全 文 ：根癌农杆菌介导 VirE2-N-EGFP在 2 种茄科植物中的表达分析
杜利娟1，薛 杨2，张 旺1，孙现超1* (1．西南大学植物保护学院，重庆 400716;2．中国农业科学院柑桔研究所，重庆 400712)
摘要 为了明确根癌农杆菌介导的外源蛋白在茄科植物叶片细胞中能否瞬时表达，克隆了土壤根癌农杆菌的 VirE2 基因，并融合至绿
色荧光蛋白( EGFP)的 N端，成功构建 pPZP-VirE2-N-EGFP植物表达载体。以茄科的本氏烟为对照，根癌农杆菌介导在辣椒和番茄叶片
细胞中进行了表达分析。用共同聚焦显微镜可以在本氏烟和辣椒叶片细胞中观察到绿色荧光，而在番茄叶片细胞中未观察到。表明外
源蛋白 VirE2-N-EGFP可以在辣椒叶片细胞瞬时表达。该研究结果为进一步研究辣椒中与植物病原互作基因的功能奠定了基础。
关键词 根癌农杆菌; VirE2-N-EGFP;茄科植物;表达
中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611( 2015) 33 －254 －03
Expression Analysis of VirE2-N-EGFP Mediated by Agrobacterium in Two Solanaceae Plants
DU Li-juan1，XUE Yang2，ZHANG Wang1，SUN Xian-chao1* ( 1． College of Plant Protection，Southwest University，Chongqing
400716; 2． Citrus Ｒesearch Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences，Chongqing 400712)
Abstract In order to make it clear that whether heterologous protein could be transiently expressed in Solanaceae plants，we cloned the VirE2
gene from agrobacterium by PCＲ，fused it to the N terminal of EGFP and successfully constructed the plant expression vector pPZP-VirE2-N-
EGFP． VirE2-N-EGFP was expressed in the leaf cells of Capsicum annuum and Lycopersicon esculentum Mill mediated by agrobacterium，with
the Nicotiana benthamiana as control． Green fluorescence was observed in the leaf cells of Nicotiana benthamiana and Capsicum annuum，but
not in that of Lycopersicon esculentum Mill． The results indicated that the heterologous protein VirE2-N-EGFP could be successfully expressed
in the leaf cells of Capsicum annuum，which provide a basis for research on the function of the pathogeny interacted protein in Capsicum
annuum．
Key words Agrobacterium; VirE2-N-EGFPl; Solanaceae plants; Expression
基金项目 国家自然科学基金项目( 30900937 ) ; 中央高校基本科研业
务费专项资金项目( XDJK2016A009，2362015xk04 ) ; 中国烟
草总公司四川省公司科技项目( 201202007) ;中国烟草总公
司湖南省公司科技项目( 14-16ZDAa02) 。
