全 文 ：西北农业学报　2011 , 20(11):89-93
Acta A griculturae Boreali-occidentalis Sinica
会泽铅锌尾矿区豆科植物根瘤菌的耐铅锌
及 16S rDNA PCR-RFLP研究*
缪福俊 ,熊　智 ,李　彪 ,龚秀会 ,孙　浩
(西南林业大学 ,西南山地森林资源保育与利用省部共建教育部重点实验室 ,昆明　650224)
摘　要:对 21 株分离自会泽铅锌尾矿区豆科植物根瘤菌进行耐复合铅锌双盐抗逆性及 16S rDNA
PCR-RFLP研究 ,结果表明 , 该区的豆科植物根瘤菌对铅锌双盐具有良好的耐性能力 , 筛选出 HSY6 和 HZH2
两株抗性能力强的菌株 ,分别与三叶草 、紫花苜蓿共生。 21 株供试菌株的 16S rDNA PCR-RFLP 在 73%的相
似水平上分为 5 个遗传群 ,分别为慢生根瘤菌属(2株)、中慢生根瘤菌属(5 株)、中华根瘤菌属(1 株)、土壤杆
菌属(3 株)、根瘤菌属(10株)。供试根瘤菌类群对重金属铅锌的耐性为慢生根瘤菌属>中慢生根瘤菌属>中
华根瘤菌属>土壤杆菌属>根瘤菌属。
关键词:会泽铅锌尾矿区;根瘤菌;耐铅锌双盐;16S rDNA PCR-RFLP
中图分类号:X172　　　　文献标志码:A　　　　　文章编号:1004-1389(2011)11-0089-05
Tolerance to Lead-zinc Stress and 16S rDNA PCR-RFLP of Rhizobia Isolated
from Nodules of Leguminous Plants in Huize Lead-zinc Mining Tailings
MIAO Fujun , XIONG Zhi , LI Biao , YANG Diling , GONG Xiuhui and SUN Hao
(Key Laboratory for Forest Resou rces Con servation and Use in the S outhw es t Mountains of China ,
Minis try of Educat ion , Sou thw est Fo rest ry University , Kunming　650224 , China)
Abstract:The double lead-zinc tolerance of 21 rhizobia st rains w ere studied fo r the sake o f using Leg-
ume-rhizobia symbio sis to improve ecolo gical environment in Huize lead-zinc mining tailings. The re-
sults showed that The resul ts show ed that the capability to tolerate double lead and zinc w as strong.
2 stains of HSY6 isolated f rom nodules of Trifo lium repens ,HZH2 isola ted f rom nodules of Lespedza
fo rmosa show ed the highest to lenrance to lead-zinc. The dendrog ram of 21 rhizobia st rains 16S rDNA
PCR-RFLP f ingerprinting we re revealed that there a re five genet ic g roups at 73% similarity level.
G roup 1 is B radyhizobium (2 st rains). Group 2 is Mesorhizobium (5 strains). Group 3 is Sinorhizobi-
um (1 st rain). G roup 4 is Agrobacterium (3 st rains). Group 5 Rhizobium (10 strains). The sequence
of genet ic g roups to tolerate double lead and zinc sal t is that:Bradyhizobium>Mesorhizobium>Sino-
rhizobium>Agrobacterium>Rhizobium.
