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8个禾本科草坪草品种遗传多样性的RAPD分析



全 文 : 收稿日期:2005-07-21
基金项目:广东省自然科学基金(04300850)和湛江师范学院重点科研项目(L0112)资助
作者简介:陈燕(1962-),女,广东高州人,副教授,硕士,从事植物学教学与科研。

8个禾本科草坪草品种遗传多样性的 RAPD分析
陈 燕,胡木林,袁长春,关光辉,罗 妹,黄永莲
(湛江师范学院 生化学院,广东 湛江 524048)

摘 要:利用 RAPD技术,对禾本科 4属 4种 8个品种的草坪草进行遗传多样性分析。15个有效引物用于 PCR
扩增,共获得 RAPD 谱带 144 条带,多态性带占 63.2%。8 个草坪草品种间的遗传距离在 0.0857~0.2928 之
间,脱壳狗牙根与普通狗牙根间的遗传距离最小,交战 2号与爱神特之间的遗传距离最大。用 UPGMA和邻
接法进行聚类分析,得到 2 个拓扑结构基本一致的树系图。同一种不同品种间的亲缘关系最近;不同属种间
的遗传距离加大,同族不同属的草坪草基本构成一支;4 个暖季型草坪草品种构成一个单系类群,但属于冷
季型草种的黑麦草(爱神特)单独构成一支,并未与同族的其它 3个冷季型草坪草品种(高羊茅)聚在一起。本
研究不支持将黑麦草属与羊茅属放在同一族内的分类处理,并建议将高羊茅划分为过渡类型的草坪草。
关键词:禾本科;草坪草;遗传多样性;RAPD分析
中图分类号:Q943; Q949.71+4.2 文献标识码:A 文章编号:1009-7791(2006)01-0005-04
Genetic Diversity Analysis on Eight Turfgrass of Poaceae by RAPD
CHEN Yan, HU Mu-lin, YUAN Chang-chun, GUAN Guang-hui, LUO Mei, HUANG Yong-lian
(College of Life Science and Chemistry, Zhanjiang Normal University, Zhanjiang 524048, Guangdong China)

Abstract: The genetic diversity of eight turfgrass varieties representing four species in four genera
of family Poaceae was analyzed using random amplified polymorphic DNA (RAPD) method.
Fifteen 10-meroligonucletide primers were used for DNA ampification, and 144 DNA bands were
generated, of which 63.2% is polymorphic loci. The genetic distances are 0.0857~0.2928 among
eight turfgrass varieties, the maximum value is between the variety Crossfire of Ⅱ Festuca
arundinacea and Accent of Lolium perenne, the minimum value is between the two varieties of
Unhulled Cynodon dactylon and hulled Cynodon dactylon. The two dendrograms based on genetic
distance by UPGMA and Neighbor-joining method are similar topologically. The relationships
among different varieties from the same species are very close. The relationships of inter-genera or
interspecies are relatively far, although the different genera of the tribe Chlorideae get together into a
clade. The four warm-season turfgrass form a clade. The variety Accent of Lolium perenne, a
cool-season turfgrass, has a far relationship to other turfgrass and forms a clade. The study didn’t
support to put the genus Lolium and Festuca into the same tribe Poeae and suggested that the
turfgrass Festuca arundinacea be treated as an intergrade type of turfgrass.
Key words: Poaceae; turfgrass; genetic diversity; RAPD analysis

随机扩增多态性DNA(RAPD)分析是继形态性状和染色体配对资料之后,研究近缘属间、种间(内)、
亚种间和不同染色体组间关系及其进化分析研究的新方法[1,2]。目前,该技术已广泛应用于作物、果树、
花卉及牧草等领域,对狗牙根[3]、野牛草[4]和多年生黑麦草[5]等草坪植物的分子生物学研究也获得了成
功。然而,国内迄今尚未见到有关草坪草种间和属间遗传多样性RAPD分析的研究报道。本文通过对禾