作者简介 杜利娟( 1989 － ) ，女，河南焦作人，硕士研究生，研究方向:
植物病害与病原互作。* 通讯作者，研究员，硕士生导师，
从事植物病毒与病害生物防治研究。
收稿日期 2015-10-26
在研究植物基因功能时，通常采用异源表达植物基因编
码蛋白与荧光蛋白的融合蛋白方法，来分析该基因编码蛋白
的功能或细胞定位。目前研究多是在烟草尤其是本氏烟或
拟南芥中瞬时表达融合蛋白。而在有些情况下植物基因异
源表达不能准确展示其真实功能，影响人对基因功能的正确
理解。
随着功能基因组研究的逐渐深入，许多植物的基因组测
序已经完成，对基因组中潜在功能基因的挖掘和利用是当前
研究的热点。茄科植物很多与人们生活密切相关，对其基因
组编码蛋白功能的准确诠译具有重要意义。VirE2是根癌土
壤杆菌株 C58Ti 质粒中 vir 区的一个毒性蛋白［1］，其核靶向
运输在农杆菌介导的植物遗传转化中起到非常关键的作
用［2］。Dumas等［3］研究表明 3VirE2 在磷脂双分子层内可以
形成一个膜通道，该通道是单链 DNA 的特异性通道，有助于
单链 DNA 有效的跨膜运输，保证外源 DNA 能顺利进入到植
物细胞质中。为了更好地在茄科作物中瞬时表达其自身编
码蛋白，笔者克隆了土壤根癌农杆菌的 VirE2，分析了其在茄
科烟草、辣椒和番茄 3种作物叶片中的瞬时表达情况。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 菌株和质粒。供试大肠杆菌 DH5α由西南大学植物
保护学院保存。根癌土壤杆菌株 C58、植物表达载体 pPZP-
ＲCS1和中间载体 pSAT1-N-EGFP由美国纽约州立大学石溪
分校 Vitaly教授赠送。本氏烟、番茄和辣椒种子由西南大学
植物保护学院保存，在温室育苗盆中播种，培养至 4 ～ 6 叶期
备用。
1． 1． 2 试剂和引物。高保真 Ex TaqTM DNA聚合酶、T4 DNA
连接酶购自大连宝生物工程公司，限制性内切酶购自 NEB
公司。
根据 U． Washington 发表的根癌土壤农杆菌 C58 基因全
序列，自行设计一对引物，由华大基因公司合成，其正向引物
基因序列 VirE2 F:5-GAGAATTCATGGATCCGAAGGCCGA-
3;反向引物 VirE2 Ｒ:5-CAGCCCGGGGTGACGCGGTAT-
CAGGAA-3。
1． 2 方法
1． 2． 1 土壤根癌农杆菌 C58质粒的提取。参照农杆菌 Ti质
粒碱法小量提取方法［4］，提取并纯化 C58 质粒，用 TE 溶解，
－20 ℃保存备用。
1． 2． 2 VirE2 基因克隆。以获得的质粒为模板，VirE2 F 和
VirE2 Ｒ 为引物进行 PCＲ 扩增。反应体系(50 μl):10 ×
PCＲ buffer 5 μl，dNTP(2． 5 mmol)2 μl，MgCl2(2． 5 mmol)4
μl，引物(3 μmol)各 2 μl，模板 1 μl(约 5 ng)，去离子水 34
μl。反应条件:95 ℃ 预变性 4 min;94 ℃ 30 s，58 ℃ 40 s，72
℃ 1 min，35个循环;72 ℃延伸 10 min。
1． 2． 3 VirE2-N-EGFP融合蛋白植物表达载体的构建。根据
刘红玲等［4］构建的融合蛋白植物表达载体构建系统，将克隆
基因用 EcoＲ I 和 Sma I 进行酶切，连接到相应酶切过的
pSAT1-N-EGFP中间载体上，转化大肠杆菌 DH5α 感受态细
胞，在含有 100 mg /L Ampicilin的 LB平板培养，挑取菌落，并
提取重组质粒进行 PCＲ鉴定，选取 3个克隆送华大基因公司
测序验证。在成功构建的重组质粒上，用 Asc I 酶切下表达
责任编辑 李占东 责任校对 李岩安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2015，43(33):254 － 256，265
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2015.33.086
盒，连接到经同样酶切过并去磷酸化的 pPZP-ＲCS1 载体上，
在含有 500 mg /L 壮观霉素的 LB平板培养，PCＲ鉴定筛选阳
性克隆，并再次酶切鉴定。
