全 文 ：收稿日期：2008－10－14
基金项目：2006年度江西林业重大科技专项“ 主要阔叶树工业原料林良种选育及定向培育技术研究”部分内容。
作者简介：叶金山，男，林业工程师，主要从事种质资源研究。
★通讯作者
江西林业科技 2008 年第 6 期
壳斗科 5属植物基因组 DNA提取方法研究
叶金山, 温 强, 江香梅, 周 诚★
（ 江西省林业科学院，江西南昌330032）
摘 要：植物体内所含的蛋白质、酚类、单宁、色素及多糖等物质影响 Tag酶的聚合效率，是使 PCR 扩增反应失
败的主要因素。本研究以壳斗科植物为材料，对 CTAB法、SDS法提取的 DNA 进行了比较研究，结果表明：CTAB法
适合于壳斗科植物基因组 DNA的提取，采用这种方法提取的 DNA能很好的用于 PCR扩增。
关键词：壳斗科；植物；DNA提取；PCR扩增
分类号：S792.16－18:Q343.1 文献标识码：A 文章编号：1006－2505(2008)06－0010－03
江西地处北亚热带、中亚热带至南亚热带，壳斗科资源
丰富，有 6 属约 55 种之多 ，其蓄积量几乎占阔叶林的 1/3，
为江西省优良乡土阔叶树种 [1]。 其中，该科内树种大部分为
材质优良，纹理优美，可作上等建筑、家具、各种装饰、装璜、
雕刻、高档工艺制作等高级用材树种。 为满足各种生产、生
活需求， 开展以该科树种的工业原料林良种选育及定向培
育技术研究已经迫在眉睫。 然而该树种同属内甚至不同属
内大部分种间形态、解剖特征上较为类似，不易区分识别 [2]，
此外由于植物的许多表型性状是由基因型和环境条件共同
作用形成的，其形态特征很大程度上受环境条件的影响，这
使得利用以 DNA 为基础的分子标记来鉴定种和品种变得
更为重要 [3]。
随着以PCR 为试验手段的分子标记技术的应用逐渐扩
展到更多的植物种，许多研究者发现，植物体内的许多次生
代谢物质 (如单宁、酚类及色素等 )与核酸形成复合物 ，DNA
埋在这种粘稠的胶状物中难以溶解或产生不同程度的褐
变。 这种质量的 DNA 既不适于做限制性酶切 , 也不能用于
DNA 扩增 [4]。 本研究以壳斗科多个属的植物为材料 ,先后采
取了改良的 CTAB 法及 SDS 法 ， 从壳斗科植物中提取总
DNA， 并对 2 种方法对壳斗科植物 DNA 的提取效果进行比
较分析， 希望得到能很好的用于 PCR 扩增的较纯、 较完整
DNA 的提取方法。
1 材料与方法
1.1 实验材料
试验材料选自江西省林科院培育的壳斗科种质资源库
内的健康植株，各树种及编号见表 1。
表1 试验用树种名及编号
1.2 主要试剂
主要试剂来源 ：λDNA/HindⅢ及 100bp 标准分子量
Marker，TaqDNA 聚合酶，primer 等主要试剂均购自上海生物
工程公司。
1.2.1 CTAB 法 。 提取液 1.4mol/L NaCl；20mmol/L EDTA，pH
8.0；100mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，2%CTAB，5%可溶性 PVP，
2%β-巯基乙醇。TE 缓冲液 10mmol/L Tris-HCl，pH8.0；1mmol/
L EDTA。
1.2.2 SDS 法 。 提取液 2%SDS；100mmol/L Tris-Cl；50mmol/L
EDTA；500mmol/L NaCl；5% PVP -40；5mol/L KAc；10mmol/L
β-巯基乙醇。 TE 缓冲液同上。
1.3 DNA 提取方法
将采集的各树种的新鲜幼叶洗净， 用三蒸水冲洗 2～3
次，晾干后作好标记待用。 采用的 CTAB 法及 SDS 法均做了
适当改进。
1.3.1 CTAB 法。称取 0.5～1g 植物新鲜幼叶于液氮中研磨成粉
编号 树 种
1
2
3
4
5
6
7
8
9
栎属麻栎 Quercus acutissima
栲属米槠 Castanopsis carlesii
栲属罗浮栲 C.fabri
栲属甜槠 C.eyrei
栲属鹿角栲 C.lamontii
青冈属青冈 Cyelobalanopsis glauca
青冈属碟斗青冈 Cy.disciformis
石栎属硬斗柯 Lithocarpus hancei
水青冈属云山 Cyclobalanopsis numbium
10· ·
DOI:10.16259/j.cnki.36-1342/s.2008.06.018
末，放入加有 4mL CTAB 抽提液（ 65℃预热）的 10mL 离心管
中 ， 充分混匀 ， 封口膜封口后于 65℃水浴中保温 30min～
60min，其间不时轻轻摇动；将样品置于冰上迅速冷却至室温
后，立即加入 4mL 氯仿-异戊醇（ 24∶1 ，V/V）混合液，轻轻混匀
后 12 000r/min 离心 10min； 取上清液 500 μL 于 1.5mL 离心
管中，加入 1/10 体积 4mol/L 浓度的 NaCl 溶液，2 倍体积冰预
冷的无水乙醇后于-20℃沉淀 2h 以上或过液 （ 期间可再补加
Na+，以增加盐的浓度） ；视 DNA 量，用 8 000r/min 离心 3min
