全 文 ：Comparison Analysis on Direct Sequencing of PCR Products
and Sequencing of Cloning PCR Products of ITS Sequence of
Nuclear rDNA in Kengyilia (Poaceae:Triticeae)
ZENG J ian , ZHANG L i , F AN Xing , ZHANG Chun , ZHANG Hai-qin , ZHOU Y ong-hong
(T riticeae Research Institute, Sichuan Agricultural University , Dujiangyan 611830 , Sichuan , China)
Abstract:The results of direct sequencing of PCR products and sequencing by cloning PCR products of
the internal transcribed spacers and the 5.8S coding regions of nuclear ribosomal DNA in Kengyil ia
were compared and phy logenetically analy zed.The results show that ITS sequences are of existed dif-
ferences between the direct sequencing of PCR products and sequencing by cloning PCR products.The
phylogenet ic relationship in Kengy ilia species based on sequences by cloning PCR products is consistent
w ith the analysis of mo rphology , geog raphical dist ribution , cy tology and molecular markers.There-
fo re , phylogenet ic analysis carried out by sequencing of cloning PCR products is more credible than that
inferred f rom direct sequencing of PCR products.
Key words:Kengy ilia;I TS sequences;sequencing;phylogenetic analy sis
仲彬草属植物 ITS序列 PCR产物直接测序与克隆测序比较分析
曾　建 , 张　利 , 凡　星 , 张　春 , 张海琴 , 周永红
(四川农业大学 小麦研究所 , 四川 都江堰　611830)
摘要:通过 PCR产物克隆测序和直接产物测序的方法对禾本科小麦族仲彬草属 10 个物种的 rDNA 内转录间隔区
(ITS)及 5.8S rDNA 进行了序列测定和系统发育分析。结果表明:该属植物 ITS 区直接产物测序与克隆测序存在
较大差异 , 克隆测序序列反映的系统发育关系与形态学 、地理分布 、细胞学 、分子标记分析结果基本一致。因此 , 采
用克隆测序的方法对仲彬草属植物系统发育分析比直接测序方法更为可靠。
关键词:仲彬草属;ITS 序列;序列测定;系统发育分析
中图分类号:Q949.714　　文献标识码:A　　文章编号:1000-2650(2006)04-0369-06
　　仲彬草属 Kengyil ia Yen et J.L.Yang 是颜济
和杨俊良于 1990 年以戈壁仲彬草 Kengyil ia gobi-
cola Yen et J.L.Yang 为模式种建立的一个小麦族
多年生属[ 1 , 2] 。该属含有 26个种和 6变种 ,分布于
帕米尔高原 、喀喇昆仑山脉 、阿尔泰山脉 、天山山脉 、
祁连山脉 、喜马拉雅山脉及其青藏高原地区。生长
在海拔 1100 ～ 5100 m 的草甸 、草原 、荒漠中[ 3] 。从
形态上看 ,与耿以礼[ 4] 建立的鹅观草属拟冰草组
Roegneria Sect.Paragropyron 的植物相似 ,介于鹅
观草属 Roegneria C.Koch 和冰草属 Agropyron
Gaertn.之间 。 Yen 和 Yang[ 2] 、周永红[ 5] 、时英
等[ 6] 、Jensen[ 7 , 8]和 Zhang et al[ 9 ,10]等学者通过细胞
学研究表明 ,该组植物为六倍体物种(2n =6x =
42),具有 StYP 染色体组组成 。从分类地位看 ,不
同学者有不同的处理。陈守良和耿以礼[ 11]将这组
植物放在鹅观草属中;Tzvelev[ 12]将它们组合到偃麦
草属短穗组中;Löve[ 13]和 Jensen[ 7 , 8]把这些植物放
在广义披碱草属中 。从种间关系来看 ,周永红等[ 14]
第 24 卷　第 4 期
2006年 12 月 　　　　　　　　 　
四川农业大学学报
Journal of Sichuan Ag ricultural University
　　　　　　　　 　Vol.24 No.4
Dec.2006
收稿日期:2006-09-04
基金项目:国家自然科学基金项目(编号:30470135 和 30270099);　教育部长江学者和创新团队发展计划(编号:IRT
0453)。
通讯作者(Corresponding author)。
和张利等[ 15]利用 RAPD 和 RAMP 分子标记表明 ,
分布于新疆和青藏高原的仲彬草属物种存在较大的
遗传变异 ,种间具有丰富的遗传多样性 。蔡联炳
等[ 16]通过形态比较将 K .melanthera 处理为 K .
