全 文 ：菊属野生种 、栽培菊花及种间杂种的 RAPD分析
李辛雷 , 陈发棣＊
(南京农业大学园艺学院 , 江苏 南京 210095)
摘要:以菊属野生种 、 栽培菊花及种间杂种为试材 , 采用 RAPD 方法研究其亲缘关系。从 40 条随机引物中筛选出 15
条 , 对 23 份试材进行扩增 , 共产生 153 条带 , 平均每条引物扩增出 10.2条带 , 多态性条带占 77.1%。通过遗传相似性
矩阵及 UPGMA 聚类分析 , 结合杂交结实性与幼胚拯救成苗率 , 认为:父母本亲缘关系近的遗传距离较小 , 杂交亲和性
好 , 结实率较高 , 幼胚拯救易成功;反之杂交亲和性差 , 难以结实 , 幼胚拯救成苗率低。 根据以上数据结合前人研究结
果 , 对栽培菊花的起源演化进行了探讨。
关键词:菊属;RAPD;亲缘关系;杂交亲和性;幼胚拯救
中图分类号:S682.1+1 文献标识码:A 文章编号:1000 2030 (2004)03 0029 05
RAPD analysis of wild species , cult ivars and interspecific
hybrids in Dendranthema
LI Xin-lei , CHEN Fa-di＊
(College of Horticulture , Nanjing Ag ricultural University , Nanjing 210095 , China)
Abstract:The relationship of 23 w ild species , cultivars and interspecific hybrids in Dendranthema w as studied by RAPD analy-
sis.15 random primers were screened to detect polymorphism among the total ma terials used.Of the 153 bands produced ,
77.1% were polymorphic.Each primer amplified an average o f 10.2 bands.The results from pairwise similarity and UPGMA
cluster analy sis , combining with the fecundity o f hybridization and rate of plantlet of embryo rescue, suggested that w hen parents
have closer relationship , the genetic distance was closer , the compatibility of hybridization w as better , fecundity was higher and
embryo rescue w as easier.When parents have fur ther relationship , the results w ere contrary.According to the RAPD analysis
and previous research , the origin and evolution of Dendranthema morifolium w as discussed.
Key words:Dendranthema;RAPD;phy logeny;compatibility of hybridization;embryo rescue
菊属 (Dendranthema)植物远缘杂交在相同倍性物种之间及四倍体与六倍体之间均较容易 , 而倍
数性差异较大的二倍体与四倍体及二倍体与六倍体间杂交均难以实现[ 1] 。利用幼胚拯救技术可以克服
菊属种间杂交障碍 , 获得杂种[ 2] 。但由于不同的遗传机制及生殖器官结构上的差异 , 不同基因型亲本
的杂交组合幼胚拯救的成功率差异较大。Rangan认为植物的基因型很大程度上影响胚拯救的成功率 ,
即使在亲缘关系较近的栽培品种上差异亦较大[ 3] 。杂交父母本的亲缘关系 、 遗传距离与杂交亲和性可
能存在一定关系 。菊属植物系统进化及栽培菊花起源研究表明:菊属的系统演化是一个从低倍到高倍异
源多倍体化的过程;四倍体和六倍体栽培菊花 (D.mori fol ium)极可能直接从野生的四倍体野菊
(D.indicum)或六倍体毛华菊 (D.vestitum)演化而来[ 4 , 5] ;毛华菊和野菊与栽培菊花亲缘关系最近 ,
