全 文 ：　
第４４卷　第１２期　
２０１４年１２月
中 国 海 洋 大 学 学 报
ＰＥＲＩＯＤＩＣＡＬ　ＯＦ　ＯＣＥＡＮ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ　ＯＦ　ＣＨＩＮＡ
４４（１２）：０５４～０６０
Ｄｅｃ．，２０１４
研究简报
红翎菜科４种海藻ＩＴＳ和ｒｂｃＬ序列的分子系统学研究
孙　琰１，刘　翠１，池　姗１，唐贤明２，陈傅晓２，刘　涛１
（１．中国海洋大学海洋生命学院，山东 青岛２６６００３；２．海南省水产研究所，海南 海口５７０２０４）
摘　要：　通过ＰＣＲ扩增基因片段的方法测定了红翎菜科琼枝属（Ｂｅｔａｐｈｙｃｕｓ）、卡帕藻属（Ｋａｐｐａｐｈｙｃｕｓ）和麒麟菜属
（Ｅｕｃｈｅｕｍａ）４种海藻共１９株个体的核糖体基因转录间隔区（ＩＴＳ）（含５．８ＳｒＤＮＡ）和核酮糖－１，５－二磷酸羧化酶／加氧酶基
因大亚基（ｒｂｃＬ）全长基因序列。其中ｒｂｃＬ全长序列为首次测定，为从蛋白质水平探讨红翎菜科分子系统进化提供了可靠
的保证。琼枝属、卡帕藻属、麒麟菜属ＩＴＳ序列长度分别为１　０２４、６２９～６６９、１　００１ｂｐ，ＧＣ含量在４５．６％～５２％之间；ｒｂｃＬ
序列长度均为１　４６７ｂｐ，ＧＣ含量在３７．１％～３７．６％之间。结合ＧｅｎＢａｎｋ中现有的红翎菜科海藻ＩＴＳ和ｒｂｃＬ序列进行系
统进化分析，２个片段聚类结果均明显的将所有样品分为琼枝属、卡帕藻属和麒麟菜属３大分支，表现出明显的属间差异。
本研究的１１株长心卡帕藻根据ＩＴＳ序列差异分成明显２种类型，推测这２种类型长心卡帕藻的ＩＴＳ序列差异与其地理环
境、无性繁殖时间（代数）和藻体颜色无关。
关键词：　麒麟菜属；卡帕藻属；琼枝属；ＩＴＳ；ｒｂｃＬ；系统发育
中图法分类号：　Ｑ７８５　　　　　文献标志码：　Ａ　　　　　文章编号：　１６７２－５１７４（２０１４）１２－０５４－０７
　 　基金项目：公益性行业科研专项经费项目（２０１３０３０４７）；海南省科学事业费项目（１１－２０４１０－００１５）；高校基本科研业务费项目（２０１３６２０４０）资助
收稿日期：２０１３－０６－０４；修订日期：２０１４－０１－２１
作者简介：孙　琰（１９８６－），女，硕士生。
　 通讯作者：Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｉｕｔａｏ＠ｏｕｃ．ｅｄｕ．ｃｎ
　　麒麟菜属（Ｅｕｃｈｅｕｍａ）、卡帕藻属（Ｋａｐｐａｐｈｙｃｕｓ）
和琼枝属（Ｂｅｔａｐｈｙｃｕｓ）在分类学上属于红藻门（Ｒｈｏ－
ｄｏｐｈｙｔａ），真红藻纲（Ｆｌｏｒｉｄｅｏｐｈｙｃｅａｅ），杉藻目（Ｇｉｇａｒ－
ｔｉｎａｌｅｓ），红翎菜科（Ｓｏｌｉｅｒｉａｃｅａｅ）。红翎菜科海藻是主
要的产卡拉胶经济红藻［１］，分布在热带－亚热带海域。
由于琼枝属、卡帕藻属和麒麟菜属海藻形态结构多样，
并且在长期进化过程中受环境影响和培养时间不同产
生了形态特征的变异，使得其分类学研究成为目前研
究的难点［２－４］。同时，部分物种海藻之间个体差异相对
较小，种质区分界限较模糊，也给鉴定造成了一定困
难。
目前，分子生物学工具的开发与运用对于探讨生
物系统进化关系以及辅助分类具有重要的应用价值。
而红翎菜科海藻在ＧｅｎＢａｎｋ中的数据较少，分子系统
学研究相对缓慢，分子标记方面的研究仅限于ＩＳＳＲ和
ＲＡＰＤ［５－６］；基于ＰＣＲ扩增的分子系统研究主要包括
ＳＳＵ－ｒＲＮＡ、ＵＰＡ、ｒｂｃＬ、ｃｏｘ２－３、ＬＳＵ、ｃｏｘ１［７－１２］等基因
片段，且当前研究的ｒｂｃＬ基因均不是全长，现阶段有关
分子生物学手段应用于琼枝属的研究鲜有报道，因此，
完善红翎菜科分子生物学数据对其系统发育进化研究
具有重要意义。
本研究通过ＰＣＲ扩增及测序方法得到红翎菜科４
种海藻的ＩＴＳ和ｒｂｃＬ序列，分析其序列特征，并结合
ＧｅｎＢａｎｋ数据库从分子水平上探讨红翎菜科海藻的分
类和系统进化关系，为ＧｅｎＢａｎｋ数据库增添了新的研
究数据，为红翎菜科海藻的分类鉴定及分子系统学研
究提供更多的依据。
１　材料和方法
１．１实验材料
实验材料由中国海洋大学大型海藻种质库提供。
包含印度尼西亚、越南、菲律宾以及中国海南省等地的