2006,35(1):5-8.
Subtropical Plant Science
第 35卷 ﹒6﹒
本科羊茅属(Festuca)、黑麦草属(Lolium)、狗牙根属(Cynodon)和结缕草属(Zoysia)共4属8个品种的草坪
草进行RAPD分析,旨在探讨其不同属间、种间及品种间的遗传多样性和彼此之间的亲缘关系,为草坪
草育种、品种筛选及亲缘关系的研究提供依据;同时也为草坪草品种指纹图谱的建立奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
8 种供试材料种子购自北京汉枫公
司,品种名称、草种类型及其分类种名见
表 1。种子经 0.5%高锰酸钾消毒后,采用
砂培法培养幼苗。待长成完整植株后,采
集新鲜幼嫩叶片,洗净,经硅胶干燥备用。
每种材料均采集相应的凭证标本,收藏于
湛江师范学院生物系标本室。
1.2 试验方法
1.2.1 总 DNA提取 取硅胶干燥后的叶片约 0.5g,用液氮研磨成粉末,装入 1.5ml离心管,加入 400μl
5mol/L异硫氰酸胍,混匀,室温放置10min;加入625μl 4mol/L NaClO4(pH5.2)、5μl RNaseA(10mg/ml),
充分混匀,室温放置 20min;8 000r/min离心 3min,将上清液移入新的离心管中,加入 12.5μl Resin,
用时充分混匀,12 000r/min离心 5min;弃上清,加入 200μl 4mol/L NaClO4(pH5.2),混匀,12 000r/min
离心 5min;弃上清,加入 350μl洗脱液(用前加入无水酒精),充分混匀,12 000r/min离心 5min;重
复冼脱一次;12 000r/min离心 5min,弃上清,室温晾干;加入 60μl TE buffer,混匀,45℃水浴 10min,
12 000r/min离心 1min,弃上清,-20℃保存备用。
1.2.2 引物筛选及 RAPD扩增反应 试验所用随机引物购自 Operon公司。从 100个 10bp的随机引物中
筛选出多态性好、谱带清晰、反应稳定的 15个引物(表 2)用于 RAPD分析。
表 2 15个随机引物的序列及其扩增结果
引物 序列 5~3 总扩增带/多态带 引物 序列 5~3 总扩增带/多态带
OPA02 TGCCGAGCTG 10/5 OPC13 AAGCCTCGTC 10 /4
OPA05 AGGGGTCTTG 10/7 OPD10 GGTCTACACC 9/4
OPA12 TCGGCGATAG 13/11 OPD20 ACCCGGTCAC 10 /9
OPA17 GACCGCTTGT 8 /5 OPE01 CCCAAGGTCC 6 /6
OPB07 GGTGACGCAG 12/8 OPE07 AGATGCAGCC 10 /6
OPB11 GTAGACCCGT 11 /11 OPE08 TCACCACGGT 10 /7
OPB12 CCTTGACGCA 8 /3 OPE15 ACGCACAACC 11/3
OPC05 GATGACCGCC 6/2
扩增反应体系总体积为 25μl,其中含有:10× PCR buffer 2.5μl,10mmol/L dNTPs 0.5μl,8pmol/μl
随机引物 1μl,20ng/μl模板 DNA 1μl,2U/μl Taq DNA 聚合酶 0.5μl,ddH2O补足 25μl。空白对
照用三蒸水代替模板 DNA。扩增反应在 GeneAmp PCR system 9700基因扩增仪上按下列程序进行:
94℃ 3min;94℃ 1min,36℃ 1min,72℃ 2min,40个循环;72℃ 7min。PCR扩增产物经ρ= 1.7%
琼脂糖凝胶电泳后,用 EB(溴化乙锭)染色,置于凝胶成像系统(UVP GDS-8000pc)进行观察和拍照。
1.2.3 数据分析 记录并统计每一样品扩增产生的 RAPD带,有带(含弱带)记为 1,无带记为 0,根
