全 文 ：收稿日期:2007-03-24
基金项目:国家自然科学基金(10505018);河南省自然科学基金(511030400)
作者简介:焦 浈(1976-),女 ,河南新乡人 ,博士 ,副教授 ,主要从事小麦遗传育种研究。
禾本科作物基因组 AFLP分析体系的建立及优化
焦 浈 ,孙 营 ,李 娜 ,秦广雍
(郑州大学 河南省离子束生物工程重点实验室 ,河南 郑州 450052)
摘要:以禾本科作物小麦为出发材料 , 通过优化 AFLP选择性扩增步骤的 4个限制性因素:Mg2+浓度 、dNTP 浓度 、
引物浓度和预扩产物稀释倍数 ,确立 AFLP最佳反应体系为:预扩增产物稀释 20倍吸取 2 μL 做为选择性扩增模板 ,混
合1.5 mmol/L MgCl2 , 0.2 mmol/ L dNTPs , 0.4 μmol/ L选扩引物 、1U Ex Taq进行选择性扩增。应用该体系分析水稻和玉
米两大类禾本科作物基因组 DNA 样品 ,同样取得理想结果 , 扩增出清晰可辨且适量的电泳条带。该技术体系为 AFLP
分子标记技术在禾本科作物遗传分析中的广泛应用奠定了基础。
关键词:AFLP;选择性扩增;禾本科作物;小麦;水稻;玉米
中图分类号:S51 文献标识码:A 文章编号:1000-7091(2007)04-0108-04
Establishment and Optimization of AFLP System for Gramineous Crop Genome
JIAO Zhen ,SUN Ying ,LI Na ,QIN Guang-yong
(Henan Provincial Key Laboratory of Ion Beam Bioengineering ,Zhengzhou University ,Zhengzhou 450052 ,China)
Abstract:After studying the four factors of selective amplification , Mg2+ concenctration , dNTP concenctration ,
primer concenctration and dilution times of pre-amplified product , the optimized system of AFLP for wheat was built:tak-
ing 2 μL of 20 times dilution of preamplification products as amplification template , adding 0.4 μmol/L of selective
primer combinations ,1.5 mmol/L of MgCl2 ,0.2mmol/L of dNTPs and 1U of Ex Taq polymerase.The AFLP system was
confirmed by analyzing the genomic DNA of maize and rice.The results laid a foundation for broadly using the AFLP tech-
nology in genetic analysis of gramineous crops.
Key words:AFLP;Selective amplification;Gramineous crop;Wheat;Rice;Maize
扩增片断长度多态性(Amplified Fragment Length
Polymorphism , AFLP)技术是 1993 年由 Zabeau[ 1] 发
现 ,并由 Vos 发展起来的一项专利技术。其原理是
基于 PCR 技术扩增基因组 DNA 限制性酶切片
段[ 2] 。AFLP 实质是 RFLP 和 RAPD 相结合的产物 ,
既具有RFLP 的稳定性 ,又有 RAPD的灵敏性 。多态
性极其丰富 , DNA 用量少 ,检测效率高 ,可靠性好 ,
重复性高 ,是一种十分理想的分子标记。该技术目
前已广泛应用于禾本科作物遗传图谱构建[ 3 ,4] 、标
记和定位目的基因[ 5 ,6] 、种质资源鉴定[ 7 , 8]及遗传多
样性分析[ 9 ,10]等研究领域 ,有着广阔的应用前景 。
由于 AFLP 技术涉及到基因组 DNA 的提取 、限
制性酶切 、接头连接 、预扩增 、选择性扩增 、凝胶电泳
以及染色等诸多步骤 ,应用中 ,往往要花费大量的时
间 、药品及精力 ,如果能够优化并确立一种广适性的
AFLP技术体系将会大大减少前期的摸索性工作 ,同