Key words:Huize lead-zinc mining tailings;Rhizobia;The double lead-zinc tolerance;16S rDNA PCR-
RFLP
　　会泽铅锌尾矿区位于云南省东北部 ,其采矿
历史最早可追溯到西汉时期 ,由于长期 、大面积开
矿 、冶矿 ,便得铅锌尾矿区规模较大[ 1] 。铅锌尾矿
区土壤恶化 、土壤重金属含量过高 ,污染严重 ,植
被稀疏 , 急待生态恢复[ 2-3] 。重金属毒性和养分
不足是尾矿区植被恢复的最重要限制因子 ,而氮
素的不足又是养分不足的核心问题[ 4-6] 。将具有
天然共生关系的豆科植物-根瘤菌固氮体系应用
* 收稿日期:2011-04-15　　修回日期:2011-06-11
基金项目:国家自然科学基金(30860067)项目;西南林业大学大型仪器设备共享平台资助。
第一作者:缪福俊 ,男 ,硕士研究生 ,研究方向植物学。 E-mail:miaofujun@yeah. net
通讯作者:熊　智 ,男 ,博士 ,教授 ,从事固氮微生物和环境科学教学和科研。 E-mai l:zhix65. sw fc@gm ail. com
到重金属污染土壤中不仅能促进土壤营养元素特
别是 N 元素的循环和积累 ,而且可以吸附重金属
或转化其形态 ,降低毒性 ,从而将微生物修复和植
物修复结合起来 。但在矿业废弃地上种植豆科植
物的技术问题是寄主植物 、根瘤菌和它们的共生
体系对矿区废地特别是重金属毒性的耐受能力 ,
因此筛选具有优良抗性的根瘤菌成为该领域研究
的关键之一[ 7-8] 。会泽铅锌尾矿区植被稀疏 ,大部
分是耐重金属 、耐贫瘠的豆科植物和草本植物[ 9] 。
豆科植物如三叶草 、野豌豆 、猪屎豆等是尾矿区常
见的豆科植物 ,豆科植物是被调查的兰坪及会泽
铅锌尾矿区植被中的优势植物 ,具有耐贫瘠 、耐重
金属的特点 ,是改良土壤的优良植物[ 10-11] 。
但目前国内外对铅锌尾矿区豆科植物根瘤菌
的研究鲜见报道 。本研究对该尾矿区自然生长豆
科植物根瘤菌进行耐重金属及生理生化分析 ,希
望筛选到耐性强的优良根瘤菌 ,在尾矿区植被恢
复初期时使用 。如接种胡枝子根瘤菌可以明显提
高胡枝子共生固氮作用 ,为胡枝子提供生长所需
的氮营养元素[ 12] 。采用微生物菌剂浸种玉米种
子 ,可以促进种子萌发 ,提高发芽势 、发芽率 ,改善
幼苗出苗状况[ 13] 。在恢复尾矿区时可将根瘤菌
拌种于豆科植物的种子 ,与豆科植物形成共生固
氮体系从而增强宿主植物对重金属的耐受性 。而
且这种体系能长期固定空气中的氮 ,增加尾矿区
土壤中的氮肥 ,改良土壤 ,为后期其他植物的入侵
或引入创造条件 ,可作为恢复植被的先锋植物。
1　材料与方法
1. 1　供试菌株采集 、分离纯化与保存
2009年 9 月于会泽铅锌尾矿区采集自然生
长的豆科植物种子及根瘤 ,带回实验室备用 。根
瘤菌株采用 YMA 培养基平板法分离纯化 ,得到
21株根瘤菌(表 1),经活化后待用 。
表 1　会泽铅锌尾矿区优势豆科植物根瘤菌
Table 1　The dominant rhizobia of leguminous plants in Huize lead-zinc mining tailings
菌株 St rain 宿主植物 Hos t plants
H SY3 、HSY5 、HSY6 、HSY12 、H SY14 三叶草 Tri fol ium repens L.
H YW1 、HYW5 、HYW6 、HYW9 野豌豆 Vicia sep ium Linn
H ZS2 、HZS3 、HZS5 猪屎豆 Crota lar ia mucrona ts Desv.
H ZH1 、HZH 2 、HZH 5 、HZH 8 、HZH 11 紫花苜蓿 Med ica go sativa L.