据公式 S = 2Nx,y/(Nx+Ny)(其中 S 代表两个品种间的相似系数,Nx,y代表两个品种共有的谱带数,Nx
与 Ny分别代表每个品种总的谱带数)计算不同样品间的相似性系数,样品间的遗传距离 D = 1-S。用
PHYLIP3.6a2软件,分别采用邻接法(Neighbor-joining)和 UPGMA 方法进行聚类分析,构建系统树。
表 1 供试材料名称及草种类型
编号 品 种 名 种 名 草种类型
1 交战 2号(Cf)
2 猎狗 5号(Ho)
3 三 A (Tr)
高羊茅 Festuca arundinacea 冷季型
4 爱神特(Ac) 黑麦草 Lolium perenne 冷季型
5 普通(Un)
6 脱壳普通(Hu)
7 太阳城(Su)
狗牙根 Cynodon dactylon 暖季型
8 Z2139(Z2) 中华结缕草 Zoysia sinica 暖季型
第 1期 陈燕,等:8个禾本科草坪草品种遗传多样性的 RAPD分析 ﹒7﹒
2 结果与分析
2.1 扩增结果
8种材料的总 DNA经 PCR扩增后,所产生的
RAPD带大小在 300~1 500bp之间(图 1)。15个
随机引物共扩增出 144条带,其中多态性的带 91
条,多态率为 63.19%。15个引物平均扩增的带数
为 9.6条,最多的在引物 OPA12,为 13条带。
2.2 遗传距离
根据 RAPD 带的统计结果,计算各草种间的
遗传距离。结果(表 3)表明,8个草坪草品种间
的相似性较高,遗传距离在 0.0857~0.2928之间,
其中交战 2 号(高羊茅)与爱神特(多年生黑麦
草)间的遗传距离最大,为
0.2928;其次是交战 2号(高羊
茅)与脱壳普通狗牙根,距离
为 0.2849;脱壳普通狗牙根与
普通狗牙根间的遗传距离最
小,仅为 0.0857,说明两者间
的亲缘关系很近。
2.3 聚类分析结果
用 UPGMA 和邻接法 Neighbor-
joining 进行聚类分析,得到 2 个拓扑
结构基本一致的树系图。图 2 所示为
UPGMA 法所得到的树系图。从图中
可以看出,8 个样品被聚为 2 大支,
其中爱神特单独成为一支。爱神特是
综合性状十分优异的多年生黑麦草品
种,耐热性和抗冻性较强[6],较适宜
在寒冷地区种植。剩余的 7 个草种聚
为另一大支,并进一步分成两个并系
的支,其中一支由交战 2 号、猎狗 5
号和三 A 3个品种构成,交战 2号和
猎狗 5号呈姊妹群关系,并与三 A品
种构成一个单系类群,表现出三者间
具有较近的亲缘关系,三者均为羊茅
属高羊茅的优良坪用品种,对我国北方以及过渡带气候区表现出很好的适应力[7-8];另一支由普通狗牙
根、脱壳普通狗牙根、太阳城狗牙根和中华结缕草四个草种构成,在这一支中,普通狗牙根和脱壳普
通狗牙根为姊妹类群,并与太阳城狗牙根一起组成一个单系类群,表明三者之间亲缘关系很近;中华
结缕草单独成为一个小支,并与前三者所组成的小支构成并系关系。
普通狗牙根是世界广布种[9],在日均温低于 16℃时停止生长,7~10℃开始枯黄;太阳城狗牙根为
改良型种子直播的狗牙根新品种,其抗寒性比普通狗牙根有所提高,气温 1~5℃时生长受阻[10]。中华
结缕草在暖季型草坪草中的抗寒性最优[11],Z2139 是中华结缕草的优良草坪草品种,其叶片的抗寒性
表 3 8个草坪草品种间的遗传距离
1 2 3 4 5 6 7 8
1 0.0000
2 0.1348 0.0000
3 0.2184 0.1379 0.0000
4 0.2928 0.2376 0.1864 0.0000
5 0.2849 0.2179 0.2229 0.2308 0.0000
6 0.2529 0.2184 0.2353 0.2316 0.0857 0.0000
7 0.2678 0.2022 0.2067 0.2366 0.1087 0.1397 0.0000
8 0.2615 0.2205 0.1832 0.2323 0.2143 0.2356 0.1800 0.0000
bp
-3000