时可以加快 AFLP 技术的推广应用 。本研究室对
AFLP各步骤进行体系优化研究时发现 ,选择性扩增
对最终试验结果影响最大 。因此 ,本研究以小麦为
出发材料 ,重点研究选择性扩增步骤的限制因素 ,筛
选出最佳反应体系 ,从而为禾本科作物 AFLP 分子
标记分析提供一种有效的技术体系。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 基因组 DNA材料来源 小麦材料为豫麦 52
号 ,水稻材料为香稻 1号 ,玉米材料为郑单 14号。
1.1.2 主要试剂及产地 植物基因组 DNA快速提
华北农学报·2007 , 22(4):108-111
取试剂盒(北京鼎国)。酶类:EcoR I(Promega)、Pst I
(Promega)、Mse I(上海生工)、T4 DNA 连接酶
(Promega)、Ex Taq DNA聚合酶(大连宝生物)。接头
及引物由北京奥科生物合成。
选择性扩增引物为 EcoR I-ACT , Pst I-AAC ,
MseI-CAG ,MseI-CTA ,MseI-CTT。
1.2 试验方法
1.2.1 基因组 DNA的提取 使用植物基因组 DNA
快速提取试剂盒 ,每个材料提取15个单株的基因组
DNA ,然后从每个单株 50 μL DNA溶液中取出 5 μL
混成基因池 ,做为AFLP分析的模板 。
1.2.2 基因组 DNA的检测 用 0.8%琼脂糖凝胶
电泳检测基因组 DNA的质量。
1.2.3 限制性内切酶酶切与接头连接 选用
EcoR I和 MseI双酶切小麦基因组 DNA ,选用 Pst I和
MseI双酶切水稻 、玉米基因组 DNA ,然后用 T4 DNA
连接酶将 EcoR I 、Pst I、MseI接头与酶切片段连接起
来 ,做为预扩增的模板。
1.2.4 预扩增 以酶切连接产物为 DNA模板 ,用
EcoR I、PstI 和MseI预扩引物进行预扩增 。
1.2.5 选择性扩增 选用 EcoR I-ACT 和MseI-CAG
引物组合进行选择性扩增 ,对 Mg2+浓度 、dNTPs浓
度 、引物浓度以及模板DNA的浓度设置梯度(表1),
优化选择性扩增体系 。产物经 1.2%琼脂糖凝胶电
泳后 ,筛选出最佳的浓度配比 。
表 1 选择性扩增体系优化的变量梯度
Tab.1 Regent concentration using for optimizing
selective amplification
Mg
2+浓度
/(mmol/L)
Mg
2+
concentration
dNTPs浓度
/(mmol/L)
dNTPs
concentration
引物浓度
/(μmol/ L)
Primer
concentration
预扩产物稀释倍数
Dilute times
of pre-amplified
product
1 0.1 0.05 0.06 5×
2 0.3 0.10 0.1 10×
3 0.5 0.15 0.2 20×
4 1.0 0.20 0.3 30×
5 1.5 0.25 0.4 40×
6 2.0 0.30 0.5 50×
7 2.5 0.6
8 3.0
1.2.6 凝胶电泳 选择性扩增产物首先经过 1.2%
琼脂糖凝胶电泳 ,证实是否有产物以及产物分子量的
大概范围。然后进行 6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。
1.2.7 银染显色 参照文献[ 2]的方法并稍做改进。
2 结果与分析
2.1 基因组 DNA的质量
高质量基因组 DNA的制备和避免降解是 AFLP
成功的关键 ,因为AFLP 方法经过限制性酶切 、预扩
增后 ,模板被纯化 ,浓度显著提高 ,所以对 DNA浓度
没有过高要求 。但是如果模板 DNA 不纯会造成限
制性酶切不完全 ,从而产生不真实的多态性条带 ,使
试验结果失去真实性。因此 ,在制备过程中要特别
注意避免核酸酶及各种失活物质的污染。本研究得
到的基因组 DNA(图 1),条带均一性好 ,没有拖尾 ,
亮度相近 , 说明 DNA 质量高 , 完整性好 , 适合做
AFLP分析。
M.Marker;1～ 8.小麦单株基因组 DNA
1-8 represent genomic DNA of single wheat plant
图 1 进行 AFLP 分析的小麦基因组 DNA 电泳图谱
Fig.1 Pattern of wheat genomic DNA for AFLP analysis
2.2 Mg2+浓度对选择性扩增的影响
在扩增反应体系中 ,Mg2+直接影响到 Taq DNA
