全 文 ： 藜科植物藜和灰绿藜实时荧光定量 PCR 内参基因的选择1
刘艳霞 1，兰欣欣 2，曹静 2，张晶华 2，兰海燕 2*
（新疆大学生命科学与技术学院/新疆生物资源基因工程重点实验室，乌鲁木齐 830046）
摘 要：选择合适的内参基因是实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）研究的关键。目前对藜科耐盐（盐生）植
物胁迫相关基因的表达分析中所用内参基因的报道较为有限。本研究利用 GeNorm、NormFinder、BestKeeper
三个内参基因分析软件对已选择过的 β-TUBULIN、β-ACTIN、GAPDH 三个常用候选内参基因进行了比较
分析，筛选出在 NaCl 和 PEG 胁迫下藜和灰绿藜中表达相对稳定的内参基因。GeNorm、NormFinder 内参
软件分析结果显示：在 NaCl 和 PEG 胁迫下，GAPDH 是藜和灰绿藜中均共同稳定表达的内参基因，同时
在藜和灰绿藜中也有各自表达较稳定的内参基因，β-ACTIN 在藜中稳定表达，β-TUBULIN 则在灰绿藜中稳
定表达。对相同科不同种的植物内参基因表达差异比较结果显示，内参基因在相同科中具有相同稳定表达
的内参；对相同胁迫下两种不同植物内参基因表达稳定性分析结果显示，内参基因的选择需根据实际的实
验材料和实验条件而定。基于三个分析软件对以上三个常用内参基因的分析结果，本实验初步确定了在藜
科植物藜和灰绿藜中相对稳定的内参基因，这为藜和灰绿藜胁迫相关基因的定量表达分析提供了参考依
据。
关键词：藜，灰绿藜，实时荧光定量 PCR，内参基因，胁迫
DOI：10.11931/guihaia.gxzw201601034
Screening of qRT-PCR reference genes for chenopodiaceae species
-Chenopodium album and C. glaucum
LIU Yan-Xia 1, LAN Xin-Xin 2, Cao Jing 2, Zhang Jing-Hua2, LAN Hai-Yan 2*
（ College of Life Science and Technology, Xinjiang University, Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering, Urumqi 830046,
China ）
Abstract: Selection of suitable reference gene is a critical step in real-time quantitative PCR (qRT-PCR) analysis.
So far, reports on reference gene screening on stress-tolerant gene expression of Chenopodiaceae species are
limited. In the present study, by using three reference-gene-analysis softwares-GeNorm, NormFinder, BestKeeper,
1收稿日期：2016-01-22 修回日期：2016-06-20
基金项目：国家自然科学基金(31060027; 31260037; 31460043)；新疆自治区优秀青年科技人才培养项目(2013721013)[Supported by the National Natural
Science Foundation of China (31060027; 31260037; 31460043)；Project for Training Young Talents of Xinjiang Uygur Autonomous Region (2013721013)]。
作者简介: 刘艳霞（1994-），女，甘肃武威市民勤县人，在读硕士研究生，研究方向：生物化学与分子生物学，Email:15292852327@163.com
*通信作者：兰海燕，博士，教授。研究方向：植物抗逆分子生物学。Email: lanhaiyan@xju.edu.cn
网络出版时间：2016-06-28 11:10:42
网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/45.1134.Q.20160628.1110.004.html
the stability of three commonly used candidate reference genes β-ACTIN, β-TUBULIN, and GAPDH of
Chenopodium album and Chenopodium glaucum under NaCl and PEG treatments were compared. The results
showed that, under NaCl and PEG stress, GAPDH showed stable both in C. album and C. glaucum. The results
also demonstated that the same reference genes expressed stable in the same family. β-ACTIN expressed stable in
C. album; while β-TUBULIN expressed stable in C. glaucum; This study also studied on the same family different
genus plants and the same stress of the stability of the expression of reference genes. The results suggest that same
reference gene expressed stable in same species. For the same stress in two species, results showed that selection
of the most stable reference gene depended on the experimental materials and the conditions. The analysis results
of the three candidate reference genes based on the three analysis software. In our study, we have determined the
ralatively stable reference genes in C. album and C. glaucum. Taken together, our results may provide reference
for further study in qRT-PCR analysis of stress-relevant gene expression in Chenopodiaceae species.
