全 文 ：收稿日期:2003-06-30
基金项目:国家转基因植物研究与产业化专项资助项目(J2002-B-008)
作者简介:霍秀文(1968-),女 ,呼和浩特人 ,副教授 ,在读博士 ,主要从事牧草生物技术研究工作 ,云锦凤和米福贵为通讯作者。
冰草属植物组织培养再生体系的建立
霍秀文1 , 2 ,魏建华3 ,张　辉2 ,米福贵2 ,云锦凤2
(1.内蒙古农业大学 农学院 ,内蒙古 呼和浩特　010018;2.内蒙古农业大学 生态环境学院 ,内蒙古 呼和浩特　010018;
3.北京市农业生物技术研究中心 ,北京　100089)
　　摘要:以适宜西北地区种植的优质牧草冰草属(Agropyron Gaer tn)中的三个不同种———蒙古冰草新品系(A.
mongolicum Keng)、航道冰草(A.cristatum cv.Fairway)、诺丹冰草(A.desertorum cv.Nordan)和一个种间杂种冰草
———蒙农杂种冰草(A .cristatum × A .desertorum cv.Mengnong)为材料 ,分别以幼穗为外植体建立了冰草组织培养
再生体系。诱导愈伤组织的培养基为改良 MS+2 , 4-D 2.0 mg/ L ,分化培养基为 MS(无附加成分),在 1/ 2MS 培养基
上生根后得到完整小植株。结果表明在本试验条件下 , 不同长度的幼穗在培养时 , 其愈伤组织发生的部位及其增殖
速度不同;4 种材料愈伤组织诱导率和分化率无明显差异 , 均可有效诱导愈伤组织并分化成再生植株 , 再生植株的产
生主要通过直接器官发生途径。
关键词:冰草;幼穗培养;植株再生
中图分类号:S543　　文献标识码:A　　文章编号:1000-7091(2004)01-0017-04
Study of Plant Regeneration in Wheatgrass(Agropyron Gaertn)
HUO Xiu-wen1 , 2 ,WEI Jian-hua3 , ZHANG-Hui2 ,MI Fu-gui2 ,YUN Jin-feng2
(1.College of Ag ronomy , Inner Mongolia Agriculture University ,Hohhot　010018 ,China;
2.College of Ecology and Enviroment , Inner Mongolia Ag ricultural University ,Hohho t　010018 ,China;
3.Beijing Center of Ag ro-Bio technology ,Beijing　100089 ,China)
Abstract:Plant regeneration f rom immature inf lorescence through direct callus induction was investigated in
the case of dif ferent species of w heatgrass(Agropyron Gaertn -A .mongolicum Keng , A .cristatum cv.Fair-
way , A .desertorum cv.Nordan.)and one of a hybrid w heatgrass(A.cristatum × A .desertorum cv.
Mengnong).Explants w ere directly cultured on advanced MS solid medium w ith 2.0 mg/ L 2 ,4-D to induce calli
w hich were then transferred to hormone free MS medium for callus differentiat ion and 1/2MS medium fo r root-
ing.There w ere apparent dif ferences in response of callus induction and proliferat ion to immature inflorescence
ranging in different leng ths.The result showed no obvious differences in callus ini tiation f requency and plant re-
generation frequency among four materials.The plant regeneration occurred mainly by means of direct organo-
genesis.