聚合酶的活性 ,选择最佳的Mg2+浓度不仅有利于酶
活性的提高从而增加扩增片段的产率 ,而且对于反
应特异性 ,引物的退火 ,模板和 PCR产物的解链温
度以及引物二聚体的形成等均有影响[ 11] 。Mg2+浓
度过低时 ,扩增产物减少甚至没有产物;Mg2+浓度
过高时 ,非特异性扩增明显增加(图 2)。根据电泳
结果 ,确定1.5 mmol/L Mg2+为最佳浓度。
M.DNA Marker DL2000;1～ 8:Mg2+浓度依次为 0.1 ,
0.3 , 0.5 , 1.0 , 1.5, 2.0, 2.5 ,3.0 mmol/ L
1-8 represent different concentration of Mg2+
图 2 不同Mg2+浓度的选扩图谱
Fig.2 Pattern of selective amplification
using different concentration of Mg2+
2.3 dNTPs浓度对选择性扩增的影响
dNTPs浓度对扩增的影响效应与 Mg2+正相反 ,
dNTPs浓度过低时 ,造成非特异性扩增增加;dNTPs
浓度过高时 ,扩增产物会逐渐减少(图 3)。根据电
泳结果 ,确定 0.2 mmol/L dNTPs为最佳浓度 。
4期 焦 浈等:禾本科作物基因组 AFLP分析体系的建立及优化 109
2.4 选择性扩增引物浓度对选择性扩增的影响
一般认为 ,引物浓度越高 ,PCR的扩增效率也越
高。图4表明 ,较低的选扩引物浓度得到的扩增产
物较少 ,而随着选扩引物浓度的增加 ,扩增产物逐渐
增多 ,但当引物浓度过高时 ,扩增出的片段会急剧变
小 ,出现非特异性扩增 。因此确定 0.4 μmol/L 选扩
引物为最佳浓度 。
M.DNA Marker DL2000;1～ 6.dNTPs浓度依次为
0.05 ,0.1 ,0.15, 0.2 ,0.25 , 0.3 mmol/ L
1-6 represent different concentration of dNTP
图 3 不同 dNTPs浓度的选扩图谱
Fig.3 Pattern of selective amplification
using different concentration of dNTP
M.DNA Marker DL2000;1～ 7.引物浓度依次为
0.06 , 0.1 , 0.2 , 0.3, 0.4, 0.5 ,0.6μmol/ L
1-7 represent different concentration of primer
图 4 不同引物浓度的选扩图谱
Fig.4 Pattern of selective amplification
using different concentration of primer
M.DNA Marker DL2000;1～ 6.预扩产物稀释倍数依次为
5 ,10 , 20 , 30 , 40 , 50倍
1-6 represent different dilute times of pre-amplif ied product
图 5 预扩产物稀释不同倍数的选扩图谱
Fig.5 Pattern of selective amplification using different
concentration of pre-amplified product
2.5 模板 DNA的浓度对选择性扩增的影响
因为 AFLP 对模板 DNA 质的要求远高于量 ,所
以 ,模板 DNA的量在数十倍的范围内变动都不会影
响到扩增的结果。正如图 5 所示 ,预扩产物在稀释
5 ～ 50倍作为模板进行选扩时 ,得到的扩增结果基
本上一致 ,因此选择常用的稀释 20倍作为模板 。
2.6 条件优化后小麦 AFLP分析体系的确立
通过对 AFLP 体系选择性扩增条件的优化选
择 ,确立了适合于小麦基因组的 AFLP 反应体系。
扩增产物首先经 1.2%琼脂糖凝胶电泳证实是否有
产物 ,然后用 6%变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳及
银染 。银染显色后 ,每个泳道可呈现出 30 ～ 50条谱
带 ,条带清晰可辨 ,能检测到的片段大小在 200 ～
1 500 bp之间 ,结果如图6 。AFLP反应体系如下:
选扩引物组合为 E-ACT/M-CAG
M.Marker;1～ 3.豫麦 52号
Selective amplified primer combinat ion is
E-ACT/M-CAG;1-3 Yumai 52