Key words: Chenopodium album, Chenopodium glaucum, quantitative real-time PCR (qRT-PCR), reference gene,
stress
实时荧光定量 PCR (quantitative real time RT-PCR，qRT-PCR) 是在传统聚合酶链式反应(polymerase
chain reaction, PCR) 基础上发展起来的一项新的核酸定量技术，该技术操作快速简便，具有特异性、高敏
感性、精确性等特点，在农学、微生物学、医学、食品安全检测，特别是分子生物学方面均有重要应用(陈
旭等，2010；王彦杰等，2012)。qPCR 和传统技术如免疫印迹方法具相似之处，但前者需要稳定的内参基
因校正样品总 RNA 的含量(Radonic et al，2004)。目前，常用的内参基因多为管家基因(house-keeping gene)，
如甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(GLYCERALDEHYDE-3-PHOSPHATE DEHYDROGENASE, GAPDH) (Zou et
al，2011 )、肌动蛋白基因(ACTIN, ACT) (Chen et al，2011)和微管蛋白基因(TUBULIN, TUB) (Zhou et al，
2011)、泛素基因(UBIQUITIN) (Parra et al，2011)、28S 核糖体 RNA 基因(18S rRNA)、18S 核糖体 RNA 基
因(18S rRNA) (Miao et al，2011)、亲环蛋白基因(CYP)、多聚泛素酶基因(UBQ)、转录延伸因子基因(EF-1α)
(Dheda et al，2004)等。由于这些管家基因参与生物体基本生命代谢活动，具组成型稳定表达的特性(Reid et
al，2006 )。大量研究报道显示，内参基因不存在通用性，随着物种及实验条件的改变，这些传统的保守基
因的表达并非总是稳定的，因此对内参基因的选择应根据具体实验条件和材料方法而定(Gao et al，2012)。
目前对 qPCR 中内参基因的稳定性的分析主要通过 GeNorm、NormFinder、BestKeeper 三个常用内参基因
分析软件进行稳定指数分析、ΔCt 值分析。Ct 也称循环阈值，表示在 PCR 循环过程中，每个反应管内的
荧光信号到达阈值时所对应的循环次数，ΔCt 值越小起始拷贝数越多(袁伟等，2012)。GeNorm 程序由
Vandesompele 等使用 EXCEL 编写的稳定性选择程序(Vandesompele et al，2002)；NormFinder 是 Andersen
等基于方差分析选择合适内参基因的软件(Andersen et al，2004)；BestKeeper 程序是 Pfaffl 等开发的基于对
管家基因和目标基因独立分析的基因表达稳定性软件(Pfaffl et al，2004)。
灰绿藜(Chenopodium glaucum )为藜科一年生草本盐生植物，能有效降低土壤含盐量，增加土壤有机质，
从而改善土壤性质(赵可夫等，1999)。藜(Chenopodium album L.)为藜科一年生耐盐草本植物，具有很强的
抗逆性并具有泌盐的盐囊泡结构(邓彦斌等，1998；周三等，2011)。藜科植物已成为植物耐盐性研究的优
良材料(段德玉等，2004)。目前关于藜科植物基因表达分析的内参基因选择的报道还很有限，基于此，本
实验以常用的三个内参基因β-ACTIN、β-TUBULIN、GAPDH对藜和灰绿藜两种藜科近源植物胁迫相关基因
表达的内参基因进行分析比较，基于GeNorm、NormFinder、BestKeeper三个内参基因分析软件选择稳定表
达的内参基因，并分析在相同胁迫下具有亲缘关系的同科不同种植物内参基因的表达变化，以及在不同胁
迫下同一种植物的内参基因表达稳定性的变化，从而为后续藜科植物基因表达研究提供参考。
1. 材料与方法
1.1 植物材料
选取成熟良好且完整的藜(C. album)或灰绿藜(C. glaucum)的种子播种于 25cm 直径并装有蛭石和珍珠
岩(3:1)基质的花盆中，于光周期 16 h 昼/8 h 夜，温度 23~25℃，光强为 150~2 00 µmol/m2/s 的环境中生长，
