全 文 ：12种夹竹桃科植物的 RAPD分析
黄久香1 ,张寿洲2 ,庄雪影1 ,李秉滔1
(1.华南农业大学林学院 ,广东 广州 510642;2.深圳仙湖植物园 ,广东 深圳 518000)
摘要:从 80个随机扩增多态性 DNA(RAPD)随机引物中筛选出 22 个谱带清晰且重复性好的引物用于 PCR扩增 , 探讨夹
竹桃科(Apocynaceae)10 属 12种植物的遗传关系。获得 162 个位点用于计算 Nei s 遗传相似性系数 , 并应用 NTSYS 程序
UPGMA法构建了系统发育树。黄蝉(Allamanda schottii Pohl.)与软枝黄蝉(A.cathartica L.)、红鸡蛋花(Plumeria rubra
L.)与鸡蛋花(P.rubra L.`Acutifolia )之间的遗传相似性最高;在遗传相似性系数 0.73 处将 12 种植物划分为 10 个属 ,并
在 0.58 处分为 3 支 ,但并不完全支持 3 个独立的亚科。 RAPD分析结果与形态学的分析结果基本一致 ,可为夹竹桃科系统
分类学提供分子生物学的证据。
关键词:夹竹桃科;随机扩增多态性 DNA(RAPD);系统发育
中图分类号:Q941　　　文献标识码:A　　　文章编号:1002-7351(2007)03-0014-05
RAPD analysis of twelve species of Apocynaceae
HUANG Jiu-xiang1 , ZHANG Shou-zhou2 , ZHUANG Xue-ying1 , LI Bing-tao1
(1.South China Agricultural University , Guangzhou , Guangdong 510642 , China;
2.Xianhu Botanical Garden , Shenzhen , Guangdong 518000 , China)
Abstract:Twelv e species , belonging to 10 genera o f Apocynaceae , were analyzed by random amplified polymo rphic DNA(RAPD)
markers.162 loci genera ted by 22 clear and repeated and polymo rphic primers , which screened from 80 primers.A close relation
w as found bo th between Allamanda schottii Pohl.and A.cathartica L.and between Plumeria rubra L.and P .rubra L.`A-
cutifolia .The UPGMA dendrog ram , w hich based on Nei s similarity coefficients and constructed by NTSYS programs , w as con-
sistent w ith that of classical classification.Ten genera were distinguished at the similarity coefficients of 0.73 , and 3 branches were
distinct at 0.58 while no t complete v est in 3 substantive subfamily.Consequently , RAPD is a useful technique in the phy logene tic
analysis of Apocynaceae.
Key words:Apocynaceae;RAPD;phylogenetics
　　分子标记已被广泛应用于植物系统发育研究 ,其中随机扩增多态性(RAPD:Random Amplified Ploy-
morphic DNA)标记因价格低廉 、简便快捷 ,是研究生物遗传多样性和亲缘关系的重要方法之一[ 1 ,2] 。
RAPD标记在系统学上的应用 ,早期有着不同的看法 ,主要集中在位点的可重复性和同源性上 ,经国内外
科学工作者验证 ,认为严格标准化实验条件 ,其重复性是可以完全保证的 ,而且近缘种共迁移位点多是同
源的[ 3 , 4] 。近年来 ,杨瑞武等[ 5]利用 RAPD技术评价了鹅观草属(Roegneria)、披碱草属(Elymus)、猬草属
(Hystrix)和仲彬草属(Kengyil ia)植物的属间关系及其系统学意义;汪小全等[ 6]对升麻属(Cim ici fuga)、
