洗涤硅藻土沉淀 1次 , 13 ,000 r/min离心 2min , 弃去酒
精溶液 , 真空抽干。最后根据每管加入硅藻土的量 , 向每管加入 20μL ～ 30μL 超纯水 ,
在涡旋振荡器上充分混匀 , 55℃保温 10min , 13000r/min 离心 5min , 小心将上清液移至
另一支已编号的 Eppendorf管 , 该溶液即为从根瘤中提取的DNA样品 。
1.3.2　以纯根瘤菌为材料提取 DNA:将供试的根瘤菌纯菌株分别接种到 3mL 的 TY液
体培养基中 , 28℃、 150r/min振荡培养 5d , 取 1.5mL 菌液于 Eppendorf管中 , 13000r/min
离心 4min , 倾去上清 , 用 1×TE缓冲液洗涤菌体 2次 , 加入 500μL GUTC 缓冲液 , 同上
述方法提取纯根瘤菌株的 DNA。
以已知浓度的λDNA为标准 , 取待测 DNA样品各 1μL , 用 1%的琼脂糖凝胶电泳确
定样品DNA的浓度。全部 DNA样品贮藏于-20℃。
1.4　PCR扩增
为了检测所提取的根瘤 DNA的质量 , 我们进行了AFLP和 16S rRNA扩增试验。
·65·2002年 29 (6)　　　　　　　　　　　　微 生 物 学 通 报
1.4.1　AFLP:AFLP 按Vos[ 5] 、 张小平[ 6]的方法进行 , 5μL供试根瘤菌 DNA样品经酶切
连接后 , 用具有 2个选择性碱基的引物扩增 , PCR产物用 5%的聚丙烯酰胺凝胶电泳分
离 , 再银染。
1.4.2　16S rRNA扩增:选用 fD1和 rD1 为引物 , 反应液组成:Dynazyme 聚合酶缓冲液
(10倍浓度)5μL , dNTPs(10m mol/L)2.5μL , fD1和 rD1引物(20μmol/L)各 1μL , 模板
DNA 50ng , Dynazyme聚合酶 (2U/μL)1μL , 最后用超纯水补足反应总体积 50μL。扩增
反应在PTC-200型 PCR仪上进行 , 反应程序见文献 [ 4] , PCR产物用 1%的琼脂糖凝胶
电泳检测 。
2　结果
2.1　DNA提取结果
采用本法提取根瘤中的类菌体根瘤菌 DNA , 所有样品均获得成功 , DNA浓度较高 ,
并且电泳图谱前端中未见 RNA片段 (图 1), 说明 RNA被完全酶解消除 。
图 1　根瘤及根瘤类菌体 DNA
M　λDNA (200ng/μL), 1-6　分离自根瘤 , 7-12　从根瘤菌纯培
养物提取　1 　Spr2-9 , 2　Spr3-5 , 3　Spr3-7 , 4 　Spr4-5 , 5　
Spr7-1 , 6　三叶草根瘤 DNA , 7　Spr2-9 , 8　Spr3-5 , 9　Spr3-7 ,
10　Spr4-5 , 11　Spr7-1 , 12　三叶草根瘤菌 DNA
图 2　根瘤菌 DNA
的AFLP图谱
M　pGEM Marker , 1　
Spr2-9 , 2　Spr3-5 , 3　
Spr3-7 , 4　Spr4-5 , 5　
Spr7-1, 6　三叶草根瘤
2.2　PCR扩增结果
2.2.1　AFLP 结果:图 2是供试
根瘤菌DNA的AFLP 图谱 ,可见
AFLP 指纹图谱很清晰 ,效果很
好。图 3是从供试根瘤中提取
的类菌体根瘤菌 DNA 的 AFLP
指纹图谱 ,显然 ,其结果同供试
根瘤菌DNA的AFLP 图谱相同 。
2.2.2　16S rRNA 的扩增结果:
图4 结果表明 , 不论是根瘤菌
DNA , 还是类菌体根瘤菌 DNA , 均能顺利扩增出 16S rRNA 片段 ,
PCR产物片段大小为1.5kb , 符合细菌16S rRNA基因片段大小范围 。
3　讨论
根瘤菌与豆科植物根系形成根瘤后 , 主要以类菌体形式存在于