定期浇灌 1/2 Hoagland (pH 6.0)营养液(张薇等, 2015)。植株培养生长三个月后进行 NaCl 和 PEG 胁迫处理，
NaCl 浓度分别为 50、100、300 mmol/L，PEG 6000 浓度分别为 5%、10%、20%。藜和灰绿藜都经过 NaCl
5h，PEG 48h 的胁迫处理，胁迫处理后选取株型和长势一致的植株，取植株从上向下第 2-4 片幼嫩叶片，
立即置于液氮中，随后保存于-80℃冰箱备用。
1.2 实验方法
1.2.1 植物叶片总 RNA 提取和 cDNA 合成
利用 OMEGA 植物总 RNA 样品提取试剂盒（编号：R6827-02 产地：美国）说明书提取样品总 RNA，
琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 质量。取 1µL 总 RNA 按 TAKARA 公司的反转录 PCR 试剂提供的操作步骤进
行反转录获得 cDNA，保存于-80℃备用。
1.2.2 引物设计与内参基因的扩增
本实验选用三个常用内参基因-肌动蛋白基因(ACTIN)、微管蛋白基因(TUBULIN)和甘油醛-3-磷酸脱氢
酶基因(GAPDH)为目标，利用 DNAMAN 软件根据其他物种中三个基因的保守序列设计针对两种藜科植物
的引物(表 1)。三个内参基因的扩增反应条件均为：94 ℃预变性 5 min，94 ℃变性 30 s，60 ℃退火 30 s，
72 ℃延伸 30 s，34 个循环，72 ℃延伸 10 min。
表 1 实时荧光定量 PCR 检测中所用的三个内参基因的引物序列
Table 1 Primer sequences of three reference genes used in real-time RT-PCR analysis
基因名称 Gene name 正向引物序列 Forward primer (5’–3’) 反向引物序列 Reverse primer (5’–3’)
β-ACTIN 5’-AGCAACTGGGATGACATGGAGAAGATTTG-3’ 5’-ACACCATCACCAGAATCCAGCACAATACC-3’
GAPDH 5’-GTTTTCACTGACAAGGACAAGGCTGCTG-3’ 5’-GGTGGTACAACTGGCATTGGAGAC-3’
β-TUBULIN 5’-CCTTATTCCATTCCCCAGGCTTC-3’ 5’-CATCTGCTCATCAACCTCCTTTGTGC-3’
1.2.3 实时荧光定量 PCR 分析
利用 GeneAmp 7500 实时 PCR 系统及 SYBR Green (Qiagen)进行定量 PCR 分析，参照 Qiagen 公司荧
光定量试剂盒具体操作步骤，将藜和灰绿藜经过胁迫处理后的 cDNA 为模板，每处理四个生物学重复，每
重复两次技术重复，在 20 μL 体系中反应。具体的反应条件如下：预变性 95 2 min℃ ；95 5 s℃ ， 60 30 ℃
s，40 个循环。根据循环 Ct 值制作三种内参基因的标准曲线。
1.2.4 数据分析
通过琼脂糖凝胶电泳技术对总 RNA 质量和内参基因目的片段进行检测，且根据 PCR 循环过程中的
Ct(循环阈值)进行比较，荧光定量数据采用四次生物学重复和两次技术重复(共 6 个重复)计算平均值，Ct
值越小起始拷贝数越多(袁伟等，2012)；并通过三个内参软件 GeNorm、NormFinder、BestKeeper 对选取的
三个内参基因的稳定性进行分析，GeNorm 根据 M (平均表达稳定值)的大小进行稳定性比较，M 值越小稳
定性越好(Vandesompele et al，2002)；NormFinder 根据运算出内参基因 S（稳定值）分析内参基因表达稳
定性，S 值越小表示内参基因稳定性越好(Andersen et al，2004)。BestKeeper 是用于比较内参基因表达稳定
性和基因表达水平的软件，Geo mean(几何平均数)、SD(标准变异系数)越小稳定性越好(Pfaffl et al，2004)。
基于三个软件的分析比较从而筛选藜和灰绿藜在胁迫条件下最合适的内参基因组合。
2. 结果与分析
2.1 总 RNA 质量和内参基因目的片段扩增检测
琼脂糖凝胶电泳显示，藜和灰绿藜叶片不同处理的总 RNA 样品条带清晰，无明显降解，28S rRNA 与