HML2 、HML4 、HML6 、HM L7 美丽胡枝子 Lesp ed za f ormosa (Vog.) Koehne
表 2　不同 Pb2+ 、Zn2+浓度
Table 2　Different Pb, Zn concentrations
mmol L - 1
编号 Code Pb 2+ Zn2+
1 1. 0 2. 0
2 2. 0 3. 0
3 3. 0 4. 0
4 4. 0 5. 0
5 5. 0 6. 0
1. 2　供试菌株对复合铅锌双盐的耐性试验
按剂量添加 0. 1 mo l L - 1的 ZnSO 4 7H 2O
和 Pb(C2H 3O 2) 3H 2O 母液于灭好菌的 YMA
培养基 ,制成含不同浓度的复合铅锌双盐重金属
选择性培养基平板 ,双盐浓度如表 2 ,将供试菌株
接种在含有复合铅锌双盐胁迫的选择性平板上 ,
以无重金属的 YMA 平板作为阳性对照 ,接种 ,培
养 ,观察记录同上。
1. 3　供试菌株 DNA提取
对 21株供试菌株及 5 株参比菌株(Ⅰ .中慢
生 根 瘤 菌 属 NZP2213;Ⅱ. 土 壤 杆 菌 属
LAM13569;Ⅲ.中华根瘤菌属 USDA1002;Ⅳ.慢
生根瘤菌属 CCBAV1007;Ⅴ. 根瘤菌属 H14)采
用 DNA 提取试剂盒(上海天根化工有限公司)提
取菌株 DNA 。
1. 4　16S rDNA扩增
引物选择 　正向引物:5′-AGA GTT TGA
TCC TGG CTC AGA ACG AAC GCT-3′;反向引
物:5′-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT TCA
CCC C-3′(由上海生工生物工程有限公司合成)。
反应体系 　10 倍缓冲液 5 μL , MgC l2 (25
mmo l L - 1) 5. 0 μL ,正向引物 10 μL ,反向引物
10μL , dN TPs(25 mmo l L -1) 3. 0 μL , DNA 模
板 2. 0 ng , Taq DNA 聚合酶 2. 5μL ,灭菌水加至
50 μL (Taq DNA 聚合酶在预变性后冰浴上加
入)。
反应程序　94 ℃预变性 5 min , 94 ℃变性
1 m in ,56 ℃退火 1 min ,72 ℃延伸3 min;30个循
环 ,72 ℃终延伸 5 min。
PCR产物检测　经ρ=8 g L - 1琼脂糖凝胶
电泳后 EB 染色观察 ,用凝胶成像仪照相 。
90 西　北　农　业　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　20 卷
1. 5　16S rDNA PCR产物酶切电泳分析
用限制性内切酶 HaeⅢ和 HindⅢ对上述的
16S rDNA 扩增产物进行酶切 , 其反应体系为:
HaeⅢ 15 μL ;HindⅢ 15 μL;10 倍缓冲液2 μL;
DNA≤10 ng;灭菌水补充到 20 μL。37 ℃下反
应 8 ～ 9 h ,酶切后 ,经ρ=8 g L - 1的琼脂糖凝胶
分离酶切片段 , EB染色观察 ,用凝胶成像仪照相 。
用限制性内切酶 Hinf Ⅰ和 TaqⅠ对上述的
16S rDNA 进行酶切 , 其反应体系为 Hinf Ⅰ 15
μL;TaqI 15 μL;10 倍基本缓冲液 2 μL;w =
0. 1%BSA 2 μL;DNA ≤10 ng ;灭菌水补充到
20 μL。37 ℃下反应 2 ～ 3 h 后再于 65 ℃下反应
2 h ,经ρ=8 g L -1琼脂糖凝胶分离酶切片段 ,
EB 染色观察 ,用凝胶成像仪照相 。
将电泳结果图转化成 0 、1数据 ,即在不同菌
株之间相同的迁移率上有条带的记为“1” ,没有条
带的记为“0” 。用平均连锁法(U PMGA)生成聚
类图 。
2　结果与分析
2. 1　供试菌株对复合铅锌双盐的耐性分析
由 表 3 可 知 , 62% 菌 能 在 Pb2+
1 mmol L - 1 、Zn2+ 2 mmol L -1双盐胁迫下生
长 ,38%的菌株能在 Pb2+ 2. 0 mmo l L - 1 、Zn2+
3. 0 mmol L -1双盐胁迫下生长 ,表明菌株对复
合铅锌双盐的具有一定的耐性能力 。其中 2株菌
HSY6和 HZH2为高耐复合铅锌菌株 ,可以耐受
Pb2+ 4. 0 mmo l L - 1 、Zn2+ 5. 0 mmo l L - 1双盐
胁迫 , 其次是 HZS2 、HML7 和 HYW5。但在