thoroldiana var.melanthera 。因此 ,目前关于仲彬
草属植物的系统分类地位 、物种界限以及种间和种
内亲缘关系等问题还存在较大分歧 。
高等植物中的核 rDNA基因是高度重复的串联
序列单位 , 18S 、5.8S 和 26S rDNA 联结在一起 ,作
为一个转录单位。18S ～ 26S 核 rDNA 之间的内转
录间隔区 ITS(internal transcribed spacer)被 5.8S 分
为 ITS1 和 ITS2 两部分 ,由于所受的选择压力较
小 、DNA碱基替换速率较快 ,加上较大的拷贝数 、适
中的长度和快速的同步进化等特点 ,是研究许多植
物类群系统演化和发育的重要分子标记 ,特别适合
研究被子植物属下类群的系统演化关系[ 17-20] 。
Hsiao 等[ 21]研究了 10种禾草的 I TS 序列 ,认为 ITS
序列在分析系统关系较近物种的系统发育关系是非
常有用的。Hsiao等[ 22]研究了小麦族二倍体物种的
ITS序列;张文驹等[ 23]研究了普通小麦基因组最可
能 4个供体种的 ITS1和 ITS2序列及系统关系;王
超等[ 24]研究了山羊草属二倍体物种核 rDNA ITS
区序列及其系统发育关系;Liu等[ 25]研究了广义小
麦族披碱草属物种的核 rDNA ITS 和叶绿体 t rnL
-F 的序列及其系统发育关系 ,结果都证明了 ITS
区序列适用于小麦族属级及其属下分类单位的系统
发育研究 。
应用 ITS序列进行系统发育分析时 ,选择 PCR
产物直接测序还是 PCR产物克隆测序尚有争论 ,目
前关于这方面的报道很少。李春香等[ 26]比较了两
种测序方法 ,表明 rDNA重复序列纯合程度影响测
序结果 ,并且不同克隆序列之间也存在差异 。本研
究通过对 10种仲彬草属植物的 I TS 序列的 PCR产
物直接测序和克隆测序 ,比较了两种测序的结果并
对两种结果进行了系统发育分析 ,旨在探讨 ITS 序
列 PCR产物直接测序和克隆测序的差别及其对系
统发育分析的影响 。
1　材料与方法
1.1　材　料
10种仲彬草属物种的材料编号 、染色体组组成
及来源列于表 1。Y编号材料由四川农业大学小麦
研究所提供;PI 编号材料由美国国家植物种质资源
库(American National Plant Germplasm System)提
供 。所有材料均种植于四川农业大学小麦研究所多
年生种质圃 ,凭证标本存于四川农业大学小麦研究
所植物标本室(SA UTI)。
1.2　方　法
1.2.1　基因组总 DNA的提取
每份材料取单株植物的幼嫩叶片约 3 g 用于
DNA提取 ,总 DNA用 CATB法提取[ 27] 。
1.2.2　ITS的 PCR扩增和测序
扩增 ITS区的引物参照 Hsiao et al.[ 22] ,引物序
列分别为 ITSL:5 -TCGTAACAAGGT TTCCG-
TAGGTG - 3 和 ITS4:5 - TCCTCCGCT-
TATTGATATGC-3 。引物由北京赛百盛生物基
表 1　供试材料
Table 1　The materials used in this study
序号
No. 物种名称Species 材料编号Accession No.染色体组Genome 采集地Origin
1 Kengyilia gobicola Yen e t J.L.Yang Y9503 StYP 新疆塔什库尔干
Tanshikuergan , Xinjiang
2
Kengyilia mutica (Keng et S.L.Chen)J.L.Yang , Yen
et Baum Y2873 StYP 青海格尔木 Geermu , Qinghai
3 Kengyilia hirsuta(Keng et S.L.Chen)J.L.Yang , Yen
et Baum
PI 504457 StYP 青海青海湖
Qinghai Lake , Qinghai
4
Kengyilia kokonorica (Keng et S.L.Chen)J.L.Yang ,
Yen et Baum Y2880 StYP 青海共和 Gonghe , Qinghai
5 Kengyilia batalinii(Krassn.)J.L.Yang , Yen et Baum PI 565002 StYP 哈萨克斯坦 Kazakhstan
6 Kengyilia rigidula (Keng et S.L.Chen) J.L.Yang ,
Yen et Baum
Y2330 StYP 甘肃夏河 Xiahe , Gansu
7
Kengyilia grandiglumis (Keng et S.L.Chen) J.L.