18S rRNA 的亮度比值至少为 2:1 (图 1)。定量检测结果表明，各样品 A 260 /A 280 值均在 2.0 左右，由此
说明藜和灰绿藜植株叶片总 RNA 较完整且纯度较高，可进行后续实验。用胁迫下藜和灰绿藜叶片 cDNA
分别扩增三个内参基因 β-ACTIN、β-TUBULIN、GAPDH 的目的 DNA 片段，琼脂糖凝胶电泳分析显示三个
内参基因条带与预期大小一致，且均为单一目的条带(图 2)，表明各内参基因引物均具有较好的特异性，
可用于后续实时荧光定量 PCR 分析。
图 1 藜和灰绿藜总 RNA 琼脂糖凝胶电泳图
Fig 1 Agarose gel electrophoresis of total RNA extracted from C. album and C. glaucum
图 2 藜和灰绿藜中三个内参基因的 PCR 扩增产物
Fig 2 Agarose gel analysis of three candidate reference genes amplification in C. album and C. glaucum
注： 1. 肌动蛋白基因; 2. 甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因; 3. 微管蛋白基因; M. Marker
Note: 1. β-ACTIN ; 2. GAPDH; 3. β-TUBULIN ; M. Marker
2.2 实时荧光定量 PCR 分析
实时荧光定量 PCR 分析结果显示，内参基因的标准曲线线性相关系数为 R2 ≥ 0.999，引物的扩增效率
为 85.6%～92.1% (表 2)，以上数据均符合实时荧光定量 PCR 对扩增效率的要求。且各内参基因的熔解曲
线只有明显的单一信号峰，样品重复间的扩增重复性较高，阴性对照未检测到荧光信号，以上结果表明实
时荧光定量 PCR 反应中模板与引物结合较好，结果具较高的特异性。
表 2 藜和灰绿藜实时荧光定量 PCR 分析中三种内参基因的相关系数及扩增效率
Table 2 Parameters derived from qPCR analysis of 3 reference genes in C. album and C. glaucum
植物名称
Plant species
基因名称
Gene name
斜率 Slope
相关系数 Correlation
coefficient (R2)
扩增效率
PCR efficiency/%
藜 β-ACTIN -3 576 1 000 90 406
GAPDH -3.580 0.999 90.259
β-TUBULIN -3.718 0.999 85.758
灰绿藜 β-ACTIN -3.607 0.999 89.338
GAPDH -3.543 1.000 91.531
β-TUBULIN -3.528 0.999 92.079
注： A. β-ACTIN：肌动蛋白基因; B. β-TUBULIN：微管蛋白基因; C. GAPDH：甘油醛-3-磷酸-脱氢酶基因
Note: A. β-ACTIN; B. β-TUBULIN; C. GAPDH:(Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase)
2.3 内参基因的表达稳定性分析
通过 GeNorm、NormFinder、BestKeeper 三个内参分析软件对实时荧光定量 PCR 仪所得到的 Ct 值进
行内参基因稳定性分析。ΔCt 值是样品中各基因的循环阈值，ΔCt 值最小的基因表达稳定性越高(袁伟等，
2012)。图 3 所示的是藜和灰绿藜中不同内参基因的表达水平(Ct 值)。结果显示，藜的 β-ACTIN 的 Ct 值的
变化范围最小，Ct 值变化范围其次是 GAPDH，β-TUBULIN；在灰绿藜中 β-TUBULIN 的 Ct 值变化范围最
小，其次是GAPDH，β-ACTIN。由ΔCt值分析结果可知，在藜中 β-ACTIN表达较稳定，在灰绿藜中 β-TUBULIN
表达较稳定。
图 3 藜和灰绿藜中内参基因的表达水平（Ct 值）
Fig 3 Graphical representation of the expression level of the candidate reference genes in C. album and C.
