全 文 ：第 29 卷　第 5期
2007 年 9 月
北　京　林　业　大　学　学　报
JOURNAL OF BEIJING FORESTRY UNIVERSITY
Vol.29 , No.5
Sep., 2007
收稿日期:2006--12--07
http: journal.bjfu.edu.cn
基金项目:教育部科学技术研究重点项目(01029).
第一作者:张志翔 ,教授.主要研究方向:森林植物学.电话:010--62338015　地址:100083北京林业大学生物科学与技术学院.
利用 ITS系列探讨谷精草属 5个种的系统发育
张志翔1　林善枝1　薛　娴2
(1北京林业大学林木花卉遗传育种教育部重点实验室　2河南科技大学农学院)
摘要:以谷精草属(Eriocaulon)的尼泊尔谷精草(Eriocaulon nepalense)、白药谷精草(E.cinereum)、高山谷精草(E.
alperstre)、华南谷精草(E.sexangulare)、南亚谷精草(E .oryzetorum)等5 个种为研究对象 , 通过PCR扩增技术获得了
谷精草属 5个种的内转录间隔区序列 , 并对 ITS 序列进行分析.结果发现 , 供试谷精草属植物的 ITS 区长度并不完
全一致 , 其 ITS1 的长度范围为 171 ～ 306 bp , G+C 含量为 38.24%～ 55.04%;ITS2 的长度范围为 184 ～ 288 bp , G+C
含量为 36.46%～ 57.02%.在此基础上 ,采用 Clustal W version 1.7 对所得的 ITS 序列进行排序与分析 , 以灯心草属
(Juncus)的一个种 J .dregeanus 为外类群 , 并使用 PAUP 4.0 10 b 软件采用最大简约法分析获得最简约的系统发育
树.结果表明 , 在检测的 ITS 序列的 738个位点中稳定位点 174个 、变异位点 564 个(包括 276 个信息位点).另外 ,
从发育树上平行分出两个大的总分支 ,其中 E.nepalense 、E.oryzetorum 、E.alpestre 和 E.cinereum(云南宣威)为一
支;E.sexangulare为一支.上述二个分支与外类群聚在一起 , bootstrap 值为100%.
关键词:谷精草属 , ITS 序列 , 系统发育树 ,系统发育关系
中图分类号:Q949.71+8.15　　文献标识码:A　　文章编号:1000--1522(2007)05--0001--06
ZHANG Zhi-xiang1;LIN Shan-zhi1;XUE Xian2 .Phylogenetical relationship of five Ericaulon species
based on the ITS sequences.Journal of Beijing Forestry University (2007)29(5)1--6 [ Ch , 22 ref.]
1 Key Laboratory for Genetics and Breeding in Forest Trees and Ornamental Plants , Ministry of Education ,
Beijing Forestry University , 100083 , P.R.China;
2 Henan University of Science and Technology , Luoyang City , Henan Province , 471003 , P.R.China.
The obtained ITS (internal transcribed spacer)sequences of five species (Eriocaulon nepalense , E.
cinereum , E.alperstre , E.sexangulare and E.oryzetorum)in Eriocaulon by PCR technique were analyzed
by PAUP 4.0 10 b software , and the strict consensus tree was constructed using Juncus dregeanus as outgroup
in this study.The results showed that the ranges of ITS1 and ITS2 size of the tested five species were 171-306
bp and 184-288 bp , respectively , and the ranges of G+C content of ITS1 and ITS2 were about 38.24%-
55.04% and 36.46%--57.02%, respectively , indicating that the ITS sequences of Eriocaulon plants were not
completely identical.It was found that there were 174 constant characters and 564 varied characters(including
276 information characters)in the total 738 characters of the tested ITS sequences by the Clustal X(1.81)
multiple sequence alignment.In addition , there were two branches in the constructed phylogenetical tree , in
which E.nepalense , E.oryzetorum , E .alpestre and E.cinereum were grouped as one branch , while E.
sexangulare presented an independent branch , and the above two branches mentioned with outgroup Juncus
dregeanus were finally grouped with 100%of bootstrap.The obtained results provide an important basis for the
further study on the confirmation of phylogenetic position of Eriocaulaceae and Eriocaulon.