Yang , Yen et Baum Y2857 StYP 青海海晏 Haiyan , Qinghai
8 Kengyilia tahelacana J.L.Yang , Yen et Baum Y0852 StYP 新疆温宿 Wensu , Xinjiang
9 Kengyilia zhaosuensis J.L.Yang , Yen et Baum Y2633 StYP 新疆昭苏 Zhaosu , Xinjiang
10 Kengyilia melanthera (Keng)J.L.Yang , Yen et Baum Y2891 StYP 青海玛多 Maduo , Qinghai
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因技术公司合成。PCR的反应体系为 50 μL ,其中
包括:10 ～ 20 ng 模板 DNA , 5μL ExTaq PCR buf fer ,
0.2 mmol/L dNTP , 3μL M gCl2 ,1.5μL引物 , 2.5 U
ExTaq DNA 聚合酶。扩增程序为:94 ℃预变性 5
min ,每循环在 94 ℃变性 1 min , 52 ℃退火 1 min ,72
℃延伸 1min ,共 35个循环 。最后一个循环结束后 ,
在 72 ℃延伸 8 min。扩增产物用 0.8%琼脂糖电泳
检测 。
PCR产物经 ENZATM(OMEGA)试剂盒回收纯
化后 ,采用 T -A克隆法将扩增片段连接到 PMD18
-T 载体上 ,转化 DH5α大肠杆菌 ,经 X-gal/ IPTG
平板筛选。从长出的蓝/白菌落中挑选白色菌落提
取质粒进行 PCR检测 ,确定含有效插入的克隆。序
列测定由北京三博远志生物技术有限公司完成。根
据双向测序结果 ,拼接出完整序列并进行人工校正 。
1.2.3　序列分析及系统树的构建
ITS区序列的长度根据 Hsiao et al.[ 21 ,22] 中的
序列确定 。序列经 Clustal X程序[ 28]对位排列 ,以雀
麦 Bromus tectorum L.(L36485)为外类群 , 用
PAUP 4.08b10软件[ 29]构建系统发育树。采用启发
式搜索 , 获取最大简约树(maximum parsimony
tree),并用自展法(bootst rap)检验简约树中的各分
支的支持率。
2　结果与分析
2.1　PCR产物直接测序
对扩增的 ITS 片断进行直接产物测序 ,结果显
示其 ITS序列长度变化范围为 598 ～ 601 bp 。除 K .
rigidula , K .zhaosuensis 的长度分别为 601 bp 和
599 bp外 ,其余物种长度均为 598 bp(图 1)。在 K .
rigidula和 K .zhaosuensis的序列中存在 3 处碱基
的插入(图 1 中箭头所示位点)。其原因可能是在
PCR扩增过程中出现的随机错误 。直接产物测序的
结果反映出 10 个多态性位点(图 1 五角星所示位
点)。
2.2　PCR产物克隆测序
对 10个仲彬草属物种的 I TS 区进行克隆测序 ,
结果显示所有 ITS区序列均为 598 bp ,长度趋于一
致。克隆测序的结果反映出 5个多态性位点 ,明显
少于直接产物测序的结果(图 1 中方框所示位点)。
在反映的多态性位点上 ,直接产物测序和克隆测序
这两种方法表现出较大的差异。测序结果比较 ,发
现共有 15 个位点的碱基变异(图 1 中星号所示位
点)。
2.3　系统发育树构建
对两种测序方法的结果进行序列排列后 ,空位
作为缺失处理 , 以雀麦 B .tectorum 为外类群 , 用
PA UP 4.08b10软件构建系统发育树 。
对于直接产物测序结果 , ITS 区全序列排序后
长度为 604个位点 ,其中有 60个变异位点 , 14个为
系统发育的信息位点 。采用最大简约法构建的系统
发育树 ,树长为 84步 ,一致性指数(CI)和维持性指
数(RI)分别是 0.9167和 0.7308。10个仲彬草属物
种聚为一个分支(图 2)。
对于克隆测序结果 , ITS 区全序列排序后长度
为600个位点 ,其中有 60个变异位点 ,系统发育的
信息位点 5 个。用最大简约法获得一棵最简约树
(图 3)。简约树长度为 66 步 , CI 和 RI 分别是
0.9848和 0.8571。供试的 10个仲彬草属物种聚成
了两个较明显的分支:分布于新疆及其邻近区域的
物种聚为一支;而分布于青藏高原及其邻近地区的
物种构成另外一支。
将两种方法测序的结果同时用于系统树的构
建 ,全序列排序后长度为 604个位点 ,其中变异位点
62个 ,系统发育的信息位点 17 个。用最大简约法
获得简约树 ,见图 4。简约树长度为 93步 ,CI 和 RI
分别是 0.8817和 0.7250 。供试的仲彬草属物种形
成两个明显的分支 。从聚类结果看 ,只有 K .batal-
inii 和K .gobicola 这两个物种聚在一起;K .melan-
thera聚在同一分支中;而其余 7个物种分别聚在不
同的分支中。通过最大似然法分析 ,两种测序结果
经启发式搜索得到的简约树与利用简约法分析得到
的简约树拓扑结构相同 ,只是支持率略有差异。
3　讨　论
Baldw in等[ 18]曾指出 ,在被子植物系统发育分
析中 ,是测定 ITS区的 PCR克隆还是直接测定 PCR
产物序列更好 ,尚处于争论之中。王建波等[ 20] 认
为 ,测序方法要依照不同物种的 ITS进化程度而定。
如果 rDNA重复序列间的纯合程度较低 ,各重复单
位间序列差异大 ,特别是当重复序列间存在插入/缺
失时 ,对 PCR产物的直接测序就不能反映其 ITS区
序列的多态性 ,因而必须对 PCR产物进行常规克隆
后再测序。如果 rDNA 重复序列间的纯合程度很
高 ,两种方法测序都能反映 ITS 区的序列。但值得
注意的是 ,PCR扩增中会发生一定的随机错误 ,如果
所测克隆序列刚好是误扩增序列 ,就会影响结果的
准确性[ 30] 。本研究中 ,利用两种不同测序方法得到
371第 4 期　　　　　　　曾　建(等):仲彬草属植物 ITS 序列 PCR产物直接测序与克隆测序比较分析　　　　　　　
图 1　仲彬草部分物种 ITS 片段 PCR产物直接测序和克隆测序的结果
种名后面的数字 1 和 2 表示所测得序列分别是对 PCR扩增产物克隆测序和直接测序结果;“ -”表示相同的碱基;“.”