glaucum
2.3.1 内参基因的 GeNorm 分析
GeNorm 软件通过比较 M 值确定最稳定内参基因，M 值越小表明稳定性越好。通过 GeNorm 软件分析
(图 4)，藜在 NaCl 胁迫下 β-TUBULIN、β-ACTIN、GAPDH 三个内参的平均 M 值依次为 0.726562、0.552129、
0.552129，表达稳定度由低到高排列顺序为 β-TUBULIN<β-ACTIN=GAPDH，β-ACTIN 和 GAPDH 两个内参
的表达均较稳定。在 PEG 胁迫下三个内参基因表达稳定度由低到高的顺序为
GAPDH<β-ACTIN=β-TUBULIN，其中 β-ACTIN 和 β-TUBULIN 两个内参的表达均较稳定。灰绿藜在 NaCl
胁迫下三个内参基因的表达稳定度由低到高顺序为 β-ACTIN<β-TUBULIN=GAPDH，其中 β-TUBULIN 和
GAPDH 两个内参的表达均较稳定。灰绿藜在 PEG 胁迫下三个内参基因的表达稳定度由低到高排列顺序为
β-ACTIN<β-TUBULIN=GAPDH，其中 β-TUBULIN 和 GAPDH 两个内参的表达均较稳定。由以上结果可知，
藜的 β-ACTIN 较稳定，β-TUBULIN 和 GAPDH 的稳定性较低；灰绿藜的 β-TUBULIN 和 GAPDH 的稳定性
最高，β-ACTIN 的稳定性最低。
图 4 GeNorm 软件分析候选内参基因稳定性
Fig. 4 The stability of candidate reference genes analyzed by GeNorm software
2.3.2 内参基因的 NormFinder 分析
NormFinder 软件利用方差分析法对内参基因的稳定性进行分析，所得值越小稳定性越好。与 GeNorm
软件的分析结果一致，在 NaCl 和 PEG 胁迫下，藜的最佳内参基因是 β-ACTIN；灰绿藜的最佳内参基因是
GAPDH。NormFinder 软件计算结果显示(表 3)，在 NaCl 胁迫下，三个内参基因在藜中表达稳定度由低到
高排列顺序为 GAPDH<β-TUBULIN<β-ACTIN, β-ACTIN 为最优内参基因。在 PEG 处理下，三个内参基因在
藜中的表达稳定度由低到高排列顺序为 GAPDH<β-TUBULIN<β-ACTIN, β-ACTIN 是最优内参基因。在 NaCl
胁迫下，三个内参基因在灰绿藜中的表达稳定度由低到高排列顺序为 β-ACTIN<β-TUBULIN
β-ACTIN<β-TUBULIN
Table 3 Stability of candidate reference genes analyzed by NormFinder software
植株处理 内参（S 值） 内参（S 值） 内参（S 值） 最稳定基因
藜（NaCl） β-ACTIN (0.086) β-TUBULIN (0.098) GAPDH(0.125) β-ACTIN
藜（PEG） β-ACTIN (0.055) β-TUBULIN (0.130) GAPDH (0.146) β-ACTIN
灰绿藜（NaCl） GAPDH (0.076) β-TUBULIN (0.087) β-ACTIN (0.089) GAPDH
灰绿藜（PEG） GAPDH (0.043) β-TUBULIN (0.050) β-ACTIN (0.084) GAPDH
注：A. S: 稳定值
Note: A. S: Stable value
2.3.3 内参基因的 Bestkeeper 分析
BestKeeper 软件可以对内参基因和目标基因进行单独分析，是用于分析不同的实验处理下内参基因参
数的软件，参数大小反应内参基因稳定性差异，值小的内参基因表达较稳定。BestKeeper 软件默认的 SD
值大于 1 时，说明该内参基因的稳定性较差。
如表 4 所示，对藜而言，在 NaCl 胁迫下内参基因 β-TUBULIN 的 SD 值为 0.48，Geo mean 为 18.16，
Min，Max 分别为 16.94，19.00，在三个内参基因中值最小，故 β-TUBULIN 为表达最稳定的内参基因。在
PEG 胁迫下内参基因 β-TUBULIN 的 SD 值为 0.32，Geo mean 为 19.32，Min，Max 值分别为 18.69，20.10，
在三个内参基因中值也最小，故在 PEG 处理下 β-TUBULIN 也是表达最稳定的内参基因。对灰绿藜而言，
在 NaCl 胁迫下内参基因 β-TUBULIN 的 SD 值为 0.29，Geo mean 为 16.17，Min，Max 值分别为 15.58，16.93，
在三个内参基因中值最小，因此 β-TUBULIN 为表达最稳定的内参基因。在 NaCl 胁迫下内参基因 β-ACTIN