类叶升麻属(Actaea)和乌头属(Aconi tum)进行了属间遗传分类 ,结果与经典分类的研究结果相吻合;De-
meke 等[ 7]研究了芸苔属(Brassica)6个种及其与萝卜属(Raphanus)和欧白兰芥属(Sinapis)之间的系统
关系 ,主成分分析的结果与经典分类结果一致;Fritsch 等[ 8]在 Datisca 、Helianthus 、Y uucca 3个属中进行
RAPD扩增 ,结果显示 3个属具有较高的相似性;Chalmers 等[ 9]分析了楝科(Meliaceae)4个属 8个种之间
的遗传变异程度 ,结果与现行的分类学观点一致;邓白罗等[ 10]对山茶属红山茶组 29种植物亲缘关系进行
了研究 ,得到满意结果和效果;这些表明 ,RAPD标记不仅可以用于植物种内遗传分析 ,也可用于种间及至
属间的分类学研究。
　收稿日期:2006-12-06
　基金项目:华南农业大学博士启动基金(4400-K05023)
　作者简介:黄久香(1975-), 女 ,湖南绥宁人 , 华南农业大学讲师 ,博士 , 从事林学教学和科研工作。
　通讯作者:李秉滔(1936-), 男 ,华南农业大学教授 , 从事植物经典分类研究。
第 34 卷 第 3 期
2 0 0 7 年 9 月
福 建 林 业 科 技
Jour of Fujian Forestry Sci and Tech
Vol.34　No.3
Sep., 2 0 0 7
　　夹竹桃科是热带植物区系主要植物成分 ,由于该科植物代表了独特的进化类群及其重要的经济价值 ,
该科的系统地位和科内属间关系的研究一直是植物系统学家的研究热点[ 11] 。分子系统学研究方面 , En-
dress等[ 12-14]和 Potgieter[ 15]等分别测定了该科部分代表属代表种的叶绿体 rbcL 、matK 和 trnL 基因内区
与 trnL-F 间隔区序列 ,Liede[ 16]分析了 Astephaninae 亚族的叶绿体基因 trnT-L 、trnL-F 及 trnL 间隔区序
列 ,并构建了各自的系统树 ,为一些有争议的属的界限划分 、系统位置的确定提供了叶绿体分子生物学证
据 ,但核基因的分子系统学研究目前还未见报道。
我国是夹竹桃科植物种类较多的国家之一 ,有 44 ～ 46属 ,145 ～ 176种 ,主要分布于长江以南各省区
及台湾省等沿海岛屿 ,少数分布于北部及西北部[ 17] 。中国夹竹桃科植物的系统学研究具有重要的意义 ,
但我国这方面的研究主要集中在花部结构 、花粉形态和叶表皮等方面[ 18] ,以及少数种类的化学分类[ 19] ,
且 Endress &Bruyns[ 14]在发表广义夹竹桃科的新系统时缺乏对亚洲夹竹桃科植物尤其是中国种类的研
究 ,目前还未见中国夹竹桃科植物分子生物学研究报道 。本研究采用 RAPD技术对中国常见的 10属 12
种夹竹桃科植物进行分析 ,以期为进一步开展该科植物系统学和遗传多样性研究提供信息资料和参考依
据。
1　材料与方法
1.1　材料来源
从华南农业大学校园内采集海芒果(Cerbera manghas L.)、黄花夹竹桃(Thevet ia eruviana K.
Schum.)、红鸡蛋花(Plumeria rubra L.)、鸡蛋花(P.rubra L.` Acutifolia )、蕊木(Kopsia arborea Blume)、
倒吊笔(Wright ia pubescers R.Brown)、狗牙花(Tabernaemontana divaricata (L.)R.Brown ex Roemer
&Schultes)、夹竹桃(Nerium oleander L.)、黄蝉(Allamanda schot tii Pohl.)、软枝黄蝉(A.cathartica
L.)、羊角拗(S trophanthus divaricatus Hook.et Arn.)、长春花(Catharanthus roseus (L.)G.Don)等 12
种夹竹桃科植物材料 ,每种植物采集 5个个体 ,凭证标本存于华南农业大学林学院植物标本馆(CANT)。
1.2　植物 DNA提取
取约 0.25 g 新鲜叶片 ,在液氮中迅速研磨成粉末 ,装入 1.5 m l的 eppendorf管中 ,加入已预热到65 ℃
的 800 μL 2×CTAB溶液(含 15μL 10%(W/V)PVP 和 5μL β -巯基乙醇),充分混匀 ,在 65℃水浴 30 ～
60 min;冷却至室温后 ,加入等体积氯仿(V)∶异戊醇(V)=24∶1有机溶剂 ,摇动 10 min ,11 000 r·min-1离