1． 2． 4 根癌土壤杆菌 EHA105 菌株感受态细胞的制备及质
粒转化。从 －80 ℃冰箱取出保存的 EHA105菌株，划平板过
夜，挑选单菌落接种于无抗生素的 YEP 液体培养基中摇菌
12 ～16 h，CaCl2 法制备感受态细胞。参考 Liu 等
［5］方法将
pPZP-VirE2-N-EGFP以热击法转化到根癌土壤杆菌 EHA105
感受态细胞中。取2份100 μl EHA105感受态细胞分别加入
5 μl pPZP-VirE2-N-EGFP、空载体的质粒 pPZP-ＲCS1(对照)，
冰浴 30 min，然后液氮速冻 5 min，37 ℃水浴锅浸浴 5 min，迅
速冰浴2 min，加入1 ml无抗YEP液体培养基，28 ℃轻摇4 ～
6 h。离心弃 400 μl 上清，其余均匀涂布于含有壮观霉素的
YEP固体培养基上，28 ℃培养至少 2 d，观察菌落生长情况。
菌落 PCＲ扩增鉴定。将扩增出目的基因片段的菌落扩大培
养，与 25%甘油按 1∶ 1置 －80 ℃保存。
1． 2． 5 pzp-EGFP-N-VirE2 在本氏烟、辣椒和番茄的瞬时表
达和检测。参考 Li 等［6］方法，采用根癌土壤杆菌渗入法将
含 pzp-EGFP-N-VirE2的根癌土壤杆菌 EHA105 分别注射到
四叶期本氏烟和茄科作物辣椒、番茄叶片中，置于培养箱中
培养(白天 27 ℃光照 16 h，晚上 22 ℃黑暗 8 h)，3 d后分别
取不同处理注射口附近的叶片部分，制作玻片，用共聚焦荧
光显微镜检测本氏烟和辣椒、番茄叶片中 pzp-EGFP-N-VirE2
是否能瞬时表达。以健康的本氏烟和辣椒、番茄叶片为空白
对照，以注射带有空载体的根癌土壤杆菌的叶片为阴性对
照。每个处理重复 3次。
2 结果与分析
2． 1 根癌土壤农杆菌 Ti 质粒毒性区蛋白 VirE2 基因的克
隆 以 VirE2 F和 VirE2 Ｒ为引物从土壤根癌农杆菌 C58 Ti
质粒中 PCＲ扩增的目的片段，经 1%葡聚糖凝胶电泳检测显
示条带约为 1 700 bp，与预期 VirE2基因 1690大小基本一致
(图 1)。
注:1．阴性对照;2． VirE2;M． DNA Marker。
图 1 VirE2基因 PCＲ扩增
2． 2 VirE2-N-EGFP 融合蛋白植物表达载体的构建 将
VirE2用 PCＲ产物回收试剂盒割胶回收后，用 EcoＲ I和 Sma
I酶切，再次割胶回收，连接到同样酶切过的 pSAT1-N-EGFP
载体中，经 PCＲ 鉴定筛选获得阳性克隆 pSAT1-VirE2-N-
EGF。测序验证表明 VirE2 基因大小 1 668 bp，与目的基因
100%同源，起始位置含有起始密码在 ATG，而末端不含终止
密码子。在 EGFP N 端与 EGFP 融合成一个基因 VirE2-N-
EGFP。在 pSAT1-VirE2-N-EGF 载体中 VirE2-N-EGFP 与上
游含的 2个 35S启动子和末端的 Nos终止子构成一个4 000
bp左右的表达盒。表达盒两端均有一个 Asc I酶切位点。用
Asc I将表达盒切下，连接到植物表达载体 pPZP-ＲCS1上，经
酶切鉴定表明，成功获得 VirE2-N-EGFP 融合蛋白植物表达
载体 pPZP-VirE2 -N-EGFP(图 2)。
注:M． Marker III;1、2． pPZP-VirE2-N-EGFP。
图 2 pPZP-VirE2-N-EGFP质粒酶切鉴定
2． 3 pzp-EGFP-N-VirE2在本氏烟、辣椒和番茄中的瞬时表
达和检测 将 pPZP-VirE2-N-EGFP 转化至根癌土壤杆菌
EHA105，用同样的方法注射本氏烟、辣椒和番茄叶片中，注
射 3 d后用共聚焦荧光显微镜观察，结果显示，pzp-EGFP-N-
VirE2在根癌土壤杆菌的介导下在本氏烟和辣椒叶片中检测
到 GFP，但在番茄叶片中没有。表明用根癌土壤杆菌渗入法
可以使 VirE2-N-EGFP融合蛋白成功在本氏烟、辣椒中表达
(图 2)，而在番茄叶片中未表达。
3 讨论
在本氏烟叶片中瞬时表达外源基因已经是一项非常成
熟的技术［7 －10］，该研究中 VirE2-GFP 在本氏烟中也明显表
达，表明该试验过程是成功的。虽然农杆菌介导的辣椒遗传