的 SD 值为 0.61，Geo mean(几何平均数)为 21.43，Min，Max 值分别为 19.61，22.58，在三个内参基因中
值最小，因此 β-ACTIN 为表达最稳定的内参基因。
表 4 Bestkeeper 软件分析候选内参基因稳定性
Table 4 The stability of candidate reference genes analyzed by BeskKeeper software
处理 Treatement 参数 Parameter β-ACTIN GAPDH β-TUBULIN
最稳定基因
The most stable gene
藜 NaCl Geo Mean [Ct] 20.86 19.78 18.16 β-TUBULIN
Min. max [Ct] 19.89, 21.95 17.71, 21.50 16.94, 19.00
Std dev [±Ct] 0.64 0.76 0.48
Min. max[x-fold] -1.96, 2.12 -4.20, 3.29 -2.31, 1.39
Std dev [±x-fold] 1.55 1.70 1.39
藜 PEG Geo Mean [Ct] 20.79 19.45 19.32 β-TUBULIN
Min. max [Ct] 19.57, 21.51 17.86, 21.19 18.69, 20.10
Std dev [±Ct] 0.35 0.75 0.32
Min. max[x-fold] -2.33, 1.65 -3.01, 3.34 -1.55, 1.72
Std dev [±x-fold] 1.28 1.68 1.25
灰绿藜 NaCl Geo Mean [Ct] 21.52 18.45 16.17 β-TUBULIN
Min. max [Ct] 20.69, 22.28 17.77, 19.61 15.58, 16.93
Std dev [±Ct] 0.33 0.45 0.29
Min. max[x-fold] -1.77, 1.70 -1.60, 2.23 -1.51, 1.69
Std dev [±x-fold] 1.26 1.37 1.22
灰绿藜 PEG Geo Mean [Ct] 16.19 17.94 21.43 β-ACTIN
Min. max [Ct] 15.26, 16.96 16.33, 19.09 19.61, 22.58
Std dev [±Ct] 0.39 0.55 0.61
Min. max[x-fold] -1.90, 1.71 -3.05, 2.22 -3.52, 2.22
Std dev [±x-fold] 1.31 1.47 1.52
注：A. [Ct]: 循环数; B. Geo Mean: 几何平均数; C. Min, max[Ct]: 极端值[Ct]; D. Min, max [x-fold]: 表达水平的极端值; E. Std
dev[±Ct]: 标准变异系数[±Ct];
Note: A. Ct: cycle threshold; B. Geo Mean: geometric mean; C. Min, max [Ct]: extreme values of Ct; D. Min, max [x-fold], extreme
values of expression levels expressed as absolute x-fold over or under coefficient; E. Std dev [±Ct]: standard deviation [Ct];
3.讨论
实时荧光定量 PCR 技术具有特异性、准确性高、灵敏度高等特点，为了实验获得更好的结果，这项技
术必须要严格遵循相关的实验规范(Udvardi et al，2008；Bustin et al，2009)。内参基因的表达将随实验条
件的变化而变化(Czechowski et al，2005；Paolacci et al，2009；Nicot et al，2005)，且目的基因最终计算结
果需要用内参基因进行校正，所以针对不同的实验条件分析和筛选稳定的内参基因很重要。在筛选相关内
参基因时可首先参考前人研究的报道，若无相关内参基因信息，应选择常用的且稳定表达的内参基因再进
行后续实验(魏毅东等，2013)。本实验选用 β-TUBULIN、β-ACTIN、GAPDH 三个常用内参基因对藜科两种
近源种藜和灰绿藜在盐和 PEG 胁迫下的表达稳定性进行分析，结果显示，GAPDH 在藜和灰绿藜中均稳定
表达，说明属于同种的植物具有相似性，在内参的稳定性表达上有相同的情况，然而相同的内参基因在同
一种植物中表达不一定相同，即 β-ACTIN 在藜中表达较稳定，β-TUBULIN 则在灰绿藜中表达较稳定。大
量研究指出，GAPDH 及 β-ACTIN 作为内参基因被广泛应用(孙美莲等，2010；Lovdal & Lillo，2009)。理