Key words:Wheatg rass(Agropyron Gaertn);Immature inf lorescence culture;Plants regeneration
　　冰草属(Agropyron Gaertn)植物为禾本科牧
草 ,国外 20世纪 80年代开始有组织培养再生植株
的研究报道[ 1] 。冰草为寿命较长的多年生疏丛牧
草 ,广泛分布于干旱 、半干旱草原和荒漠草原 ,抗逆
性较强 ,春季返青早 ,秋季枯黄晚 ,茎叶柔嫩 ,营养丰
富 ,适口性好 ,是西北干旱半干旱地区改良草场以及
建立人工草地和生态建设的重要禾本科牧草之一。
同时 ,冰草属作为重要的小麦野生近缘属之一 ,除作
为优质牧草而受到牧草学家的高度重视外 ,还具有
许多可用于小麦改良的优异性状 。近年来人们通过
华北农学报·2004 , 19(1):17-20
胚拯救 、幼穗培养等方法获得了普通小麦与冰草属
间杂种及其自交和回交后代[ 2 , 3] ,并创建了小麦 -
冰草异源附加系 ,提供了在小麦遗传背景下开发利
用外源基因的首要条件[ 4] 。
为加快冰草种质改良进程 ,培育更为优良的冰
草品种 ,我们在多年冰草种质资源搜集与育种的基
础上 ,探索冰草组织培养再生植株体系研究。本试
验以冰草属(Agropyron Gaertn)中的 3 个不同种
———蒙古冰草新品系(A .mongolicum Keng)、扁穗
冰草品种航道(A .cristatum cv.Fairway)、沙生冰草
品种诺丹(A .desertorum cv.Nordan)及扁穗冰草与
沙生冰草种间杂交种蒙农杂种冰草(A .cristatum
× A .desertorum cv.Mengnong)为材料 ,建立了冰
草组织培养再生植株体系 ,为冰草基因工程研究奠
定基础。
1　材料和方法
1.1　材料
本试验选用的 4份冰草材料蒙古冰草新品系 、
航道冰草 、诺丹冰草 、蒙农杂种冰草均取自于内蒙古
农业大学牧草种质资源圃 ,生长周期为 2 ～ 5年。诱
导愈伤组织的外植体来自植株孕穗期[ 5]幼穗 ,下部
浸入附加赤霉素(GA)2 mg/ L 的少量液体 MS 培养
基中 ,4 ℃培养3 ～ 5 d后剥离包裹的叶鞘 ,75%酒精
消毒 30 s ,再用 0.1%HgCl2消毒 2 ～ 4 min ,无菌水
冲洗数次。切成 2 ～ 3 mm小段 ,接种在愈伤组织诱
导培养基中进行培养。
1.2　方法
幼穗诱导愈伤组织所用的基本培养基为改良
MS 固体培养基[ 6] :大量元素 NH4NO3(956 mg/L),
KH2PO4(1 160 mg/L),MgSO4·7H2O(370 mg/ L),
CaCl2·2H2O(96 mg/L);有机元素肌醇(0.1 g/ L),
VB1(2 mg/L),烟酸(1 mg/L),VB6(0.5 mg/L),甘
氨酸(2 mg/L),常规 MS 铁盐和微量元素 ,附加蔗
糖 3%(W/V), 0.7%琼脂(W/V), pH=5.8 。诱导
愈伤组织时 ,将外植体接种在改良 MS培养基+2.0
mg/L 2 , 4-D上 ,在 24 ～ 26 ℃下置于 24 h 黑暗培
养 。7 d后观察愈伤组织的诱导情况 , 21 d后将形
成的致密愈伤组织块转移到分化培养基 ,即常规
MS 培养基(无附加成分)上 ,置于 24 ～ 26 ℃下 24 h
光照 ,21 d后分化产生再生植株。将分化的小苗在
相同培养基上继代壮苗后转入 1/2MS(无附加成
分)生根 ,7 d后生根形成完整小植株。
2　结果与分析
2.1　幼穗大小对诱导愈伤组织和植株再生的影响
幼穗大小对诱导愈伤组织和植株再生的影响 4
种材料表现类似 ,以蒙农杂种冰草为例 ,在接种的蒙
农杂种冰草的幼穗中 ,不同长度的幼穗在愈伤组织
诱导频率和分化频率上表现明显不同(表 1)。
表 1　蒙农杂种冰草幼穗的愈伤组织诱导及分化结果
穗长(cm) 诱导频率(%) 愈伤组织产生部位 产生类胚状体(%) 愈伤组织分化情况叶芽(%)丛生芽(%)根(%) 绿苗频率(%)