Key words　Eriocaulon , ITS sequences , strict consensus tree , phylogenetic relationship
　　谷精草科(Eriocaulaceae)植物共有 10 个属 、近
1 200 种 ,其中谷精草属(Eriocaulon)有 400多种 ,中
国仅分布有谷精草属 1属(约有 40种)[ 1-2] .谷精草
属植物分布特别广泛 ,在世界的热带 、亚热带和温带
DOI :10.13332/j.1000-1522.2007.05.001
均有分布 ,但谷精草属植物植株和花都特别小 ,种内
个体变异较大 ,而且种与种之间的相似度较高 ,这些
都为该属的分类 、种间的划分以及系统研究带来极
大的困难[ 3-4] .以往对谷精草属植物的分类研究主
要是以花的基数等形态学特征为依据 ,且多局限于
某区域 ,很少以洲或大陆为单位开展研究[ 1-2 , 5-7] ;加
上许多种错误的原始记载 ,导致该属研究的混乱 ,出
现很多同物异名现象 ,致使谷精草科植物的系统发
育位置至今尚未完全确定 ,存在很多问题和争议.
植物分子系统学就是在分子水平对植物进行系
统学研究的学科 ,它充分利用丰富的生物分子数据 ,
并借助统计学方法对生物体间以及基因间的进化关
系进行研究[ 8] .Chase[ 9] 利用 cpDNA 的 rbcL序列信
息 ,并结合形态分析得出结论:谷精草科是莎草科
(Cyperaceae)与灯心草科(Juncaceae)的姐妹群 ,而与
禾本科(Poaceae)亲缘关系较远.Givinish 等[ 10] 在对
鸭趾草亚纲(Commelinids)以及相关植物的 rbcL片段
进行分析后 ,认为谷精草科与黄眼草科(Xyridaceae)
亲缘关系较近 ,且二者与禾本科有较近的系统关系.
两人的研究结果在确定谷精草科的系统位置时 ,得
出了相反的结论.另外 ,APG[ 11](基于 rbcL片段信息
和形态分析的证据)、Chase 等[ 9] 和Michelangeli 等[ 3]
都认 为 谷 精 草 科 同 黄 眼 草 科 、偏 穗 草 科
(Rapateaceae)、三蕊细叶草科(Mayacaceae)和凤梨科
(Bromeliaceae)亲缘关系较近;而在 APG Ⅱ[ 11] 的系统
中凤梨科 、三蕊细叶草科和偏穗草科的系统位置没
有得到确定.
到目前为止 ,对谷精草科植物除了形态分类学
研究之外 ,利用分子生物学手段对谷精草科系统位
置的研究大都是仅围绕谷精草科与其他科之间亲缘
关系来进行 ,仅涉及到 Paepalanthus 属 、Tonina 属和
Syngonanthus属[ 12-16] ,而把谷精草科植物作为专门研
究对象并采用分子生物学手段和形态分类相结合来
进行系统学研究的却不多 ,尤其是谷精草属内分子
系统学的研究至今未见报道.
本文以谷精草属的尼泊尔谷精草(Eriocaulon
nepalense)、白药谷精草(E .cinereum)、高山谷精草
(E.alperstre)、华南谷精草(E .sexangulare)、南亚谷
精草(E.oryzetorum)等5个种为研究对象 ,通过PCR
扩增技术获得了谷精草属 5 个种的内转录间隔区
(internal transcribed spacer , ITS)序列 ,并对 ITS序列进
行分析.在此基础上 ,采用 Clustal W version 1.7 对
所得的 ITS 序列进行排序与比较 , 以灯心草属
(Juncus)的一个种 J .dregeanus 为外类群 ,并使用
PAUP 4.0 10b软件采用最大简约法分析获得最简约
的系统发育树 ,从中探讨谷精草属植物组间的系统
发育关系 ,进一步验证已有的形态学分类结果 ,为下
一步确定谷精草属和谷精草科的系统位置提供科学
的理论依据.
1　材料与方法
1.1　材　料
本研究的材料均为硅胶干燥 , 其供试物种 、产
地和存放地见表 1.
表 1　研究材料名称 、产地及存放地
TABLE 1　Name , location and deposition of the research materials
中文名 学名 产地 存放地
白药谷精草 E.cinereum□ 福建安溪 北京林业大学森林植物标本馆 BJFC
白药谷精草 E.cinereum○ 云南宣威 北京林业大学森林植物标本馆 BJFC
高山谷精草 E.alpestre 云南大理 北京林业大学森林植物标本馆 BJFC
尼泊尔谷精草 E.nepalense 云南屏边 北京林业大学森林植物标本馆 BJFC
南亚谷精草 E.oryzetorum 福建安溪 北京林业大学森林植物标本馆 BJFC
华南谷精草 E.sexangulare 福建安溪 北京林业大学森林植物标本馆 BJFC
注:□为福建安溪种源 , ○为云南宣威种源.以下同.