转化获得转基因辣椒多有报道［11 －12］，而在辣椒叶片中瞬时
表达外源基因在国内尚未见报道。利用转基因来研究基因
功能固然是有效的基因功能研究手段，但转基因植物获得需
要时间明显多于瞬时表达，因此在功能基因组时代大量鉴定
基因功能仍需要瞬时表达技术。该研究成功在辣椒中表达
外源基因融合蛋白 VirE2-GFP，对利用瞬时表达研究辣椒功
能基因具有一定的参考价值。
农杆菌介导的番茄遗传转化体系已成为成熟的技术体
系［13 －14］。Orzaez等［15］研究表明，从番茄花柱顶端注射农杆
菌渗入整个果实后，在果实中可检测到瞬时表达的目的基
因。牛颜冰等［16］利用马铃薯 X病毒载体在番茄果实中成功
55243 卷 33 期 杜利娟等 根癌农杆菌介导 VirE2-N-EGFP在 2 种茄科植物中的表达分析
注:A ～ C:本氏烟;D ～ F:辣椒;G ～ I:番茄。
图 1 pzp-EGFP-N-VirE2表达情况
表达了达胸腺素 α1。张月丽等［17］利用根癌农杆菌注射方法
成功地在番茄源叶和番茄果实中瞬时表达了转化酶抑制子
(inhibitors of invertases，INH)，并明确 INH 主要在翻译后水
平调控转化酶的活性。该试验未能在番茄叶片中检测到
VirE2-GFP融合蛋白的表达，其原因尚不明确。张大燕等［18］
利用根癌农杆菌介导微小 ＲNA在 miＲn51 时发现桑树的不
同品种对外源基因的瞬时表达效率有一定影响。该试验也
可能存在番茄品种差异导致根癌农杆菌介导外源基因表达
差异的原因。因此，需要用不同的番茄品种来进一步分析
明确。
参考文献
［1］LOYTEＲ A，ＲOSENBLUH J，ZAKAI N，et al． The plant VirE2 interacting
protein 1． A molecular link between the Agrobacterium T-complex and the
host cell chromatin［J］． Plant physiology，2005，138(3):1318 －1321．
［2］GELVIN S B． Finding a way to the nucleus［J］． Current opinion in micro-
biology，2010，13(1):53 －58．
［3］ DUMAS F，DUCKELY M，PELCZAＲ P，et al． An Agrobacterium VirE2
channel for transferred-DNA transport into plant cells［J］． Proceedings of
the national academy of sciences，2001，98(2):485 －490．
［4］刘红玲，李小红，王彦芹，等．根癌土壤农杆菌 Ti 质粒 VirE2 基因的克
隆及原核表达［J］．生物技术，2010，20(3):13 －16．
［5］LIU Z M，LIU Z Z，BAI Q W，et al． Agroinfiltration，a useful technique in
plant molecular biology research［J］． Chinese journal of biotechnology，
2002，18(4):411 －414．
［6］LI Y，GENG Y，SONG H，et al． Expression of a human lactoferrin N-lobe in
Nicotiana benthmiana with potato virus X-based agroinfection［J］． Biotech-
nology letters，2004，26(12):953 －957．
［7］KOPEＲTEKH L，SCHIEMANN J． Agroinfiltration as a tool for transient ex-
pression of cre recombinase in vivo［J］． Transgenic research，2005，14(5):
793 －798．
［8］FISCHEＲ Ｒ，VAQUEＲO-MAＲTIN C，SACK M，et al． Towards molecular