１９份海藻样品，其中２份琼枝属样品、２份麒麟菜属样
品和１５份卡帕藻属样品，所有材料均来自养殖群体
（详见表１）。
１．２基因组ＤＮＡ的提取
基因组总 ＤＮＡ 的提取采用改良 ＣＴＡＢ法［１３］。
ＤＮＡ经１％琼脂糖电泳检测，使用ＮａｎｏＤｒｏｐ　ＮＤ－１０００
仪器测定ＯＤ２６０／２８０比值及浓度，将ＤＮＡ模板浓度调整
到５０ｎｇ／μＬ用作ＰＣＲ扩增。
１．３序列测定
分别参照 Ｋｙｏｓｕｋｅ［１４］和 Ｆｒｅｓｈｗａｔｅ［１５］等方法对
ＩＴＳ和ｒｂｃＬ序列进行ＰＣＲ扩增，引物序列见表２。
ＩＴＳ：ＰＣＲ 反应体系（２５μＬ）：１０ｘＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ
（Ｍｇ２＋ Ｆｒｅｅ）２．５μＬ，ｄＮＴＰ（２．０ｍｍｏｌ／Ｌ）２．０μＬ，
Ｍｇ２＋（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）２．３μＬ，正反引物（１０μｍｏｌ／Ｌ）各
１２期 孙　琰，等：红翎菜科４种海藻ＩＴＳ和ｒｂｃＬ序列的分子系统学研究
表１　实验样品信息
Ｔａｂｌｅ　１　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｕｓｅｄ　ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ
物种Ｓｐｅｃｉｅｓ
ＧｅｎＢａｎｋ号ＧｅｎＢａｎｋ　ｎｕｍｂｅｒ
ＩＴＳ　 ｒｂｃＬ
样品编号
Ｓａｍｐｌｅ　ｎｕｍｂｅｒ
备注Ｒｅｍａｒｋｓ
采集地点
Ｃｏｌｅｃｔｉｏｎ　ｓｉｔｅｓ
采集时间
Ｃｏｌｅｃｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ
Ｂｅｔａｐｈｙｃｕｓ　ｇｅｌａｔｉｎａｅ　 ＪＸ０６９１５５ ＪＸ０６９１７４　 ２００９０５０５８ 中国海南 ２００９－０５－０９
Ｂ．ｇｅｌａｔｉｎａｅ　 ＪＸ０６９１７１ ＪＸ０６９１９０　 ２０１００４６６４ 中国海南 ２０１０－０４－２８
Ｋａｐｐａｐｈｙｃｕｓ　ａｌｖａｒｅｚｉｉ　 ＪＸ０６９１５６ ＪＸ０６９１７５　 ２００９０５０５９ 菲律宾 ２００９－０５－０９
Ｋ．ａｌｖａｒｅｚｉｉ　 ＪＸ０６９１５８ ＪＸ０６９１７７　 ２００９０５０６１ 越南 ２００９－０５－０９
Ｋ．ａｌｖａｒｅｚｉｉ　 ＪＸ０６９１５９ ＪＸ０６９１７８　 ２００９０５０６２ 越南 ２００９－０５－０９
Ｋ．ａｌｖａｒｅｚｉｉ　 ＪＸ０６９１６０ ＪＸ０６９１７９　 ２００９０５０６３ 越南 ２００９－０５－０９
Ｋ．ａｌｖａｒｅｚｉｉ　 ＪＸ０６９１６２ ＪＸ０６９１８１　 ２００９１１０５２ 印度尼西亚 ２００９－１１－１９
Ｋ．ａｌｖａｒｅｚｉｉ　 ＪＸ０６９１６４ ＪＸ０６９１８３　 ２００９１１００３ 越南 ２００９－１１－１９
Ｋ．ａｌｖａｒｅｚｉｉ　 ＪＸ０６９１６６ ＪＸ０６９１８５　 ２０１００４１０９ 越南 ２０１０－０４－０７
Ｋ．ａｌｖａｒｅｚｉｉ　 ＪＸ０６９１６８ ＪＸ０６９１８７　 ２０１００４１１２ 越南 ２０１０－０４－０７
Ｋ．ａｌｖａｒｅｚｉｉ　 ＪＸ０６９１６９ ＪＸ０６９１８８　 ２０１００４１１３ 越南 ２０１０－０４－０７
Ｋ．ａｌｖａｒｅｚｉｉ　 ＪＸ０６９１７０ ＪＸ０６９１８９　 ２０１００４１１５ 越南 ２０１０－０４－０７
Ｋ．ａｌｖａｒｅｚｉｉ　 ＪＸ０６９１７２ ＪＸ０６９１９１　 ２０１１０３０５４ 越南 ２０１１－０３－１７
Ｋａｐｐａｐｈｙｃｕｓ　ｓｐ． ＪＸ０６９１５７ ＪＸ０６９１７６　 ２００９０５０６０ 印度尼西亚 ２００９－０５－０９
Ｋａｐｐａｐｈｙｃｕｓ　ｓｐ． ＪＸ０６９１５３ ＪＸ０６９１８２　 ２００９１１０５３ 印度尼西亚 ２００９－１１－１９
Ｋａｐｐａｐｈｙｃｕｓ　ｓｐ． ＪＸ０６９１６５ ＪＸ０６９１８４　 ２０１００４１０８ 印度尼西亚 ２０１０－０４－０７
Ｋａｐｐａｐｈｙｃｕｓ　ｓｐ． ＪＸ０６９１７３ ＪＸ０６９１９２　 ２０１１０３０５８ 印度尼西亚 ２０１１－０３－１７