<1.0 20 所有部位 0 8 2 0 8
1.0～ 2.0 83 所有部位 5 ～ 10 46 12 10 51
2.0～ 3.0 91 所有部位 5 ～ 10 52 43 10 59
>3.0 62 穗轴和颖基部 5 32 18 5 23
　　接种 14 d后 ,长度小于 1.0 cm 的幼穗外植体
多数失色变白未产生愈伤组织 ,仅有 20%的外植体
产生白色或淡黄色愈伤组织 。在 1.0 ～ 2.0 cm 及
2.0 ～ 3.0 cm 长的幼穗中 ,幼穗的各部位均可诱导
出白色致密的愈伤组织(图 1-B),诱导率分别为
83%和 91%,这些愈伤组织的生长速度较快。大于
3.0 cm 的幼穗 ,从穗轴和颖的基部同样可诱导出白
色致密愈伤组织 ,诱导率为 62%。
转入分化培养基后 ,长度小于 1.0 cm的幼穗所
产生的愈伤组织分化绿色芽点的速度很慢 ,多数愈
伤组织保持白色或淡黄色 ,21 ～ 28 d 后 ,约 8%的愈
伤组织分化出芽 。
长度为 1.0 ～ 2.0 cm 和 2.0 ～ 3.0 cm 的幼穗产
生的愈伤组织转入分化培养基后 ,分化速度较快 ,约
14 d后即可分化出芽 ,其愈伤组织的分化分为 3种
情况 。第 1 种为先分化芽(图 1-D),两种幼穗中的
比例分别为 46%和 52%。这些愈伤组织块由白色
变为淡黄色 ,接着有绿色芽点出现并发育为不定芽
进而产生叶状芽;第 2 种情况为愈伤组织先分化出
气生根进而形成根 ,然后再分化芽(图 1-C)。这种
愈伤组织较少 ,分别仅占 10%;第 3 种愈伤组织则
分化为淡黄色米粒状的胚性愈伤组织(图 1-H)。这
些愈伤组织易分散为小颗粒 ,每一小颗粒都可分化
芽和根并形成完整小植株(图 1-I , J),其比例在两种
18　 华　北　农　学　报 19卷
小穗中各占约 5%～ 10%。
A.大小不同的幼穗外植体;B.诱导愈伤组织;C.诱导愈伤组织分化(先分化根);D.诱导愈伤组织分化(先分化芽);
E.分化类小穗;F.分化颖片和稃片;G.愈伤组织分化的再生植株;H.胚性愈伤组织;I.胚性愈伤组织分化丛生芽;
J.胚性愈伤组织分化再生植株
图 1　蒙农杂种冰草诱导愈伤组织和分化的再生植株
　　大于 3.0 cm 长的幼穗诱导的愈伤组织从穗轴
和颖的基部分化形成颖片和稃片(图 1-F),这些颖
片和稃片存活一段时间后死亡;另一部分分化出类
小穗(图 1-E);还有约 5%的愈伤组织可分化出胚性
愈伤组织 。
从幼穗诱导的愈伤组织分化芽的情况看 ,再生
植株一部分是通过直接器官发生途径[ 2] ,而另一部
分是通过类胚状体发生途径。据王大元指出[ 7] , 2 ,
4-D的作用主要是产生一种胚性愈伤组织 ,在诱导
愈伤组织后除去 2 , 4-D 或降低 2 , 4-D的浓度 ,这种
胚性愈伤组织才能进一步发育成完整的成熟胚结
构 ,并进而形成完整小植株 。本试验中诱导愈伤组
织的培养基为改良 MS +2 , 4-D 2.0 mg/L ,分化培
养基为 MS(无附加成分),与上述论点相符。
表 1表明 ,不同大小的幼穗均可有效诱导出愈
伤组织 ,但诱导率与分化能力有显著差异。穗长小
于 1.0 cm 时 ,愈伤组织诱导率低(20%),这可能是
由于 75%酒精消毒时小穗易脱水造成小穗分生组
织活力降低所导致 ,且其分化率也较低(8%)。穗长
为 1.0 ～ 2.0 cm 和 2.0 ～ 3.0 cm 愈伤组织的诱导率
分别达 83%和 91%,绿苗分化频率也较高 ,达 51%
和 59%。大于 3.0 cm 出愈率为 66%,但其分化率
降低为 23%。以上结果得出 ,冰草幼穗培养宜取
1.0 ～ 3.0 cm 穗长的幼穗。
2.2　冰草不同材料的植株再生
分别取蒙古冰草新品系 、航道冰草 、诺丹冰草 、
蒙农杂种冰草的幼穗(穗长为 1.0 ～ 3.0 cm),接种
后统计出愈率和分化频率(图 2)。各材料间的愈伤
组织诱导率分别为蒙古冰草新品系 57.5%、航道冰