心10 min ,取上清液转入新 eppendorf管中 ,重复有机溶剂混匀至取上清液步骤 1次;取上清液加 2倍体积
的无水乙醇 ,轻轻混匀 , -20℃静置 30 min , 8 000 r·min-1离心 5 min ,去上清液 ,加 70%的乙醇洗 5 ～ 10
min两次 ,去上清 ,自然晾干;沉淀用 200 μL TE溶解 。DNA浓度用琼脂糖比色法与标准浓度的λDNA 比
较确定。
1.3　引物筛选
对购自上海生物技术工程公司的 80个 RAPD引物进行筛选 ,将 22个扩增产物分离效果和重复性良
好的引物(表 1)用作 PCR实验。
表 1　引物及其序列
引物 序列(5 -3 ) 引物 序列(5 -3 ) 引物 序列(5 -3 )
S82 GGCACTGAGG S127 CCGATATCCC S161 ACCTGGACAC
S85 CTGAGACGGA S129 CCAAGCTTCC S164 CCGCCTAGTC
S86 G TGCCTAACC S135 CCAGTACTCC S166 AAGGCGGCAG
S89 CTGACG TCAC S140 GGTCTAGAGG S167 CAGCGACAAG
S91 TGCCCGTCGT S147 AGA TGCAGCC S169 TGGAGAGCAG
S104 GGAAGTCGCC S157 CTACTGCCGT S170 ACAACGCGAG
S112 ACGCGCATG T S159 ACGGCGTATG
S126 GGGAATTCGG S160 AACGGTGACC
·15·第 3 期 黄久香 , 等:12种夹竹桃科植物的 RAPD分析
1.4　DNA 扩增
扩增反应在Eppendorf梯度PCR扩增仪上进行 。反应体积20μL ,包括2μL(20 ～ 150 ng)DNA模板 ,
PCR缓冲液 2.0μL(含 1.5 mmol·L-1Mg2+),引物 0.75 μL(4 pmol), TaqE 0.2 μL(1U), dNTPs 2.0 μL
(dN TP 各为0.1μmol),灭菌的双蒸水13.05μL。扩增条件:94℃预变性 3 min;94℃变性35 s ,36℃复性 1
min ,72℃延伸 2 min ,45个循环;72 ℃延伸 7 min 。每次扩增均设置不含 DNA模板的空白对照 。RAPD
产物经 1.5 %琼脂糖凝胶电泳(加溴化乙锭至 0.5 μg·mL-1)分离 ,最后在紫外灯下用凝胶成像系统拍照
记录 。
1.5　结果记录和数据分析
以 100 bp的 Marker作为分子量标准 ,明确无误的位点记为“1”并估测分子量大小 ,模糊位点和无位
点记为“0” ,在所有位点 1/0数据矩阵基础上 ,用 Popgene[ 20]分析软件算出各种间的 Nei氏遗传相似性系
数矩阵 ,在遗传相似性系数的基础上 , 采用非加权配对算术平均法(UPGMA , unweighted pair group
method with arithmetic mean),N TSYS程序[ 21]绘出各种亲缘关系聚类图 。
2　结果与分析
2.1　遗传多样性结果与分析
22个引物共扩增出 162条谱带(图 1),平均每个引物扩增 7.4条谱带 ,其中 22条为共有谱带 ,140条
谱带表现出多态性(86.4%),反映了该科植物具有较明显的遗传差异 。
图 1　由引物 S147 , S82 扩增生产的 RAPD带型
(M:100 bp Marker;1 海芒果;2 黄花夹竹桃;3 鸡蛋花;4 红鸡蛋花;5 蕊木;6 倒吊笔;7 狗牙花;8 夹竹
桃;9 黄蝉;10 软枝黄蝉;11 羊角拗;12 长春花;13 对照)
2.2　UPGMA聚类结果与分析
Nei氏遗传相似性系数表明 ,同属或同族的种类亲缘关系较近。鸡蛋花属鸡蛋花的原变种(Plumeria
rubra)具红色花冠 ,其变种(P.rubra L.`Acutifolia )具白色花冠 , RAPD分析结果显示它们之间具有较高
的遗传相似性 ,遗传相似性系数达 0.814;同样 ,同处一个属的黄蝉与软枝黄蝉也有 0.740的遗传相似性
系数;黄花夹竹桃(黄花夹竹桃属)与长春花(长春花属)之间的遗传相似性系数最小 ,为 0.414(表 2)。
UPGMA 聚类树系图显示:夹竹桃族的夹竹桃和羊角拗在相似系数 0.675处聚为一支;萝芙木族的海
芒果与黄花夹竹桃在相似系数 0.650处聚在一起;在遗传相似性系数 0.73处 12种植物区分到属 ,并在遗
传相似性系数 0.58处 ,10个属分为 3大分支 ,同属鸡蛋花亚科的萝芙木族(海芒果和黄花夹竹桃)与黄蝉
族(黄蝉与软枝黄蝉)聚在一起成为一支;鸡蛋花族的鸡蛋花及其变种与萝芙木族的蕊木先相聚 ,然后与鸡