Pb2+ 、Zn2+共同胁迫下时 ,菌株的耐性能力弱于
Pb2+ 、Zn2+单独胁迫时的抗性 ,说明根瘤菌在铅
锌离子双因素胁迫下的生长情况与单因素不同 ,
在铅锌共同胁迫下对菌株的毒害作用大 。
Ca rrasco 等[ 14] 在黄铁矿溢出污染区 ,分离得
到 41株耐 2. 4 mmo l L - 1 Pb2+的菌株。聂湘平
等[ 15]发现 , 大叶相思的根瘤菌 , 可以耐受小于
10. 0 mmol L -1 Zn2+浓度 。和已有的研究对比
显示 ,该菌株对 Zn2+ 、Pb2+的抗性能力较强 ,值得
进一步研究。
2. 2　16S rDNA PCR-RFLP结果分析
采用通用引物对 21株供试菌株和 5株参比
菌株的 16S rDNA 扩增 ,结果显示(图 1),均有
1 500 bp左右的扩增条带。
　　从图 2 可知 ,只用限制性内切酶 Hand Ⅲ及
HaeⅢ酶切时 ,不能充分反映会泽铅锌尾矿区豆
科植物根瘤菌多样性 , 其原因可能是内切酶
Hand Ⅲ及 HaeⅢ的酶切位点主要以含 G 、C 的序
列为主 ,不能把 16S rDNA PCR产物充分酶切
(图 2-a)。另外 2 种限制性内切酶 Hanf Ⅰ及
TaqⅠ对 16S rDNA PCR进行酶切 ,结果显示 ,
Hanf Ⅰ及 TaqⅠ对 16S rDNA PCR进行酶切后
的琼脂糖凝胶电泳图谱与 HandⅢ及 HaeⅢ 酶切
后的完全不相同 ,没有明显的共有带 ,条带丰富 ,
多态性良好(图 2-b)。
表 3　双盐对根瘤菌生长的影响
Table 3　Effects of double salt concentrations on growth of rhizobia
菌株
S t rain
对照
CK
编号 Code
1 2 3 4 5
菌株
St rain
对照
CK
编 号 C ode
1 2 3 4 5
HSY3 + - - - - - H ZS5 + + + - - -
HSY5 + - - - - - HZH 1 + - - - - -
HSY6 + + + + + - HZH 2 + + + + + -
HSY12 + + - - - - HZH 5 + + - - - -
HSY14 + + - - - - HZH 8 + + + - - -
HYW1 + - - - - - HZH 11 + - - - - -
HYW5 + + + + - - HM L2 + + + - - -
HYW6 + + - - - - HM L4 + - - - - -
HYW9 + - - - - - HM L6 + + - - - -
HZS2 + + + + - - HM L7 + + + + - -
HZS3 + - - - - -
注:“ +”生长;“ -”不生长。
Note:Tolerance to dou ble salt sign“ +” ;Sensit ive to d oub le salt sign “ - ” .
91 11 期　　　　　　缪福俊等:会泽铅锌尾矿区豆科植物根瘤菌的耐铅锌及 16S rDNA PC R-RFLP 研究
　　根据种属之间的关系大致可将 21 株供试菌
株在 73%的相似水平分为 5个遗传群(图 3)。
群 Ⅰ 为慢生根瘤菌属 , 由 2 株供试菌株
HSY6 、HZH2 组成 , HSY6和 HZH2 为高耐铅 、
锌及复合铅锌菌株 ,能在 Pb2+ 5. 0 mmol L - 1 、
Zn2+ 6. 0 mmol L - 1的单盐胁迫及在 Pb2+ 4. 0
mmo l L - 1 、Zn2+ 5. 0 mmol L - 1双盐胁迫下表
现出极强的耐铅 、锌能力 。其宿主植物分别与三
叶草 、紫花苜蓿共生 ,说明慢生根瘤菌属的菌株具
有很强的耐铅锌能力 。
群Ⅱ为中慢生根瘤菌属 ,由 5株供试菌株组
成 , 分 别 是 HZS2 、 HML7 、 HYW5 、 HML4 、
HZH11 , 其中 HZS2 、HML7 和 H YW5 能在
Pb2+4. 0 mmol L - 1 、Zn2+ 5. 0 mmo l L - 1的单
盐胁迫及在 Pb2+ 3. 0 mmo l L - 1 、Zn2+ 4. 0
mmo l L - 1双盐胁迫下表现出较强的耐铅 、锌能
　　M . 100 bp DNA ladder;1～ 12.不同菌株 Dif ferent s t rains
图 1　部分扩增出的 16S rDNA片段
Fig. 1　Part of the 16S rDNA fragments amplified