草 69.6%、诺丹冰草 64.3%、蒙农杂种冰草73.2%。
愈伤组织分化频率分别为蒙古冰草新品系 49.0%、
航道冰草 54.3%、诺丹冰草 52.1%、蒙农杂种冰草
57.6%,各材料间出愈率和分化频率差别不明显。
蒙古冰草新品系的愈伤组织诱导率相对略低 ,推测
是由于其发育时期与其他品种不同 ,因而取材偏晚
造成 。综合愈伤组织诱导率与分化率两项指标 ,可
初步认为本试验条件下 , 4种冰草材料间植株再生
能力的差异不明显 ,均可以幼穗为外植体诱导愈伤
组织和再生植株。
图 2　不同品种的植株再生
3　讨论
禾本科牧草的组织培养再生相对较难 ,主要是
适用的外植体较单一 ,如幼胚 、幼穗 、花药 、原生质
体 ,悬浮细胞[ 1 ,3 ,6 ,8 ～ 10]等 ,这些外植体或取材困难 ,
或受季节限制不能周年供应 。近年来研究者们探索
了以盾片 、胚轴[ 11] 等为外植体诱导再生植株的途
径 ,但植株再生频率低 ,还需进一步优化完善离体培
养条件 。本研究探讨了以幼穗为外植体建立冰草的
组织培养再生体系 ,在愈伤组织诱导过程中 ,不同长
度的幼穗产生愈伤组织的部位不同 ,小于 1.0 cm的
幼穗虽然不受穗轴和小花器官的限制均能诱导出愈
伤组织 ,但其形成的愈伤组织增殖缓慢 ,转入分化培
养基后大部分愈伤组织衰亡 ,只有极少数可分化出
1期 霍秀文等:冰草属植物组织培养再生体系的建立 19　
芽。对 1.0 ～ 3.0 cm 幼穗培养时 ,由穗轴和颖基部
及其他各部位均可产生愈伤组织 ,且增殖速度快 ,分
化出芽的频率高 。一般穗长与发育时期有一定的相
关性 ,小于 1.0 cm 的幼穗一般处于单棱期到二棱末
期 ,而 1.0 ～ 3.0 cm 幼穗通常为护颖原基形成期到
小花原基形成期。这种幼穗的发育时期不同 ,形成
愈伤组织的部位和分化能力之间的差异 ,很可能与
不同发育时期各种器官内细胞的内源激素及细胞的
全能性有关 。因此 ,在幼穗培养中选择适当的发育
期对获得良好的培养结果是重要的 ,而护颖原基形
成期和小花原基形成期是合适的培养时期[ 2] 。
一般根据植株外部形态可判断幼穗的发育时
期 ,但不同条件下 ,外部形态的判断标准不同 。不同
品种的孕穗时期不同 ,如蒙古冰草新品系与蒙农杂
种冰草的孕穗期形态指标大不相同 ,大小相同的幼
穗 ,剥开后蒙古冰草新品系的发育程度要早于蒙农
杂种冰草;同一品种不同生态环境下的孕穗时期不
同 ,如蒙农杂种冰草大田中孕穗期的形态指标为旗
叶展开 ,距下部第一叶约 1.0 ～ 2.0 cm 时 ,剥出的幼
穗也为 1.0 ～ 2.0 cm;而日光温室中如剥出的幼穗
为 1.0 ～ 2.0 cm 时其形态指标为挑旗;其他如水肥
条件 、生育周期等都对形态指标有影响 ,取材时需具
体情况具体分析 ,不能一概而论。
本研究中 ,我们以幼穗大小为取材标准 。在冰
草幼穗发育的孕穗期 ,剥开的幼穗介于 1.0 ～ 3.0
cm为宜 ,大于 3.0 cm 幼穗诱导的愈伤组织在分化
时其颖片和稃片易先分化形成叶芽甚至类小穗而非
丛生芽 ,小于 1.0 cm 的幼穗在消毒时易受影响失去
活力 。
本研究中再生植株的产生主要是通过直接器官
发生途径(图 1-B ～ G),也有约 5%～ 10%的愈伤
组织产生胚性愈伤组织并直接分化芽和根 ,形成再
生小植株(图 1-H ～ J)。我们发现外植体较大的幼
穗(大于 1.0 cm)才可诱导出类胚状体的愈伤组织 ,
而小于 1.0 cm 的幼穗则无此现象 。其中的原因有
待进一步研究。
多数植物种的不同基因型表现出显著的组织培
养再生能力的差异 ,而我们所选取的冰草属 3 个种
和 1个种间杂交种的愈伤组织诱导率及植株再生频
率的差异不明显。其中仅蒙古冰草新品系的愈伤诱
导率较低 ,推测可能与其所取幼穗发育时期不同有
关 。根据实验结果 ,我们初步得出冰草的组织培养
再生不存在基因依赖性 。
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