Ｅｕｃｈｅｕｍａ　ｄｅｎｔｉｃｕｌａｔｕｍ　 ＪＸ０６９１６１ ＪＸ０６９１８０　 ２００９１１０２７ 印度尼西亚 ２００９－１１－１９
Ｅ．ｄｅｎｔｉｃｕｌａｔｕｍ　 ＪＸ０６９１６７ ＪＸ０６９１８６　 ２０１００４１１１ 印度尼西亚 ２０１０－０４－０７
表２　ＩＴＳ、ｒｂｃＬ引物信息
Ｔａｂｌｅ　２　Ｐｒｉｍｅｒ　ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＩＴＳ　ａｎｄ　ｒｂｃＬ
基因名称
Ｇｅｎｅ
序列Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
来源
Ｓｏｕｒｃｅ
ＩＴＳ　 ＴＷ８１－５′－ＧＧＧＡＴＣＣＧＴＴＴＣＣＧＴＡＧ－
ＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣ－３′
文献［１４］
ＡＢ２８－５′－ＧＧＧＡＴＣＣＡＴＡＴＧＣＴＴＡ－
ＡＧＴＴＣＡＧＣＧＧＧＴ－３′
ｒｂｃＬ　 Ｆ－ＲＢＣＬ　５′－ＴＧＴＧＴＴＧＴＣＧＡＣＡＴＧ－
ＴＣＴＡＡＣＴＣＴＧＴＡＧＡＡＧ－３′
文献［１５］
Ｒ－１１５０５　５′－ＧＣＡＴＴＴＧＴＣＣＧＣＡＧＴＧ－
ＡＡＴＡＣＣ－３′
Ｆ－９３９：５′－ＴＴＣＣＧＴＧＴＡＡＴＴＴＧＴＡ－
ＡＧＴＧＧ－３′
Ｒ－ｒｂｃＳ　ｓｔａｒｔ：５′－ＴＧＴＧＴＴＧＣＧＧＣＣ－
ＧＣＣＣＴＴＧＴＧＴＴＡＧＴＣＴＣＡＣ－３′
０．１μＬ，Ｔｅｍｐｌａｔｅ （５０ｎｇ／μＬ）１μＬ，ｒＴａｑ酶（５Ｕ／μＬ）
０．２μＬ。ＰＣＲ反应程序：９４℃预处理６ｍｉｎ；３５个循
环，每个循环９４℃变性１ｍｉｎ，５５℃复性１ｍｉｎ，７２℃延
伸１ｍｉｎ；７２℃延伸１０ｍｉｎ。
ｒｂｃＬ：ＰＣＲ 反应体系（５０μＬ）：１０ｘＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ
（Ｍｇ２＋ Ｆｒｅｅ）５．０μＬ，ｄＮＴＰ（２．０ｍｍｏｌ／Ｌ）５．０μＬ，
Ｍｇ２＋（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）５．０μＬ，正反引物 （１０μｍｏｌ／Ｌ）各
０．５μＬ，Ｔｅｍｐｌａｔｅ（５０ｎｇ／μＬ）２．０μＬ，ｒＴａｑ酶 （５Ｕ／μＬ）
０．５μＬ。ＰＣＲ反应程序：９４℃预处理５ｍｉｎ；３５个循
环，每个循环９４℃变性１ｍｉｎ，５５℃复性２ｍｉｎ，７２℃延
伸２ｍｉｎ；７２℃延伸１０ｍｉｎ。
１．４序列测定及数据分析
ＰＣＲ产物使用ＴＩＡＮｇｅｌ　Ｍｉｄｉ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（北
京天根生化科技有限公司）胶回收纯化，连接ｐＭＤ１９－Ｔ
载体（ＴａＫａＲａ宝生物工程有限公司）并转化至感受态
Ｅ．ｃｏｌｉ　ＴＯＰ　１０（北京天根生化科技有限公司），经氨苄
青霉素抗性筛选阳性克隆，送上海英潍捷基生物技术
有限公司测序。
利用 Ｍｅｇａ　４．０［１６］和ＢｉｏＥｄｉｔ软件对序列进行比对
以及人工编辑。运用ＰＡＵＰ　４．０［１７］软件在 Ｍｏｄｅｌｔｅｓｔ
５５
中　国　海　洋　大　学　学　报 ２　０　１　４年
３．７中计算不同核酸替代模型的似然值并筛选出最适
核酸替换模型，最终按 Ａｋａｔｋｅ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ
（ＡＩＣ）结果得到的最适核酸替换模型利用以上数据在
ＰＡＵＰ　４．０中依据邻接法（Ｎｅｉｇｈｂｏｒ　ｊｏｉｎｉｎｇ，ＮＪ）和最
大似然法（Ｍａｘｉｍｕｍ　ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ，ＭＬ）构建系统树［１８］，
自举值Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ为１　０００次重复。依据最大简约法
（Ｍａｘｉｍｕｍ　ｐａｒｓｉｍｏｎｙ，ＭＰ）构建系统树时在 ＰＡＵＰ
４．０中采用启发式搜索（Ｈｅｕｒｉｓｔｉｃ　ｓｅａｒｃｈ）的逐步加入
式算法（Ｓｔｅｐｗｉｓｅ　ａｄｄｉｔｉｏｎ）分支交换法（Ｂｒａｎｃｈ　ｓｗａｐ－