力 ,分别与猪屎豆、美丽胡枝子和野豌豆共生 ,说明
中慢生根瘤菌属的菌株具有较高的耐铅锌能力。
群Ⅲ为中华根瘤菌属 ,只由 1株分离自三叶
草 的 HML2 供 试 菌 株 组 成 , 在 Pb2+
3. 0 mmol L -1 、Zn2+ 3. 0 mmol L - 1的单盐胁迫及
在Pb2+ 2. 0 mmol L- 1 、Zn2+ 3. 0 mmol L- 1 双盐
胁迫下具有一定的耐性能力 ,说明中华根瘤菌属
的菌株具有一定的耐铅锌能力 。
群Ⅳ是土壤杆菌属 ,由 3株供试菌株组成 ,分
别是 HSY5 、HZH8 、HML6 , 其 HZH8 在 Pb2+
2. 0 mmol L - 1 、Zn2+3. 0 mmo l L - 1双盐胁迫
下具有一定的耐性能力 , HML6 在 Pb2+ 1. 0
mmo l L - 1 、Zn2+ 2. 0 mmol L - 1双盐胁迫下具
有一定的耐性能力 , HML6 无耐铅锌的能力 ,说
明土壤杆菌属菌株的耐铅锌能力较弱。
群Ⅴ为根瘤菌属 ,为最大遗传群 ,由 10株供
试菌株组成 , 占了整个供试菌株的 50%左右 ,
50%的菌株没有耐铅锌的能力 ,只有 10%的菌株
可以 耐 受 Pb2+ 2. 0 mmol L - 1 、 Zn2+
3. 0 mmol L - 1双盐胁迫 ,说明根瘤菌属的菌株
耐性普遍较低 。
慢生根瘤菌比快生根瘤具有较强的耐重金属
特性 ,筛选到的高耐铅锌性菌株为慢生根瘤菌 ,而
未筛选到根瘤菌属的菌株 。供试根瘤菌对重金属
的耐铅性表现为慢生根瘤菌属>中慢生根瘤菌属
>中华根瘤菌属>土壤杆菌属>根瘤菌 。这与已
有的研究结果[ 16] 基本一致 。
　　M . 100 bp DNA ladder;泳道上数字表示不同菌株 The numbers in the lane presentat ion di fferent st rain s
图 2　部份根瘤菌的 16S rDNA PCR产物经 HandⅢ 、HaeⅢ及 HanfⅠ 、TaqⅠ酶切后的电泳图谱
Fig. 2　Agarose gel electrophoresisof amplified 16S rDNAs digested with HandⅢ ,
HaeⅢ and HanfⅠ , TaqⅠ from several rhizobial
92 西　北　农　业　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　20 卷
　　Ⅰ.慢生根瘤菌属 CCBAV 10071 B rad yhizobium CCBAV 10071 ;Ⅱ.中慢生根瘤菌属NZP2213 Mesorhizobium NZP2213 ;Ⅲ.中华根瘤
菌属 USDA1002 S inorh izobium USDA1002 ;Ⅳ.土壤杆菌属 LAM13569 A grobacter ium LAM13569;Ⅴ.根瘤菌属 H14 Rh izobium H14
图 3　16S rDNA PCR-RFLP 聚类树状图
Fig. 3　Dendrogram of rhizobial 16S rDNA PCR-RFLP f ingerprinting
3　结论与讨论
会泽铅锌尾矿区的 21株根瘤菌对复合铅锌
双盐胁迫具有良好的耐性能力 ,与三叶草共生的
HSY6和与紫花苜蓿共生的 HZH22株菌对铅锌
的胁迫表现出很高的耐受性。
21株供试菌株的 16S rDNA PCR-RFLP 在
73%的相似水平上分为 5 个遗传群 ,对铅锌的耐
受性表现为慢生根瘤菌属(2 株)>中慢生根瘤菌
属(5株)>中华根瘤菌属(1株)>土壤杆菌属(3
株)>根瘤菌属(10株)。
采用 16S rDNA PCR-RFLP 技术对会泽铅
锌尾矿区 21株根瘤菌株进行初步分类 ,在一定程
度上能反映出会泽铅锌尾矿区优势豆科植物根瘤
菌的遗传多样性 ,所提供的物种遗传背景信息可
对分析种质资源遗传差异 、会泽铅锌矿区豆科植
物-根瘤菌共生关系 、改良土壤和植被与生态恢复
奠定理论基础。若能应用与豆科植物共生的高耐
铅锌根瘤菌来增强宿主植物在极端重金属胁迫环
境下的抗逆性 ,保证宿主植物在尾矿区能自然生
长 ,可进一步改良土壤 ,为后期其他植物的入侵或
引入创造条件 ,从而逐渐恢复尾矿区的植被 ,这种
修复途径具有广阔的应用前景 。
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