根瘤中[ 8] 。类菌体没有细胞壁 , 容易为 GUTC 缓冲液裂解 , 因此类
菌体DNA更容易进入缓冲液。异硫氰酸胍 (GUTC)是一种蛋白质
强变性剂[ 7] , 能够使细菌细胞的蛋白质变性而沉淀 , 经过洗涤缓冲
液的充分洗涤 , 可除去绝大部分蛋白质 。硅藻土的成分是 SiO2 , 由
于粒径小 、 比表面积大 , 具有较强的吸附力 , 能够吸附溶解于缓冲
液中的 DNA , 洗涤去除蛋白质后再用超纯水洗脱硅藻土 , 即可得到
纯度较高的 DNA 样品 。本研究中采集的根瘤 , 鲜重介于 0.0021 ～
0.013g 之间 , 而提取的 DNA浓度均超过 100 ng/μL , DNA 总体积可
以达到 20 ～ 30μL , 能够满足根瘤菌遗传学特性研究的需要 。
根瘤中的类菌体处于生理活跃状态 , 含有大量的 RNA , 在缓冲
液中加入 RNA酶 , 并在 37℃条件下温育 30min , 即可去除 RNA 。此
·66· 微 生 物 学 通 报　　　　　　　　　　　　2002 年 29 (6)
图 3　根瘤类菌体
DNA 的AFLP图谱
M: pGEM Marker , 1:
Spr2-9 , 2: Spr3-5 , 3:
Spr3-7 , 4: Spr4-5 , 5:
Spr7-1 , 6:三叶草根瘤
结果似乎与GUTC 的作用特点相矛盾 , 因为 GUTC 的作用是使蛋白
质变性 。可能的原因包括:由于实验过程中 RNA 酶用量较大 ,
GUTC 缓冲液不能完全使 RNA酶变性;RNA酶活性很强 , 能够部分
抵抗GUTC缓冲液的变性能力 , 并能发挥酶切 RNA的功能 。实验中
采用GUTC缓冲液处理样品两次 , 目的是使根瘤类菌体细胞充分破
碎以获得大量的 DNA , 同时 , 第二次加入的 GUTC 缓冲液也起着使
菌体蛋白质和 RNA酶进一步失去活性的作用 。采用该种方法提取
DNA , 固然不可能彻底去除菌体中所有的蛋白质 , 但实验结果表明 ,
用该方法获得的 DNA , 其质量能够达到 AFLP 、 16S rRNA 扩增的要
求。我们用本方法从花生植株根系随机采集了 50 多个根瘤 , 提取
DNA , 并进行了 AFLP 特性分析 , 全部获得成功。由于植物细胞具
有较厚的细胞壁 , 应用该方法提取豆科植物根瘤中类菌体 DNA时 ,
不会将植物细胞中的 DNA提取出来 , 我们的结果已证明了这一点
(图 2 、图 3), 接种前的根瘤菌 DNA的AFLP指纹图谱与从根瘤中提
取的类菌体根瘤菌 DNA的AFLP 指纹图谱基本相同。但由于两次电
泳后在染色时间上存在一些差异 , 因而图 2和图 3中 AFLP 指纹图
谱颜色的深浅略有不同。
图 4　16S rRNA PCR 结果
M　1kb 梯级分子量标准 , 1-6　根瘤菌 DNA 的 PCR 产物　7-12　根瘤菌
DNA的 PCR产物　1　Spr2-9 , 2　Spr3-5 , 3　Spr3-7 , 4　Spr4-5 , 5　Spr7-
1, 6　三叶草根瘤DNA 7　Spr2-9 , 　Spr3-5, 9　Spr3-7 , 10　Spr4-5 , 11　
Spr7-1, 12　三叶草根瘤菌 DNA
本实验除了用盆栽方式 ,
用已知的慢生花生根瘤菌菌
株与花生植株所结的根瘤为
材料外 , 还采集了野生的三
叶草根瘤 , 目的在于检验方
法的可行性。实验结果说明 ,
无论是盆栽 、 还是野生的豆
科植物 , 只要能获得新鲜根
瘤 , 即可采用此方法从根瘤
中获得较高质量的根瘤菌
DNA。因此 , 本方法可以用于根瘤菌生态学特性研究。
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