ｐｉｎｇ　ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）设定为树二等分再连接算法（Ｔｒｅｅ　ｂｉ－
ｓｅｃｔｉｏｎ　ｒｅｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ，ＴＢＲ），每轮搜索最大尝试次数为
１　０００次，每步保留２０个树，自举值Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ为１　０００
次重复。
２　结果与分析
２．１ＩＴＳ序列结构特征
通过ＰＣＲ扩增及序列测定，得到ＩＴＳ全长序列和
部分１８Ｓ、２８Ｓ核糖体 ＤＮＡ序列，经过比对 ＧｅｎＢａｎｋ
数据库发布的ＩＴＳ序列，确定ＩＴＳ１、５．８Ｓ、ＩＴＳ２的序列
范围。结果表明，ＩＴＳ序列总长度在６２９～１　０２４ｂｐ之
间，表现出明显的长度差异（见表 ３），ＧＣ 含量在
４５．６％～５２％之间，其中ＩＴＳ１在１０１～１８８ｂｐ之间，
ＩＴＳ２在３６８～７１７ｂｐ之间，所有材料的５．８ＳｒＤＮＡ序
列非常保守，均为１６０ｂｐ。对于不同属，琼枝的ＩＴＳ序
列最长，达到１　０２４ｂｐ；其次是麒麟菜，长度１　００１ｂｐ；
卡帕藻ＩＴＳ长度范围是６２９～６６０ｂｐ，其中所有Ｋａｐ－
ｐａｐｈｙｃｕｓ　ｓｐ．的ＩＴＳ序列长度均为６６０ｂｐ，长心卡帕藻
又分成２大类，ＩＴＳ长度分别是６５４和６２９ｂｐ。
ｒｂｃＬ序列长度和 ＧＣ含量见表３。目前ＧｅｎＢａｎｋ
中同种属海藻ｒｂｃＬ还没有全长序列，长度分布在９３８～
１　４４６ｂｐ之间，而本实验所测ｒｂｃＬ均为全长序列，并且所
有１９份样品长度均为１　４６７ｂｐ，ＧＣ含量在３７．１％～
３７．６％之间。相比ＩＴＳ序列，ｒｂｃＬ序列表现出极强的
保守性。
２．２ＩＴＳ和ｒｂｃＬ序列变异分析
通过分析４个不同物种共１９份样品的的ＩＴＳ序
列差异后，归纳了４个物种的差异信息位点。在ＩＴＳ１
和ＩＴＳ２片段中，共发现５０３个变异位点，表现出极高
的变异比例。在相对保守的５．８Ｓ基因片段中，找出了
几个特定种属的信息位点，可用于区分不同种属，其中
卡帕藻属２个物种和琼枝的信息位点均为２个，麒麟菜
的信息位点有３个（见图１）。
表３　ＩＴＳ和ｒｂｃＬ序列结构信息
Ｔａｂｌｅ　３Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ　ｏｆ　ＩＴＳ　ａｎｄ　ｒｂｃＬ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ
样品Ｓａｍｐｌｅｓ 物种Ｓｐｅｃｉｅｓ
ｒｂｃＬ
长度
Ｌｅｎｇｔｈ／
ｂｐ
ＧＣ／％
ＩＴＳ
长度
Ｌｅｎｇｔｈ／
ｂｐ
ＧＣ／％
ＩＴＳ１
长度
Ｌｅｎｇｔｈ／
ｂｐ
ＧＣ／％
５．８Ｓ
长度
Ｌｅｎｇｔｈ／
ｂｐ
ＧＣ／％
ＩＴＳ２
长度
Ｌｅｎｇｔｈ／
ｂｐ
ＧＣ／％
２００９０５０５８　 Ｂ．ｇｅｌａｔｉｎａｅ　 １　４６７　 ３２．７　 １０２４　 ４５．７　 １８８　 ３６．７　 １６０　 ５０．７　 ６７６　 ４５．８
２００９０５０５９　 Ｋ．ａｌｖａｒｅｚｉｉ　 １　４６７　 ３２．７　 ６５４　 ５１．４　 １１４　 ３６　 １６０　 ５１．９　 ３８０　 ５５．８
２００９０５０６０　 Ｋａｐｐａｐｈｙｃｕｓ　ｓｐ． １　４６７　 ３２．７　 ６６０　 ５０．４　 １１５　 ３５．７　 １６０　 ５１．９　 ３８５　 ５４．５
２００９０５０６１　 Ｋ．ａｌｖａｒｅｚｉｉ　 １　４６７　 ３２．７　 ６２９　 ５１．７　 １０１　 ３５．６　 １６０　 ５１．９　 ３６８　 ５５．８
２００９０５０６２　 Ｋ．ａｌｖａｒｅｚｉｉ　 １　４６７　 ３２．７　 ６２９　 ５１．９　 １０１　 ３５．６　 １６０　 ５１．９　 ３６８　 ５５．８
２００９０５０６３　 Ｋ．ａｌｖａｒｅｚｉｉ　 １　４６７　 ３２．７　 ６２９　 ５１．８　 １０１　 ３５．６　 １６０　 ５１．９　 ３６８　 ５５．８
２００９１１０２７　 Ｅ．ｄｅｎｔｉｃｕｌａｔｕｍ　 １　４６７　 ３３．１　 １　００１　 ４６．９　 １２４　 ２７．２　 １６０　 ５０．１　 ７１７　 ４８．９