或用枪头挑出 DNA 沉淀，并用 1mL 70%(V/V)乙醇漂洗两次，
500μL 无水乙醇漂洗后风干；加入 500μL 于 56℃水浴预热的
0.1×TE 缓冲液充分混匀后，12 000r/min 离心 5min，上清液加
入 2 倍体积冰预冷的无水乙醇，沉淀物经同样方法漂洗后风
干， 经灭菌去离子水溶解， 离心后上清即为所需的 DNA 溶
液，4℃保存。
1.3.2 SDS 法。 取 0.5～1g 植物叶片放入液氮中研磨成粉末，放
入 10mL 的离心管中，加入 3mL 的 SDS 提取液及 60μL 2-ME
（ 65℃预热） ，充分混匀，封口膜封口于 65℃水浴保温 30min，其
间不时摇动；加入 1mL 的 5mol/L KAc，水浴锅中混匀后迅速
放置在冰上 5min；加入 4mL 氯仿：异戊醇（ V/V∶24∶1） ，充分混
匀后 1 000r/min离心 10min， 上清液加等体积-20℃异丙醇, -
20℃冰箱静置，4℃5 000g 离心 10min；所得沉淀用 70%的乙醇
洗涤 2 次，干燥；将沉淀溶于 200μL TE液中，4℃冰箱保存。
1.4 DNA纯度的检测
1.4.1 紫外吸收检测。通过 754 紫外分光光度仪分别测定 2 种
提取方法所得到的 DNA 样品 A260 和 A280 并计算 OD 比值
(A260/A280)。
1.4.2 限制性内切酶酶切检测 。 将 DNA 调节浓度至 300～
400ng/μL， 采用 ECORI 单酶切 ，15μL 酶切体系里还有
DNA3~5μg，内切酶 12U，37℃水浴过夜。 1%琼脂糖凝胶电泳
检测酶切产物。
1.4.3 PCR 扩增。 以 0.8 %琼脂糖凝胶电泳结果为参考， 将 2
种方法提取的 DNA 样品，将浓度稀释至 30ng/μL，选用随机
引物 S36 进行 RAPD 反应。 反应体系：10×Buffer2μL；10mM
MgCl2 1.6μL；2mM dNTP 2μL；5μ/μL 酶 0.2μL；10pmol/μL
Primer 1μL； 无菌水补充至 20μL。 反应程序 ：94℃预变性
3min， 然后进入下列循环：94℃变性 30sec，38℃退火 30sec，
72℃延伸 1min30sec， 共 38 个循环， 最后 72℃再延伸 7min。
1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。
2 结果与分析
2.1 两种方法提取 DNA的对照
提取过程中，乙醇沉淀 DNA 上清，改进的 CTAB 法对 9
个试验样品有明显的絮状沉淀；而 SDS 法只有 1、3、6 号有絮
状沉淀，其他各号均成混浊粉状，须离心才能得到沉淀。 紫外
分光光度计检测结果显示， 采用 CTAB 法提取的 DNA OD
比值为 1.42～1.8， 原液浓度在 225～925ng/μL； 而 SDS 法检测
结果为 1.25～1.54， 原液浓度在 275～1 650ng/μL 电泳检测，结
果见图 1。
图 1 两种提取方法的 DNA电泳检测
（图中 M为 Marker，Marker左侧为 CTAB法提取的 DNA，
右侧采用 SDS法，下同）
实验表明 :采用改进 CTAB 法能有效去除多糖、多酚，用
该方法提取的基因组 DNA 纯度较 SDS 法高的多， 所提取的
DNA 在水平式 0.8 %琼脂糖凝胶电泳检测时，更为明显，且重
复性好。
2.2 酶切结果比较
酶切结果显示采用两种方法提取的 DNA 均能被限制性
内切酶很好的酶切， 而采用 SDS 方法提取的 DNA 在稀释同
样浓度过程中 2、7、8、9 号 DNA 的相对含量较少，故酶切显示
结果很不明显，结果见图 2。
图 2 两种提取方法的 DNA酶切结果检测
2.3 PCR检测对比
采用 RAPD-PCR 检测两种 DNA 提取方法的效果 。 在
PCR 过程中，DNA 纯度是影响 PCR 扩增的关键因素，其作用
远远大于浓度对反应的影响。 在被稀释成相同浓度后，PCR
检测电泳图中显示 SDS 法提取的 4、6、8、9 号扩增很不稳定，
带型背景深且扩增效率低， 可见用此法提取的 DNA 纯度不
高，而相对比采用 CTAB 法提取的 DNA 扩增效果好，重复性
高，结果见图 3。
图 3 两种提取方法的 PCR结果检测
1 2 3 4 5 6 7 8 9 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9
1 2 3 4 5 6 7 8 9 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9
1 2 3 4 5 6 7 8 9 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9
11· ·
3 讨论
实验证明， 这种改良的 CTAB 抽提法适用于壳斗科植物
叶片 DNA 抽提, 提取的 DNA 量大，质量也较好，能满足 PCR
扩增和其它分子生物学分析的要求。 为了提高 DNA 的纯度