想的内参基因表达稳定性不随光周期、温度等外界环境的变化而改变，内参基因在所有细胞中均可稳定表
达(Paolacci et al， 2009)。已有研究表明，在不同的组织器官和生理状态下均稳定表达的内参基因是不存
在的，内参基因的稳定性具有相对性，相同的生理条件下不同内参基因的表达量通常不同，一种实验条件
下表现稳定的内参基因在另一种条件下表达可能是不稳定的(Nicot et al，2005)。Bustin et al (2009)证明在实
验中使用不稳定的内参会影响实验结果的可靠性。因此，在利用实时荧光定量 PCR 进行基因表达分析时，
为了得到更可靠的实验结果，在实验过程中需要根据研究对象和实验条件选择合适的内参基因(Ohl et al，
2005)。
GeNorm、NormFinder、BestKeeper 是基于统计学的三个内参分析软件。GeNorm 内参软件是
Vandesompele 等发明对内参基因稳定性进行分析的软件。通过软件运算出基因表达稳定性的 M 值分析内
参基因表达稳定性，M 值越小稳定性越好。GeNorm 软件还可确定在不同生理条件下最适的内参基因数目
具有可靠的表达分析结果(Vandesompele et al，2002)。NormFinder 内参软件是 Andersen 等发明的基于方差
分析判断在不同条件下内参基因表达稳定性的程序，NormFinder 运算出内参基因的表达稳定值，按稳定值
的大小排序，值越小稳定性越好，进而选择出最稳定表达的内参基因(Andersen et al，2004)。BestKeeper
内参软件是 Pfaffl 等开发的用于比较内参基因表达稳定性和基因表达水平的软件，Ct 值标准偏差和变异系
数越小稳定性越好(Pfaffl et al，2004)。
本实验选用 GeNorm、NormFinder、BestKeeper 三个常用内参分析软件对 ΔCt（qRT-PCR 过程中循环
数）、M（平均表达稳定性值）、S（稳定值）、Geo mean（几何平均数）、SD（标准变异系数）等数值
对内参基因的稳定性进行分析。GeNorm 软件对三个内参基因分析显示：藜在 NaCl 和 PEG 胁迫处理下
β-ACTIN 和 GAPDH 是表达较稳定的内参基因，灰绿藜相对表达稳定的内参基因是 β-TUBULIN 和 GAPDH，
NormFinder 的计算结果和 GeNorm 一致。BestKeeper 内参软件的分析结果显示：β-TUBULIN 在经过 NaCl
和 PEG 胁迫的藜中和 NaCl 处理下的灰绿藜中是表达较稳定的内参基因，β-ACTIN 为 PEG 胁迫下灰绿藜中
表达稳定的基因。BestKeeper 和 NormFinder、GeNorm 软件分析结果不完全一致。ΔCt 值是样品中各基因
的循环阈值，ΔCt 值最小的基因表达稳定性越高，通过对 2 个内参基因的 ΔCt（RT-PCR 过程中循环数）值
比较可助筛选表达最稳定的管家内参基因(胡瑞波等，2009)。通过对ΔCt进行分析，结果显示在藜中 β-ACTIN
内参基因的 Ct 值变化范围最小，其次是 GAPDH，β-TUBULIN 的 Ct 值最小；在灰绿藜中 β-TUBULIN 的
Ct 值变化范围最小，与 NormFinder、GeNorm 软件分析一致。
三个内参软件对三个内参基因进行分析时，GeNorm 和 NormFinder 分析的结果完全一致，而 BestKeeper
在藜的内参基因分析时结果和 GeNorm 和 NormFinder 分析结果部分不一致，造成这种差异的根本原因可
能是软件的统计学原理不同造成的(Hu et al，2009)。在前人已经报道的的大多数文章均已使用 GeNorm 和
NormFinder 内参软件进行内参稳定性分析并获得合适的内参基因(Kim S & Kim T，2003；Savli et al，2003；
Aandersen et al，2004；Hong et al，2008；陈孝仁等，2013)。在本实验中，通过 GeNorm、NormFinder 两
个内参软件以及对实时荧光定量 PCR 的 Ct值进行分析显示：没有一个固定的基因在任何条件下均稳定表
达。本文由 NormFinder 和 GeNorm 软件分析结果得出一致结论：藜中 β-ACTIN 在 NaCl 和 PEG 胁迫下均
稳定表达；在灰绿藜中 NaCl 和 PEG 胁迫下 β-TUBULIN 均稳定表达，而 GAPDH 是两种藜科植株中共同稳
定表达的内参基因。由此暗示，相同科不同种的植物在内参基因表达上有共性也有差异。在相同胁迫下的
内参基因表达稳定性是随机的，内参基因的表达稳定性与胁迫条件无关，因此内参的选择还要根据实验材
料和实验条件进行选择(Warrington et al，2000；Suzuki et al，2000)。
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