表示碱基的缺失。
Fig 1　Aligned ITS sequences of Kengy ilia determinned by direct sequencing of
PCR products o r by cloning of PCR products and sequencing
1 and 2 indicate the sequences by cloning sequencing and direct sequencing , respectively;“ -” deno te identity to the B .tecto-
rum ;“ .” deno te gaps.
372　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　四川农业大学学报　　　　　　　　　　　　　　　　　　第 24 卷
图 2　仲彬草属植物核糖体 ITS 片段扩增 PCR产物
直接测序序列构建的系统发育树
分支上面的数值表示最大简约法自展支持率 , 分支
下面数值表示最大似然法自展支持率(下图同)。
Fig 2　The maximum parsimony tree based on direct sequencing of
PCR products of the internal transcribed spacers in Kengyilia
Number above and below branches are bootstrap value
by MP and M L method , respectively.
图 3　仲彬草植物核糖体 ITS 片段扩增 PCR产物
克隆测序序列构建的系统发育树
Fig 3　The maximum parsimony tree based on sequencing by cloning
PCRproducts of the internal transcribed spacers in Kengyilia
图 4　仲彬草属植物核糖体 ITS 片段扩增 PCR产物
直接测序和克隆测序结果构建的系统发育树
种名后的数字 1 , 2 分别表示直接产物测序和克隆测
序的结果。
Fig 4　The maximum parsimony tree based on direct sequencing of
PCR products and safquencing of cloning PCR products in Kengyilia
The number 1 and 2 after species name indicate direct
sequencing and the sequences by cloning sequencing , respec-
tively.
的 ITS 区序列结果比较表明 ,仲彬草属植物的 rD-
NA 重复序列间存在碱基插入 ,两种测序结果存在
较大的差异 。直接测序的碱基变异位点多于克隆测
序 ,其原因可能是经过克隆后 ,在 PCR扩增过程中
出现的随机错误在大肠杆菌得到了修复。
根据两种测序方法获得测序结果构建的系统发
育树反映了不同的系统发育关系 。利用克隆测序得
到 I TS 序列系统发育树中 ,来自不同地理分布的仲
彬草属物种各自聚为一支 ,揭示了物种的地理分化
特征。这与周永红等[ 14] 关于仲彬草属物种的
RAPD分析结果相吻合 。通过直接测序得到 ITS序
列系统发育树中 ,所有仲彬草属物种聚为一个大支 ,
不能很好地反映仲彬草属物种之间的亲缘关系 。结
合两种测序结果得到的系统发育树中 ,只有 3个物
种聚在一个分支中 ,其余 7个物种则分别聚在不同
的分支中。表明克隆测序与直接产物测序的结果存
在明显的差异 ,所获得的系统发育分析结果也不一
致 。综合前人关于仲彬草属物种的形态学 、地理分
布 、细胞学以及分子标记的研究结果表明 ,对于该属
植物的系统发育分析采用克隆测序的方法比直接产
物测序方法更为合理。
本研究表明 ,仲彬草属的10个种之间的 ITS序
列存在差异 ,特别是重复序列之间的变异引起的序
列差异 ,说明 ITS 序列能够提供较为丰富的信息位
点 ,适用于种间系统发育分析。由于克隆测序的
I TS序列之间也存在差异[ 26] ,所以在进行系统发育
分析时 ,需要对 PCR产物进行多个克隆测序 ,才能
反映出序列之间的真实的变异情况及其位点的多态
性 ,以获得能够真实反映物种间亲缘关系及其进化
的系统发育树。
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(本文审稿:魏育明)
374　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　四川农业大学学报　　　　　　　　　　　　　　　　　　第 24 卷