２００９１１０５２　 Ｋ．ａｌｖａｒｅｚｉｉ　 １　４６７　 ３２．７　 ６２９　 ５２　 １０１　 ３５．６　 １６０　 ５１．９　 ３６８　 ５５．８
２００９１１０５３　 Ｋａｐｐａｐｈｙｃｕｓ　ｓｐ． １　４６７　 ３２．７　 ６６０　 ５１．１　 １１５　 ３５．７　 １６０　 ５１．９　 ３８５　 ５４．５
２００９１１００３　 Ｋ．ａｌｖａｒｅｚｉｉ　 １　４６７　 ３２．７　 ６５４　 ５１．４　 １１４　 ３５．１　 １６０　 ５１．９　 ３８０　 ５５．８
２０１００４１０８　 Ｋａｐｐａｐｈｙｃｕｓ　ｓｐ． １　４６７　 ３２．７　 ６６０　 ５０．４　 １１５　 ３５．７　 １６０　 ５１．９　 ３８５　 ５４．５
２０１００４１０９　 Ｋ．ａｌｖａｒｅｚｉｉ　 １　４６７　 ３２．７　 ６２９　 ５１．８　 １０１　 ３５．６　 １６０　 ５１．９　 ３６８　 ５５．８
２０１００４１１１　 Ｅ．ｄｅｎｔｉｃｕｌａｔｕｍ　 １　４６７　 ３３．１　 １００１　 ４７　 １２４　 ２６．６　 １６０　 ５０．１　 ７１７　 ４８．８
２０１００４１１２　 Ｋ．ａｌｖａｒｅｚｉｉ　 １　４６７　 ３２．７　 ６５４　 ５１．５　 １１４　 ３５．１　 １６０　 ５１．９　 ３８０　 ５５．８
２０１００４１１３　 Ｋ．ａｌｖａｒｅｚｉｉ　 １　４６７　 ３２．７　 ６５４　 ５１．５　 １１４　 ３５．１　 １６０　 ５１．９　 ３８０　 ５５．８
２０１００４１１５　 Ｋ．ａｌｖａｒｅｚｉｉ　 １　４６７　 ３２．７　 ６５４　 ５１．６　 １１４　 ３５．１　 １６０　 ５１．９　 ３８０　 ５５．８
２０１００４６６４　 Ｂ．ｇｅｌａｔｉｎａｅ　 １　４６７　 ３２．７　 １０２４　 ４５．６　 １８８　 ３６．７　 １６０　 ５０．７　 ６７７　 ４５．９
２０１１０３０５４　 Ｋ．ａｌｖａｒｅｚｉｉ　 １　４６７　 ３２．７　 ６２９　 ５１．７　 １０１　 ３５．６　 １６０　 ５１．９　 ３６８　 ５５．８
２０１１０３０５８　 Ｋａｐｐａｐｈｙｃｕｓ　ｓｐ． １　４６７　 ３２．７　 ６６０　 ５０．６　 １１５　 ３５．７　 １６０　 ５１．９　 ３８５　 ５４．５
６５
１２期 孙　琰，等：红翎菜科４种海藻ＩＴＳ和ｒｂｃＬ序列的分子系统学研究
图１　ＩＴＳ序列５．８Ｓ基因信息位点
Ｆｉｇ．１　Ｔｈｅ　ｉｎｆｏｒｍａｔｉｖｅ　ｓｉｔｅｓ　ｏｆ　５．８Ｓｇｅｎｅ　ｆｒａｇｍｅｎｔ
２．３系统进化分析
根据ＩＴＳ序列及ＧｅｎＢａｎｋ数据库中下载的红翎菜
科ＩＴＳ序列，以紫菜属Ｐｏｒｈｒｙｒａ　ｈａｉｔａｎｅｎｓｉｓ为外群，
用ＮＪ、ＭＰ和 ＭＬ法分别构建系统树，３种方法所得聚
类结果一致，仅列出 ＭＰ法构建的系统树（见图２）。所
有红翎菜科海藻被明显分为３大分枝，分别为麒麟菜
属分枝，卡帕藻属分枝，琼枝属分枝，自展支持率均为
１００％。在卡帕藻属的大支上，又分为２个小分支，其
中本研究中来自菲律宾和越南的５株长心卡帕藻①和
来自印度尼西亚的４株卡帕藻属未知种（Ｋａｐｐａｐｈｙ－
ｃｕｓ　ｓｐ．）聚为一支，自展支持率为９０％；另一支由来自
印度尼西亚和越南的６株长心卡帕藻②和ＧｅｎＢａｎｋ中
的另一卡帕藻属未知种（Ｋａｐｐａｐｈｙｃｕｓ　ｓｐ．）组成，支持
率１００％。
由于本研究中所有样品的ｒｂｃＬ序列均为全长，而
ＧｅｎＢａｎｋ数据库中数据均不是全长，因此在构建系统
发育树时以较短序列为标准，以红毛菜属Ｂａｎｇｉａ　ｓｐ．
为外群，采用３种方法（ＮＪ，ＭＰ，ＭＬ）分别构建了基于
ｒｂｃＬ片段的系统发育树，仅列 ＭＰ方法构建系统树（见
图３）。结果表明所有红翎菜科海藻被分为麒麟菜属，
卡帕藻属，琼枝属３大分支，同属样品优先聚类，其中
卡帕藻大支又分为２个小支，一支主要由本研究中的
１１份长心卡帕藻样品组成，而本研究中的４株卡帕藻
属未知种（Ｋａｐｐａｐｈｙｃｕｓ　ｓｐ．）则聚到另一分支。
图２　基于ＩＴＳ序列构建的 ＭＰ进化树（▲代表本实验样品）