蛋花族的长春花聚为另一支鸡蛋花亚科分支;夹竹桃族的夹竹桃和羊角拗 ,与倒吊笔族的倒吊笔和狗牙花
·16· 福 建 林 业 科 技 第 34 卷
族的狗牙花组成夹竹桃亚科分支(图 2)。
表 2　任意 2 种植物间的 Nei氏遗传相似性系数
物种号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
1 1
2 0.650 1
3 0.500 0.468 1
4 0.509 0.477 0.814 1
5 0.596 0.549 0.614 0.636 1
6 0.464 0.506 0.530 0.552 0.581 1
7 0.512 0.443 0.553 0.527 0.636 0.651 1
8 0.497 0.450 0.503 0.500 0.485 0.591 0.589 1
9 0.570 0.582 0.494 0.491 0.557 0.470 0.553 0.564 1
10 0.617 0.584 0.462 0.447 0.503 0.533 0.497 0.554 0.740 1
11 0.458 0.447 0.512 0.422 0.518 0.600 0.634 0.675 0.488 0.527 1
12 0.440 0.414 0.611 0.610 0.515 0.523 0.573 0.493 0.459 0.513 0.503 1
＊:数字代表物种同图 1。
图 2　基于 Nei氏遗传相似性系数的 UPGMA树系图
3　讨论
海芒果(属)与黄花夹竹桃(属)均属萝芙木族 ,
它们具有互生叶和核果 ,雄蕊着生在花冠筒的喉部 ,
花药卵圆形 ,雄蕊与柱头分离 ,种子无毛等 ,在夹竹
桃科都是比较原始的形态特征 ,因此 ,在传统形态分
类学中认为这 2个属有着共同的起源 ,处在同一演
化水平[ 22] 。本研究 RAPD聚类结果同样反映了这
2种植物具有较高的遗传相似性 , 在相似性系数
0.650处聚在一起(图 2),反映了其较近的亲缘关
系。
海芒果与黄花夹竹桃所在的萝芙木族与黄蝉属
所在的黄蝉族在传统形态分类学上具有并列的系统
地位 ,它们是鸡蛋花亚科中关系密切的 2个族 ,除了
它们在花部形态上具有以上共同特征外 ,黄蝉族植物具单心皮子房和蒴果 ,比萝芙木族 2个心皮子房和核
果在形态上较进化[ 22] 。本研究 RAPD研究分析也表明海芒果 、黄花夹竹桃和黄婵之间的遗传相似程度较
高(表 2),海芒果和黄花夹竹桃首先聚在一起 ,然后和黄婵所在的分支相聚(图 2)。
在传统形态分类学中 ,夹竹桃和羊角拗均隶属于夹竹桃族 , 2种植物的雄蕊均为箭头状 ,着生在花冠
筒的基部 ,雄蕊与柱头连生或靠合 ,果实均为 果 ,种子具长种毛 ,这些特点都基本反映了夹竹桃科中较
进化的形态特征[ 22] 。本研究 RAPD分析结果也显示这 2个种之间具有较高的相似性系数(0.675 ,表 2),
首先聚在一起(图 2)。
对于夹竹桃科内亚科的划分 ,不同学者具有不同观点 ,但随着时间推移 ,研究手段的不断进步和资料
的积累丰富 ,人们认知科学逐渐深入 ,多数学者认为本科应该分为鸡蛋花亚科和夹竹桃亚科 2个亚科[ 18] 。
从遗传相似性系数的 UPGMA 聚类树系图可以看到 ,鸡蛋花族和萝芙木族内的不同属相互交错 ,族内属
间的关系并不十分紧密 ,与其他研究结果类似[ 18] ;同时可以看到 ,在遗传相似性系数 0.58处 ,10个属分
为 3大分支 ,鸡蛋花亚科占了 2支 ,海芒果为亲近地进入其中一分支 ,但狗牙花族却进入夹竹桃亚科分支
(图 2),与李红和何平的形态学数量分析认为狗牙花族应进入鸡蛋花亚科不同[ 18] ,这也许跟本研究取材
有限有关 ,需要扩大物种选取 ,做进一步的分析。
·17·第 3 期 黄久香 , 等:12种夹竹桃科植物的 RAPD分析
因此 ,本研究结果反映出 RAPD标记可以区分夹竹桃科种内等级(鸡蛋花和红鸡蛋花)、种间等级(黄
蝉和软枝黄蝉)乃至近缘属间(海芒果属 、黄花夹竹桃属和黄蝉属之间;夹竹桃属和羊角拗属之间)植物在
遗传相似性方面不同程度的相似性/差异性 ,可以为进一步开展该科植物系统学和遗传多样性研究提供信
息资料和参考依据。
＊:本文实验在深圳仙湖植物园分子生物学实验室进行 ,文章写作中得到中科院华南植物园李忠超先生大力帮助 , 在
此表示衷心的感谢!
参考文献:
[ 1] So ltis PS , Soltis DE , Doyle JJ.Molecular systematics of plants[ M].New York:Chapman &Hall , 1992.