1.2　方　法
1.2.1　总 DNA的提取
总DNA的提取按 Xue[ 17] 等的方法.
1.2.2　内转录间隔区(ITS)序列的克隆与测定
由于 ITS1 、ITS2分别位于 18S ～ 5.8S rDNA 、5.8S
～ 26S rDNA 之间 ,而 18S 、5.8S 、26S rDNA 的序列非
常保守 ,因此可用与它们序列互补的通用引物对
ITS区进行 PCR扩增.本研究采用通用引物[ 18] 对
ITS区进行整段扩增 ,引物 P1位于 18S rDNA基因3′
端上游 ,与 18S rDNA靠 ITS1的边界序列互补 ,其序
列为:5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′;引物 P2
位于 26S rDNA基因 5′端下游 ,与 26S rDNA 靠 ITS2
的边界序列互补 , 其序列为:5′-TCCTCCTCCGCT
TATTGATATGC--3′.
PCR扩增反应体系为 20 μL ,含有 20 ～ 40 ng 模
板 DNA 、 100 μmol dNTP 、10 pmol 引物 、1.5 U Taq
DNA聚合酶 、2 mmol 10×Buffer.PCR扩增反应程序
为:97℃预变性 4 min , 94℃变性 1 min 、55℃退火
1 min 、72℃延伸 1 min 、共 5个循环 ,72℃延伸 7 min.
PCR反应产物用 PGMT-easy 克隆试剂盒进行克隆.
2 北　京　林　业　大　学　学　报 第 29卷　
用T 载体在16℃连接过夜 ,在TOP10感受态细胞内
进行转化之后 ,涂布在固体 LB 培养基上 ,选用氨卞
青霉素抗性(Amp r)在 37℃倒置培养过夜 ,挑出白色
菌斑进行 PCR检测 ,选择扩增比较好的菌斑用液体
LB培养基进行过夜培养 ,从中取 2 mL 菌液进行测
序.测序反应在北京农林科学院生物中心实验室和
上海生工生物公司进行 ,测序引物为通用引物 T7和
SP6.为了保证测序的准确性 ,对 ITS序列进行正 、反
链双向测序并加以校准.
1.2.3　外类群的选择
根据以往形态学的研究[ 19-22] ,谷精草科和黄眼
草科以及灯心草科亲缘关系比较近 ,而黄眼草科与
谷精草科关系最近.Clustal W version 1.7排序结果
表明 ,灯心草属 Juncus 的一个种 J .dregeanus比黄
眼草属Xyris的一个种X .indica 在系统发育树上更
接近谷精草属.另外在中国没有谷精草科的其他属
植物分布.因此 ,在建立谷精草属的系统发育树时 ,
以灯心草属的一个种 J .dregeanus作为外类群进行
分析较为合适.
1.2.4　数据分析
所得序列采用 Clustal W version 1.7进行对比 ,
并利用 PAUP4.0 b10软件进行统计分析和分支分
析.最简约树采用启发式搜索(heuristic search)取严
格一致树(consensus tree).用自展法(Bootstrap)检验
系统树中各分支的支持强度 ,自展数据集为 100.
2　结果与分析
2.1　各类群的 ITS1和 ITS2的长度及 G+C含量
表2试验结果表明 ,谷精草属几个种的 ITS1的
长度范围为 171 ～ 306 bp , ITS2的长度范围为 184 ～
288 bp ,而5.8S rDNA则高度一致 ,均为 128 bp.其中
E.cinereum(福建安溪)与其他种无论 ITS长度还是
G+C含量上都存在较大差别 ,而且来自云南宣威和
福建安溪的 E.cinereum 也存在明显差异 ,说明 E.
cinereum种内具有很大的变异和丰富的遗传多样
性 ,这与 RAPD结果相一致[ 18] .
表 2　各类群的 ITS1 和 ITS2 的长度和G+C 含量
TABLE 2　Length and G+C content of ITS1 and ITS2
for the five species of Eriocaulon
种 ITS1 ITS2长度 bp G+C含量 % 长度 bp G+C含量 %
E.cinereum □ 306 38.24 288 36.46
E.cinereum ○ 171 45.02 208 54.32
E.alpestre 219 38.81 192 47.39
E.nepalense 220 50.45 208 56.73
E.oryzetorum 218 55.04 184 54.34
E.sexangulare 229 48.03 210 57.02
2.2　各类群的 ITS序列的分析及 Cluster排序
所得序列采用 Clustal W version 1.7 进行排序
(图 1).从 Cluster排序结果来看 ,除 E .sexangulare
之外 ,其他5个样品的 5.8S rDNA 序列都高度一致 ,
ITS 序列也有很多位点碱基完全相同.而 E.
sexangulare与这 5 个样品在 ITS 序列和 5.8S rDNA
序列都差别很大 ,这与形态分类结果相吻合[ 1--2] .