Ｆｉｇ．２　Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒｅｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＭＰ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｉｎｆｅｒｒｅｄ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ＩＴＳ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ（▲ Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ）
７５
中　国　海　洋　大　学　学　报 ２　０　１　４年
图３　基于ｒｂｃＬ序列构建的 ＭＰ进化树（▲代表本实验样品）
Ｆｉｇ．３　Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒｅｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＭＰ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｉｎｆｅｒｒｅｄ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｒｂｃＬ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ（▲ Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ）
３　讨论
红翎菜科不同海藻在ＩＴＳ序列长度上有明显差
异，变异范围大，其中琼枝序列最长达到１　０２４ｂｐ，最短
的长心卡帕藻，长度仅为６２９ｂｐ，反应出明显的属间差
异。此外对于卡帕藻属不同种，卡帕藻未知种（Ｋａｐ－
ｐａｐｈｙｃｕｓ　ｓｐ．）的ＩＴＳ序列长度比长心卡帕藻的长度略
长，同样能够反映出了一定的种间差异。而在ｒｂｃＬ序
列中，不同物种均未体现出长度上的差异。同时，长心
卡帕藻２种不同类型的ＩＴＳ序列差异也反映出其在长
期的进化过程中的变异。由此可以看出，ＩＴＳ序列较
ｒｂｃＬ有着更高的变异性，同时体现出了它在探讨种间
与种内差异的优越性。在测定ＩＴＳ序列全长过程中，
得到部分１８Ｓ序列信息，由于序列长度太短，且有关
１８Ｓ在本研究种类中的数据十分缺乏，本文未做进一步
探讨。
５．８Ｓ序列长度相对于ＩＴＳ１和ＩＴＳ２保守很多，但
其在属间、种间以及种内存在着特定的稳定变异位点。
Ｚｈａｏ等［１９］通过研究麒麟菜属和卡帕藻属样品的ＩＴＳ
序列，证实除了在５．８Ｓ序列中的５个核苷酸的变异
外，其余的变异均发生在ＩＴＳ１和ＩＴＳ２中。本研究也
仅统计了较保守的５．８Ｓ序列的信息位点，其中卡帕藻
属的信息位点有２个，琼枝属的信息位点有２个，麒麟
菜属的信息位点有３个，这些位点可作为区分不同种
属的特定位点。这些有效信息位点对于研究种属间的
系统分化关系具有一定的科学价值。
本研究通过ＩＴＳ和ｒｂｃＬ基因片段分别构建的系
统进化树具有较高的一致性，聚类结果均表明红翎菜
８５
１２期 孙　琰，等：红翎菜科４种海藻ＩＴＳ和ｒｂｃＬ序列的分子系统学研究
科３个属具有明显的属间遗传分化，这与之前报道的
ＵＰＡ、ｃｏｘ１、ｃｏｘ２－３和ｒｂｃ　ｓｐａｃｅｒ片段等研究结果一
致［７－８，１０，２０］，都具有较强的属间鉴别能力。本研究测定
的４个物种共１９份材料的ＩＴＳ和ｒｂｃＬ均为全长序列，
为准确全面分析红翎菜科物种分子系统进化提供了基
础，目前为止数据库中还没有ｒｂｃＬ的全长序列发布，本
研究首次测定了红翎菜科４个物种的ｒｂｃＬ全长序列，
为蛋白质水平的研究探讨提供可能，同时也为利用不
同基因组（细胞核、叶绿体等）的基因探讨分子系统进
化提供了可靠的保证。除此之外，本研究发现ＩＴＳ在
种间和种内也存在着明显的遗传分化，１１株长心卡帕
藻ＩＴＳ序列存在２种明显差异的序列类型：同一类型
不同株间的ＩＴＳ序列完全一致，而２种不同类型之间
的差异具体体现在长心卡帕藻②在多个位点处比长心
卡帕藻①具有１～８个碱基的缺失（见图４蓝色显示），
同时在多处位点存在明显的碱基变异（见图４红色标