[ 2] Williams JG K , Kubelik A R , Livak K J.DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as g enetic markers[ J]
.Nucleic Acids Research , 1990 , 18:6531-6535.
[ 3] Tho rmann CE , Fer reira ME , Camargo LEA , et al.Comparison of RFLP and RAPD markers to estimating genetic relation-
ships within and among cruciferous species[ J].Theoretical and Applied Genetics , 1994 , 88:973-980.
[ 4] 邹喻萍 , 葛　颂 ,王小东.系统与进化植物学中的分子标记[ M].北京:科学出版社 , 2001:49 , 263-266.
[ 5] 杨瑞武 ,周永红 , 郑有良 ,等.利用 RAPD 分析披碱草属 、鹅观草属和猬狎草属模式种的亲缘关系[ J] .西北植物学报 ,
2001 , 21(5):865-871.
[ 6] 汪小全 , 邹喻苹 ,张大明 , 等.RAPD应用于遗传多样性和系统学研究中的问题[ J] .植物学报 , 1996 , 38(12):954-962.
[ 7] Demeke T , Adams RP , Chibbar R.Potential taxonomic use random amplified polymorphic DNA(RAPD):A case study in Bras-
sica[ J] .Theoretical and Applied Genetics , 1992 , 84:990-994.
[ 8] Fritsch P , Hauson M A , Spore C D , et al.Constancy of RAPD primer amplification strength among distantly rela ted tax a of
flowering plants[ J] .P lant Molecular Biology Reporter , 1993 , 11:10-20.
[ 9] Chalmers K J , Newton A C , Waugh R, et al.Evaluation of the extent of g enetic variation in mahoganies(Meliaceae)using
RAPD markers[ J].Theoretical and Applied Genetics , 1994 , 89:504-508.
[ 10]邓白罗 ,谭晓风 , 漆龙霖 ,等.山茶属红山茶组植物的 RAPD分析及分类研究[ J] .林业科学 , 2006 , 42(5):36-41.
[ 11]李秉滔 ,陈锡沐.中英文版《中国植物志(夹竹桃科)》的比较[ J].广西植物 , 1997 , 17(4):299-305.
[ 12] Endress ME , Sennblad B , Nilsson S , et al.A phylogenetic analysis of Apocynaceae s.str.and some related tax a in Gen-
tianales:A multidisciplinary approach[ J] .Opera Botanical Belgica , 1996 , 7:59-102.
[ 13] Endress ME , Bruyns P.A revised classifica tion of the Apocynaceae[ J] .Botanical Review , (Lancaster), 2000 , 66:1-56.
[ 14] Endress M E , Stevens WD.The renaissance of the Apocynaceae s.l.:Recent advances in systemations , phylogeny and evolu-
tio n[ J].Annals of the Missouri Bo tanical Garden , 2001 , 88:517-522.
[ 15] Potgieter K , Alber t VA.Phy logenetic relationships within Apocynaceae s.l.based on trnL inton and trnL-F spacer sequences
and propagule characters[ J] .Annals o f the M issouri Bo tanical Garden , 2001 , 88:523-549.
[ 16] Liede S.Subtribe Astephaninae(Apocynaceae-Asclepiadoieae)reconsidered:New evidence based on cpDra- and interspe-
cific phy logeny of w ild Fagopyrum (Polygonaceae)species based on nucleo tide sequences of nucleotide regions in chlo roplast
DNA[ J].American Journal o f Botany , 2001 , 87:573-582.
[ 17] Li P T , Leeuw enberg A J M , Middleton D J.Flo ra of China , Vol.16[ M].Beijing:Science Press , 1995:143-188.
[ 18]李　红 ,何　平.中国夹竹桃科属间关系的形态学数量评价[ J] .西南师范大学学报 , 1996 , 21(6):590-599.
[ 19]邱声祥 , 李德铢.鹅绒藤属及其近缘属的化学分类──兼论 Vincetocium 的恢复问题[ J] .云南植物研究 , 1989 , 11
(1):41-50.
[ 20] Yeh FC , Yang RC , Boy le T.POPGENE.microsoft w indows- based freeware fo r population genetic analysis.release 1.31
[ M] .Edmonton:University of Alberta , 1999.
[ 21] Rohlf F J.NTSYS-pc numerical tax onomy and multivariate analysis system , Version 2.02[ M].New Yo rk:Exeter Publica-
tio ns Setauket , 1998.
[ 22]李秉滔.中国夹竹桃目的形态演化趋势及其进化系统[ J].广西植物 , 1982 , 2(4):165-170.
·18· 福 建 林 业 科 技 第 34 卷