另外 ,Gap作为缺失处理时 ,对排序后的结果用
PAUP4.0 b10软件对738个位点进行分析 ,其中稳定
位点 174个 ,变异位点 564个 (包括 276个信息位
点),变异位点和信息位点分别占全序列的 76.42%
和 37.40%(图 1),这说明谷精草属各类群均可能存
在较大的变异性和丰富的遗传多样性.
3第 5期 张志翔等:利用 ITS系列探讨谷精草属 5个种的系统发育
4 北　京　林　业　大　学　学　报 第 29卷　
图 1　Clustal(W version 1.7)排序结果
FIGURE 1　Multiple sequence alignment of Clustal(W version 1.7)
注:＊代表各个序列在该位点碱基完全相同.
2.3　ITS序列的系统发育树的构建
排列好的 ITS序列以灯心草属 Juncus的一个种
J .dregeanus 作为外类群构建系统发育树 , 使用
PAUP 4.0 b10软件并采用最大简约法分析获得最简
约树 ,步长为 1 180步 ,一致性指数(CI)和维持性指
数(RI)值分别为0.798 3和 0.347 9.利用PAUP4.0
b10软件进行统计分析和分支分析 ,计算各类群间
核苷酸差异值及差异矫正值 ,最简约树采用启发式
搜索(heuristic search)取严格一致树(consensus tree).
用自展法(Bootstrap)检验系统树中各分支的支持强
度 ,自展数据集为 100.
ITS序列的系统发育树结果显示(图 2),从发育
树上平行分出 3 个大的总分支 , 其中外类群 J .
dregeanus 为一支 , 位于系统发育树的中间;E .
nepalense 、E.oryzetorum 、E.alpestre 和 E.cinereum
(云南宣威)为一支;E .sexangulare 为一支 ,位于系
统发育树的最基部.最后 ,上述 3 个分支又聚在一
起 ,自展数据集值为 100%.进一步分析发现 ,在第
1个分支中 , E.nepalense 和 E.oryzetorum 先聚在一
起后又与 E.alpestre 聚在一起 ,然后与 E.cinereum
(云南宣威)聚在一起(bootstrap值为 57%),进而与
图 2　谷精草属 ITS序列的系统发育树
FIGURE 2　Strict consensus t ree of Eriocaulon
constructed by ITS phylogeny
注:图中数字为支持率.
E.cinereum(福建安溪)聚为一支 ,自展数据集值为
63%,说明 E.nepalense 与E .cinereum 关系相对较
远 , 这与 Xue 等[ 18] 报 道的 E.nepalense 与 E.
cinereum 的遗传距离为0.569 0的结果相一致.该研
究结果与形态特征的系统发育研究综合分析发现 ,
具有显著的关联.在形态学的系统发育中 , E.
nepalense 和E.oryzetorum 归属同一的Sect.Simplices
Fyson
[ 4] ,其主要特征是雌花花萼离生 , 种子表皮具
5第 5期 张志翔等:利用 ITS系列探讨谷精草属 5个种的系统发育
柱状突起 ,花药黑色;而与上述两个种聚为同一分支
的 E .alpestre属于 Sect.Apoda Z.X.Zhang ,其在花
药颜色和种皮结构上与Sect.Simplices Fyson有着较
密切的亲缘关系 ,但其雌花合生的花萼与之有较大
的区别.E .sexangulare 是Sect.Heterochiton Ruhl.的
代表植物 ,紧密的花序 、雌花花萼具显著龙骨 、雄花
花萼筒状的特征与其他物种有着显著的区别 ,在本
研究也被单独分为一支.E.cinereum 为 Sect.
Leucantherae Fyson 的代表性物种 ,重要的形态特征
是白色花药 、种皮光滑 ,与上述各组区别较大 ,在本
研究中 ,与 E .nepalense 、E.oryzetorum 和E.alpestre
的聚类结果相距较远.来自云南和福建的 E .
cinereum 在分子水平出现显著的差异 ,表明了存在
着丰富的遗传多样性 ,这与该种的分布有着关联.
E .cinereum 为水稻田常见的伴生植物 ,分布广泛从
东亚到澳大利亚 ,再到非洲均有分布 ,随着水稻在欧
洲的种植 ,该种也进入欧洲的意大利 ,因此 ,产生遗
传上的变异是有可能的.
参 考 文 献
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(责任编辑　赵　勃)
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