记）。而该２种类型的差异，在ｒｂｃＬ序列中没有显示出
来，可见ＩＴＳ具有更加精确的分辨能力。
图４　长心卡帕藻①和②序列位点差异
Ｆｉｇ．４　Ｔｈｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｗｏ　ｔｙｐｅｓ　ｏｆ　Ｋ．ａｌｖａｒｅｚｉｉ
　　长心卡帕藻①和②在解剖学上无明显差别，均具
有长心卡帕藻典型的形态学特征。从地理分布上看，
除了样品２００９１１０５２是来自印度尼西亚，２００９１１０５９来
自菲律宾，其余的都来自越南，之间也没有明显的地理
相关性；从藻体颜色看，长心卡帕藻①的５株样品中，
藻体颜色包括黄褐色、深绿色、黄绿色等，而在长心卡
帕藻②中，藻体包括深绿色、红褐色、黄绿色和嫩绿色
等样品，２类卡帕藻均具有相同或相近的藻体颜色，并
没有出现明显的颜色区分；最后，从采集时间上分析，
长心卡帕藻①中的５株样品采自２００９年和２０１０年，而
长心卡帕藻②中的样品采自２００９年、２０１０年和２０１１
年，也无明显规律证实其序列变异与采集时间和驯养
时间有关。因此，经过综上分析，推测长心卡帕藻２种
类型的ＩＴＳ序列差异与其地理环境、藻体颜色和无性
繁殖时间（代数）等无关。
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（１．Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｍａｒｉｎｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｏｃｅａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃｈｉｎａ，Ｑｉｎｇｄａｏ　２６６００３，Ｃｈｉｎａ；２．Ｈａｉｎａｎ　Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ　Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ　Ｒｅ－
ｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｈａｉｋｏｕ　５７０２０６，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：　Ｔｈｅ　ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ＩＴＳ（ｗｉｔｈ　５．８ＳｒＤＮＡ）ａｎｄ　ｒｂｃＬ　ｇｅｎｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　４Ｓｏｌｉｅｒｉａｃｅａｅ　ａｌｇａｅ　ｓｐｅｃｉｅｓ
（Ｂｅｔａｐｈｙｃｕｓ　ｇｅｌａｔｉｎａｅ，Ｋａｐｐａｐｈｙｃｕｓ　ａｌｖａｒｅｚｉｉ，Ｋａｐｐａｐｈｙｃｕｓ　ｓｐ．ａｎｄ　Ｅｕｃｈｅｕｍａ　ｄｅｎｔｉｃｕｌａｔｕｍ）ｉｎｃｌｕ－
ｄｉｎｇ　１９ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ　ｗｅｒｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ　ｂｙ　ＰＣＲ　ｍｅｔｈｏｄ．Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ｒｂｃＬ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｗａｓ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｆｉｒｓｔ
ｔｉｍｅ，ａｎｄ　ｉｔ　ｐｒｏｖｉｄｅｓ　ｔｈｅ　ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｓ　ａｎｄ　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｓｏｌｉｅｒｉａｃｅａｅ　ａｌｇａｅ
ａｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｌｅｖｅｌ．Ｔｈｅ　ＩＴＳ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｌｅｎｇｔｈ　ｏｆ　Ｂｅｔａｐｈｙｃｕｓ，Ｋａｐｐａｐｈｙｃｕｓ　ａｎｄ　Ｅｕｃｈｅｕｍａ　ｗｅｒｅ　１　０２４，６２９～
６６９ａｎｄ　１　００１ｂｐ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｗｉｔｈ　ＧＣ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｏｆ　４５．２％～５２％．Ｔｈｅ　ｒｂｃＬ　ｇｅｎｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｌｅｎｇｔｈ　ｏｆ　ａｌ
ｔｈｒｅｅ　ｇｅｎｅｒａ　ｉｓ　１　４６７ｂｐ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ＧＣ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｖａｒｉｅｓ　ｆｒｏｍ　３７．１％ｔｏ　３７．６％．Ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｅｘｉｓｔｉｎｇ　ＩＴＳ
ａｎｄ　ｒｂｃＬ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｄｏｗｎｌｏａｄｅｄ　ｆｒｏｍ　ＧｅｎＢａｎｋ　ｄａｔａｂａｓｅ，ｗｅ　ｅｘｐｌｏｒｅｄ　ｔｈｅ　ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｏｆ
ｔｈｒｅｅ　ｍａｉｎ　ｇｅｎｅｒａ　ｏｆ　Ｓｏｌｉｅｒｉａｃｅａｅ．Ｔｈｅ　ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ａｌ　１９ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ　ｗｅｒｅ　ｇｒｏｕｐｅｄ
ｉｎｔｏ　ｔｈｒｅｅ　ｍａｉｎ　ｃｌａｄｅｓ：Ｅｕｃｈｅｕｍａ，Ｋａｐｐａｐｈｙｃｕｓ　ａｎｄ　Ｂｅｔａｐｈｙｃｕｓ．Ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｒｅｓｅａｒｃｈ，１１　Ｋａｐｐａｐｈｙｃｕｓ　ａｌ－
ｖａｒｅｚｉｉ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｗｅｒｅ　ｓｅｐａｒａｔｅｄ　ｉｎｔｏ　ｔｗｏ　ｔｙｐｅｓ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ＩＴＳ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ．Ｉｔ　ｗａｓ　ｉｎｆｅｒｒｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ｏｆ
ｔｗｏ　ｔｙｐｅｓ　ｗａｓ　ｕｎｒｅｌａｔｅｄ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｇｒｏｗｉｎｇ　ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，ａｓｅｘｕａｌ　ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ（ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）ａｎｄ　ｆｒｏｎｄ
ｃｏｌｏｒ　ｏｆ　ａｌｇａｅ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：　Ｅｕｃｈｅｕｍａ；Ｋａｐｐａｐｈｙｃｕｓ；Ｂｅｔａｐｈｙｃｕｓ；ＩＴＳ；ｒｂｃＬ；ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ
责任编辑　朱宝象
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