farming in the future:Transient protein expression in plants［J］． Biotech-
nology and applied biochemistry，1999，30(2):113 －116．
［9］VAN DEＲ HOOＲN Ｒ A L，LAUＲENT F，ＲOTH Ｒ，et al． Agroinfiltration is
a versatile tool that facilitates comparative analyses of Avr 9 /Cf-9-induced
and Avr 4 /Cf-4-induced necrosis［J］． Molecular plant-microbe interac-
tions，2000，13(4):439 －446．
［10］PALANICHELVAM K，COLE A B，SHABABI M，et al． Agroinfiltration of
Cauliflower mosaic virus gene VI elicits hypersensitive response in Nicoti-
ana species［J］． Molecular plant-microbe interactions，2000，13(11):1275
－1279．
［11］王朋，王关林，方宏筠．抗虫基因(CpTI)辣椒转化的初步研究［J］．沈
阳农业大学学报，2002，33(1):30 －32．
［12］毕玉平，单蕾，王兴军，等．双抗 TMV + CMV 辣椒转基因工程植株的
再生及抗病毒鉴定［J］．华北农学报，1999，14(3):103 －108．
［13］赵楠，林璟瑜，王淑芳，等．过表达 B 基因的转基因微型番茄的获得
［J］．南开大学学报:自然科学版，2006，39(4):103 －107．
［14］许涛，梅伟利，李天来，等．番茄 AＲF2 启动子的克隆及其转基因植株
鉴定［J］．沈阳农业大学学报，2014，45(2):129 －133．
(下转第 265页)
652 安徽农业科学 2015年
尝试，又推动了城乡旅游经济的发展。
3 镇江市城乡绿道网络构建的路径
镇江目前尚未制订绿道系统规划方案，但随着人们对健
康生活方式的不断追求，越来越多的市民到户外、景区、绿地
内步行健身。每当夜幕降临，滨江风光带、南山风景区、古运
河风光带、金山湖景区人流如织。2011年市民还评选出市区
“十佳”步行路线，既有滨水线路，也有景观线路和历史线路。
可以说，市民自发的锻炼活动需求催生了滨水、邻山绿地步
行绿道的功能，形成了镇江步行绿道的雏形。2013年建成的
南山绿道，更是受到广大市民的一致认可，每天来此锻炼的
人络绎不绝，但这些绿道都是相对独立的，缺乏系统性、连续
性，功能也较为单一，基本集中在沿江一线和南山风景区［4］。
镇江自然生态基底优越，城外群山环绕，城内山林密布、
水网如织，是构建城乡一体的绿道网络系统的良好基础。镇
江市应抓住城镇一体化建设的契机，科学编制绿道网络系统
规划，分层次、分步骤，逐步建立融入城乡的绿道网络系统。
3． 1 充分利用道路网络系统 结合城市道路系统规划，依
托连接城乡的国道、省道，以及市区内“三横九纵”的交通骨
架体系来构建绿道网络。如结合 312 国道、338 省道、234 省
道等国道省道的防护绿地来规划城乡绿道，将镇江市区与周
边的十里长山、圌山、五洲山、横山等风景名胜区、自然保护
区、郊野公园以及大路、高资、三山等乡镇有机串联起来，成
为城乡绿道的主动脉，借助南徐大道、长江路、檀山路、润州
路等城市景观路来建设城区绿道，提高绿道的通达性和便
利性。
3． 2 充分利用江河溪流资源 镇江水资源丰富，北面长江
滚滚而流，古运河穿城而过与京杭大运河、长江交汇。主城
区内水网密布，共有大小河流 37条，总长 107． 8 km。充分利
用纵横交错江河溪流，打造滨水景观空间，构建多种功能的
绿道网络。如通过沿江景观带的打造串联起三山景区，构建
链接东西城区的滨江旅游观光型绿道。结合古运河、团结
河、凤凰河等河道整治，依托滨水带状绿地建设贯穿新、老城
区的滨河游憩型绿道。
3． 3 充分利用山体资源 镇江素有“城市山林”之美誉，城
北沿江山体丛立，宝盖山、云台山、北固山、花山、焦山、象山、