和得率 , 建议选用较幼嫩的叶片 , 因为处于延伸生长期的植
物细胞果胶含量较少。 在抽提过程中, 发现不同种其抽提效
果及 DNA 得率也有较大的差异 。 同是采用 CTAB 法提取
DNA，硬斗柯 DNA 得率最高可达 900～1 500ng/μL, 而云山
的得率却只有 200～300ng/μL, 这可能是由于不同种其叶片中
酚类和脂类等杂质含量差别较大 , 从而影响到 DNA 抽提过
程中 DNA 的得率。
实验中我们在预热的抽提液中加入 2%β-巯基乙醇，有
效的抑制了酚化物褐化， 此外在提取液中加入 5%可溶性
PVP， 防酚褐化效果明显比在研磨同时加入固体 PVP 更好；
通过延长离心时间，可将蛋白质、多糖、脂类等生物大分子降
低到最低程度；增加氯仿/异戊醇的抽提次数，可使蛋白质杂
质量降到最低；RNA 可通过对提取的 DNA 原液采用温浴处
理加以去除，少量的 RNA 不影响 PCR；此外，尽量简化操作
步骤, 缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏。
参考文献：
[1] 端木 . 江西省壳斗科资源的综合利用[J]. 林产化工通讯,1995(1):
34-36.
[2] 吉成均,沈海花,方精云.基于 RAPD标记的我国水青冈属植物的分
类研究[J].北京大学学报,2002,38(6):817-822.
[3] Koller B, Leharmann A, Mc Dermott J M. Identification of Apple
Cultivars Using RAPD Markers[J]. Theor Appl Genet, 1993 , 85(7):
901-904.
[4] 邹喻苹,汪小全,雷一丁,等.几种濒危植物及其近缘类群总 DNA的
提取与鉴定[J].植物学报,1994,36(7):528-533.
Study on Extraction Method of Genome DNA
in 5 Genus of Cupuliferae
YE Jinshan, WEN Qiang, JIANG Xiangmei, ZHOU Cheng★
( Jiangxi Academy of Forestry, Nanchang Jiangxi 330032, China)
Abstract: High content of phenolic terpenoids, tannin, pigments, polysaccharide, etc. usually affect the activity of Tag and
lead to PCR reaction failed. Plant material of Cupuliferae were used for compared of genome DNA isolation procedure.
CTAB and SDS methods were used for genome DNA isolation. The results showed that CTAB procedure was suitable for
Cupuliferae genome DNA extraction and the DNA can be used for PCR.
Key words: Cupuliferae plant; DNA extraction; PCR reaction
★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★
《 江西林业科技》是江西省林学会和江西省林业科学院合
办的综合性林业科技期刊，主要报道林木良种、育苗造林、森
林经营、森林保护、林产资源开发利用、森林生态、林业经济、
森林花卉、森林蔬菜、乡村林业和城市林业等方面的新技术、
新成果、新经验和新动向。 设有研究报告、经验介绍、专题综
述、基础知识、问题讨论、方法和技术、特色林业、科技咨询、
调查访问、国外科技、林业信息等栏目。 本刊面向基层、面向
生产，信息量大，实用性强，适合广大林业科技人员、管理干
部、专业院校师生、林场职工和林农阅读参考。
本刊为双月刊，逢双月下旬出版，公开发行，国际连续出
版物号 ISSN 1006-2505,国内刊号 CN 36-1109/S。大 16 开 48
页，单价 5 元/册，邮寄费 1.5 元/册，全年 39 元。凡需订阅的单
位和个人，请与编辑部联系（ 写信、发 E-mail 或传真均可） ，订
书款由邮局汇寄即可。
地址：江西省南昌市经济技术开发区枫林西大街 1629 号
《 江西林业科技》编辑部 邮政编码：330032
电话：0791-3833691 传真：0791-3833284
E-mail：jxlky@nc.jx.cn; jxlky@163.com;
jxli@chinajournal.net.cn;
网址：http://JXLI.chinajournal.net.cn;
http://jxlykj.periodicals.net.cn
·征订启事·
欢迎订阅 2009年《江西林业科技》
12· ·