-1500
-1100
-800
-600
-500

-300
1 2 3 4 5 6 7 8 B M
图 1 引物 OPA17扩增产物的电泳图谱
注:M: DNA Ladder分子量标记; B: 空白对照;
数字 1~8所代表的材料名称见表 1。
图 2 基于遗传距离的 8个草坪草品种聚类分析图(UPGMA法)
注:Hu:脱壳普通狗牙根;Un:普通狗牙根;Su:太阳城狗牙根据需要和可能;
Z2:中华结缕草;Cf:交战 2号;Ho:猎狗 5号;Tr:三 A;Ac:爱神特
第 35卷 ﹒8﹒
半致死温度为-7.9℃,抗寒性强于天鹅绒 ( Zoysia tenuifolia) 和马尼拉 ( Zoysia. matrella) [12]。
3 讨 论
在 Watson[13-17]的分类系统中,上述 8 个草坪草品种分别属于 2 个族、4 个属和 4 个种,其中狗牙
根属和结缕草属属于虎尾草族(Chlorideae),羊茅属和黑麦草属属于早熟禾族(Poeae)。聚类结果(图
2)显示,8个草坪草品种之间的亲缘关系表现为同种不同品种之间的亲缘关系最近,同属于高羊茅的
交战 2号、猎狗 5号和三 A 3个品种构成一个单系类群,同属于狗牙根的普通狗牙根、脱壳普通狗牙
根和太阳城狗牙根 3 个品种也构成一个单系类群;同族不同属的草坪草之间亲缘关系也较近,同属于
虎尾草族的狗牙根(狗牙根属)和中华结缕草(结缕草属)聚为一支;不同族的草坪草之间的亲缘关
系相对较远。RAPD分析的结果与禾本科传统分类的结果基本一致。
草坪草主要依据气候与草种适应性和生理生化学(C3、C4植物)等进行分类,通常分为暖季型和
冷季型两大类[15-16]。本试验中的狗牙根(3个品种)和中华结缕草(1个品种)为暖季型草、C4植物;
高羊茅(3个品种)和多年生黑麦草(1个品种)为冷季型草、C3植物[13,17,18]。从图 2可见,暖季型草
狗牙根和中华结缕草之间的遗传距离较小,亲缘关系较近,而与冷季型草高羊茅和多年生黑麦草之间
的遗传距离相对较远;但多年生黑麦草并不与高羊茅的 3 个品种聚在一起,而是单独成为一大支,这
一结果表明:①草坪草的亲缘关系与草种的地理分布和光合作用的生化途径有关,根据草种的气候生
态带和光合机制对禾本科草坪草进行分类具有一定的合理性;②高羊茅与暖季型草之间的亲缘关系较
之多年生黑麦草与暖季型草之间的亲缘关系更近。聚类结果不支持将羊茅属与黑麦草属放在同一族内
的分类处理方法。诸多栽培试验表明,高羊茅的生态适应性较强,既能在寒冷潮湿的气候条件下生存,
也能在温暖潮湿的过渡地带生长[7],表现出较强的耐寒、耐旱和耐热能力,可以作为长江中下游地区
和部分炎热地区的草坪草使用[18,19];而多年生黑麦草的生态适应性较差,能够适合寒冷潮湿的气候条
件,不耐炎热和干旱气候[19-22]。参照韩烈保等将草坪草划分为冷季型、暖季型和过渡型三种类型的划
分标准[7],结合本研究的聚类结果,作者认为,将高羊茅划分为过渡型草坪草比划分为冷季型草坪草
可能更为合理。
RAPD分析显示,8个草坪草间的遗传距离在 0.0857~0.2928之间,其中狗牙根 3个品种间的遗传
距离为 0.0857~0.1397,这与袁长春等 [23]用湖南四种尾矿环境下居群狗牙根分析所得遗传距离
(0.2459~0.4935)相比明显较小。导致遗传多样性偏低的原因可能有:一是本供试样品均为人工选择
的栽培草种,人工选择的作用通常高于野生状态下的自然选择[24],因为选育的目标(主要是观赏性和
抗逆性)相近,栽培方式也趋同;二是所选品种为暖季型草中的耐寒品种和冷季型草中的耐热品种,
品种间的生态适应变幅减小,遗传相似性因而相应提高。
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(下转第19页)
第 1期 欧阳桐娇,等:不同肥料对土壤养分三要素平衡与累积的影响 ﹒19﹒
钾最易流失,不易在土壤中累积,而猪粪、稻草中钾素也易流失。所以每季种植水稻都要注意钾肥的
补充(表 3)。
表 3 施化肥、稻草、猪粪后土壤钾素收支平衡与累积情况
肥 料 数据计算方式 投钾量 (kg/hm2·年)
水稻带走钾量
(kg/hm2·年)
钾素盈亏
(kg/hm2·年)
10年后土壤全钾增减
(%)
化肥(NPK) NPK-CK 187.5 24.0 163.5 -0.065
稻草(S) NPKS-NPK 183.0 93.0 90.0 -0.048
猪粪(M) NPKM-NPK 358.5 121.5 237.0 -0.082
3 小 结
随不同形态氮、磷、钾肥料投入,土壤氮、磷、钾素的收支均表现为盈余,其中以施猪粪氮土壤
氮素盈余最多,施化肥氮次之,施稻草氮最少;施猪粪磷土壤磷素盈余最多,施化肥次之,施稻草最
少;施化肥钾土壤钾素盈余最多,施猪粪钾次之,施稻草钾最少。随不同形态氮磷钾肥料投入,土壤
全氮、全磷含量均有提高,而全钾含量反而下降,其中以稻草氮最有利于土壤氮素累积,化肥氮次之,
猪粪氮再次;化肥磷最有利于土壤磷素累积,猪粪磷次之,稻草磷再次;猪粪钾最有利于补充缓解土
壤钾素损失,稻草钾次之,化肥钾再次。
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