合山、大禹山，山水相依、风格迥异，文化底蕴深厚，构建了三
山国家风景名胜区。城南为宁镇山脉东端，群山延绵，与长
江顺势，自西向东有香山、长山、五洲山、马鞍山、横山和圌
山。城中有 13． 28 km2 的南山风景区，南徐新城区有茶砚山、
龙脉团山、跑马山等，新老城区之间有磨笄山、黄鹤山、老虎
山、宝塔山。主城 26座山体星罗棋布，面积达 14． 75 km2，约
占主城区面积的 18%，是一座典型的山林城市。镇江在构建
绿道网络系统的同时，应充分利用特有的山林资源，绿道建
设与山体整治相结合，退房还山，修复生态，让一条条绿色廊
道串联起一座座山体公园。
3． 4 充分利用古村落、田园风光资源 镇江是拥有 3 000年
文明的历史文化名城，保存了许多传统古村落，如姚桥华山
村、姚桥儒里村、新区葛村、丹徒槐荫村等，不少村落承载了
深厚的历史积淀与文化传说。利用深入村镇的绿道网络，将
这些散落的传统古村落与城市绿道相联系，增加了方便性、
可达性，既有利于人们进入村落感受村落文化，也有利于古
村落的宣传与保护。另外，茶园、果园、农庄是乡村景观的又
一特色，通过绿道连接起乡村家家户户的茶园、果园、农田
等，既丰富了绿道的景观与体验，又带动了乡村的“农家乐”
经济。
4 绿道网络建设机制
4． 1 整体规划，属地建设 城乡绿道网络建设应由市政府
统一制订整体规划、建设标准和技术指引，根据属地将任务
分解到各辖区、乡镇，由辖区、乡镇整合土地资源，提供闲置、
废弃土地、房屋等，由各投资主体依托旧城改造、新城建设、
河道整治、道路改造等工程带动推进绿道建设。
4． 2 多元投入，产投结合 绿道网络系统应构建政府主导、
群众参与、市场运作的良性工作机制，充分调动各方的积极
性和创造性。由政府根据规划制订实施计划和资金安排计
划，充分整合农、林、水、城建资金，将绿道建设与城建项目、
农林建设、水利建设相结合，发挥资金的综合效应，并完善沿
线生态旅游配套设施，从而带动旅游业、餐饮业等服务业发
展，推进沿线地价的升值，从而提升区域经济，使投入和产出
相平衡［5］。
4． 3 以民为本，群管群治 城乡绿道网络建设是一项惠民、
利民的生态工程。随着绿道建设的不断推进，市民的生活环
境得到不断改善，生态休闲场所不断丰富;由绿道而带动的
乡村旅游蓬勃发展，使村民的经济来源不断丰富，人们生活
质量提高，必将调动广大市民的积极性，建立常态化的绿道
管理机制，调动广大市民、村民积极主动参与到绿道维护建
设中来，实现群管群治的良好氛围。
参考文献
［1］蔡瀛，何昉．融入城乡的绿道网选线思路与规划方法［J］．规划师，2011
(9):32 －38．
［2］徐文雄，胡辉伦．低碳经济背景下绿道建设对于旅游发展的影响:以从
化为例［J］．特区经济，2011(4):174 －176．
［3］李朦朦，吴远翔．城乡绿道的功能性研究［J］．绿色科技，2014(9):132 －
134．
［4］邓毛颖．增城市绿道规划与建设机制研究［J］．规划师，2011(1):111 －
115．
［5］焦建春．绿道旅游功能开发与运营管理初探［J］．现代城市研究，2012
(3):
檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪
19 －23．
(上接第 256页)
［15］OＲZAEZ D，MIＲABEL S，WIELAND W H，et al． Agroinjection of tomato
fruits． A tool for rapid functional analysis of transgenes directly in fruit
［J］． Plant physiology，2006，140(1):3 －11．
［16］牛颜冰，史正文，王德富，等．重组马铃薯 X 病毒注射番茄果实高效表
达胸腺素 α1［J］．生物工程学报，2009，25(4):537 －541．
［17］张月丽，杨艳丽，姜晶．农杆菌介导的 INH 基因瞬时表达系统的建立
及表达分析［J］．分子植物育种，2012(11):217 －224．
［18］张大燕，贾凌，向仲怀，等．农杆菌介导的桑树瞬时表达体系构建及
miＲn51 与其靶基因的表达分析［J］．蚕业科学，2015，4(1):10 －17．
56243 卷 33 期 胡 艳 融入城乡的绿道网络构建