图 6 小麦 AFLP指纹图谱
Fig.6 The AFLP fingerprint of wheat
2.6.1 限制性酶切反应体系(20 μL) H2O 12.9
μL ,EcoR I Buffer H 1 μL , BSA(100×)0.1 μL , MseI
Buffer R 1 μL , EcoR I(12 U/μL)0.5 μL , Mse I(10
U/μL)0.5μL ,模板 DNA 4μL。反应条件:混匀离心
数秒 ,37℃3 h ,80℃灭活 10 min ,4℃保存 。
2.6.2 接头连接反应体系(20 μL) H2O 6.5 μL ,
EcoR I接头(5 μmol/L)1μL ,Mse I接头(50μmol/L)
1μL ,10×T4 Ligase Buffer 1μL ,T4 Ligase(3 U/μL)0.5
μL ,酶切产物10μL。反应条件:混匀离心数秒 ,16℃
12 h ,70℃10 min ,4℃保存 。
2.6.3 预扩增反应体系(25 μL) H2O 14.8 μL ,10
×Ex Taq Buffer 2.5 μL , dNTPs(2.5 mmol/L)2 μL ,
MgCl2(25 mmol/L)1.5 μL , EcoR I 预扩引物(5
μmol/L)1 μL , Mse I 预扩引物(5 μmol/L)1 μL , Ex
Taq(5 U/μL)0.2 μL , DNA 连接产物 2 μL。反应条
件:混匀离心数秒 , 94℃2min;94℃30 s ,56℃30 s ,
72℃80 s(30cycles);72℃5 min;4℃。
2.6.4 选择性扩增 预扩增产物用无菌水稀释 20
倍 ,作为选择性扩增的模板。
反应体系(25 μL):H2O 12.8 μL , 10 ×Ex Taq
Buffer 2.5 μL , dNTPs(2.5 mmol/L)2 μL , MgCl2(25
110 华 北 农 学 报 22卷
mmol/L)1.5μL , EcoR I选扩引物(5 μmol/L)2 μL ,
Mse I 选扩引物(5 μmol/L)2 μL ,Ex Taq(5 U/μL)0.2
μL ,模板 DNA 2 μL。
反应条件:混匀离心数秒 , 94℃2 min;94℃30 s ,
65℃30 s ,72℃80 s(touch down0.7℃,12cycles);94℃
30 s ,56℃30 s ,72℃80 s(23cycles);72℃5 min。
2.7 AFLP分析体系在水稻 、玉米基因组遗传分析
上的应用
选用限制性内切酶 Pst I和 MseI对香稻 1号 、郑
单14号基因组DNA进行双酶切 ,利用上文优化后确
立的AFLP体系进行分析 。6%聚丙烯酰胺凝胶电泳
结果表明 ,该体系同样适合于水稻 、玉米的分析工作 ,
可以扩增出清晰可辨且适量的电泳条带(图7)。
1 ,2.选扩引物组合为 P-AAC/M-CTA;
3 , 4.选扩引物组合为 P-AAC/ M-CTT
M.Marker;1 ,3.香稻 1号;2 , 4.郑单 14号
Selective amplified primer combination of lane 1 and 2 is
P-AAC/ M-CTA;that of lane 3 and 4 is P-AAC/M-CTT;1 and 3
represent Xiangdao No.1;2 and 4 represent Zhengdan No.14
图 7 水稻 、玉米 AFLP指纹图谱
Fig.7 The AFLP fingerprint of rice and maize
3 结论
AFLP 分子标记技术由于具有一次检出位点数
多[ 12] ,再现性好的特点[ 13] ,早期经常被用来构建作
物遗传图谱[ 3 ,4] ,后来更广泛应用于禾本科作物进
化[ 14] 、群体遗传学[ 9 ,10]等研究。但这些研究使用的
AFLP 分析体系却不尽相同 ,不利于该技术的推广应
用。本试验在综合前人试验结果的基础上 ,分析
AFLP 的技术特点 ,首先以小麦基因组 DNA为材料
进行了AFLP 体系优化 ,同时将优化后的体系应用
于水稻 、玉米两大类禾本科作物基因组分析 ,均得到
较佳的试验结果 ,扩增出清晰可辨且适量的电泳条
带。由此可见 ,经本研究优化建立的 AFLP 体系对
于禾本科作物基因组分析是稳定有效的 ,同时该技
术体系也为 AFLP 分子标记技术在禾本科作物遗传
分析中的广泛应用奠定了基础 。
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