小红菊 (D.chaneti i)与栽培菊花亲缘关系亦较近[ 6] 。本研究以菊属野生种 、 栽培菊花及种间杂种为材
料 , 用 RAPD技术研究菊属植物亲缘关系 , 遗传距离与远缘杂交亲和性关系 , 同时对供试菊属植物起
源演化进行了探讨 , 以期为菊属植物幼胚拯救及遗传育种提供一定的理论指导 。
收稿日期:2003 11 28
基金项目:江苏省基础计划青年创新人才基金项目 (BK2002417);江苏省教育厅高技术产业化项目 (JH02 086);江苏省科技攻
关项目 (BE2001354);江苏省高技术研究项目 (BG2003305)
作者简介:李辛雷 (1978 ), 硕士研究生。＊通讯作者 Corresponding auther:陈发棣 (1970 ), 博士 , 教授 , 主要从事花卉遗传育
种研究。 Tel:025 84395231
南京农业大学学报 2004 , 27 (3):29 ～ 33
Journal of Nanjing Agricultural University
1 材料和方法
1.1 材料
供试材料为二倍体野生种甘菊 、 菊花脑 、宜色菊 , 四倍体野菊 , 同源四倍体菊花脑 , 六倍体小红
菊 , 六倍体毛华菊 , 六倍体紫花野菊 , 栽培菊花品种 (六倍体及其非整倍体)及种间杂种 (表 1), 其
中滁菊 、 杭白菊为药用菊 , 白霞 、 黄英 、彩霞为单瓣菊花品种 , 紫勋章 、 紫玉芙蓉为复瓣菊花品种。所
有材料均由南京农业大学菊花种质资源保存中心提供 。
表 1 供试材料及其编号
Table 1 Mater ials and their codes
编号 Codes 材料 Materials 编号 Codes 材料 Materials
1 宜色菊 D.dichrum 13 紫玉芙蓉 Ziyufurong (D.mori folium)
2 甘菊 D.lavandu li f i lium 14 黄英 Huangying (D.mor ifolium)
3 菊花脑 D.nankingense 15 杭白菊 Hangbaiju (D.mori fol ium)
4 河南野菊 He′nanyeju (D.indicum) 16 彩霞 Caixia (D.mor i folium)
5 白霞 Baixia (D.mor ifolium) 17 宜色菊×紫玉芙蓉 D.dichrum×Ziyufurong
6 毛华菊 D.vest itum 18 菊花脑×黄英 D.nankingense×Huangying
7 紫花野菊 D.zawadski i 19 菊花脑×河南野菊 D.nankingense×He′nanyeju
8 南京野菊 Nanjingyeju (D.indicum) 20 黄英×菊花脑 Huangying×D.nankingense
9 小红菊 D.chanet ii 21 甘菊×宜色菊 D.lavan dul i f ilium ×D.dichrum
10 菊花脑 (4)D.nankingense (2n=4x=36) 22 紫勋章×宜色菊 Zixunzhang×D.d ichrum
11 滁菊 Chuju (D.mori folium) 23 黄英×甘菊 Huangying×D.lavandu li f il ium
12 紫勋章 Zixunzhang (D.mor i folium)
1.2 方法
1.2.1 远缘杂交与幼胚拯救 配置不同菊属植物杂交组合 , 母本均进行人工去雄并套袋隔离 , 父本在
舌状花微开时套袋 , 于 9:00至 10:00或 15:00至 16:00授粉 , 同一花序重复授粉 2次 。留取部分
杂交花序 , 待植株干枯后收取种子 , 统计杂交结实率 (所得种子数/杂交花序数)。取杂交授粉后 13 ～
18 d子房 , 以75%酒精表面消毒30 s后置于 0.1%的HgCl2溶液中灭菌 5 min , 无菌水冲洗4 ～ 5次后接
种于 MS +K T 2.0 mg·L-1+IAA 2.0 mg·L-1培养基 。一个月后转入MS +BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.1
mg·L-1培养基中继代培养 , 子房萌发得到的幼苗转入 MS +NAA 0.1 mg·L-1培养基中生根 , 炼苗后
定植于田间。培养温度 20 ～ 25 ℃, 每日光照 10 ～ 12 h , 光照度 1 600 ～ 2 000 lx 。统计幼胚拯救成苗率
(成苗率=成苗个体/接种子房数×100%)。
1.2.2 DNA 提取及 RAPD 扩增反应 取杂交亲本及部分杂种不同单株上新鲜嫩叶用液氮混合磨样 。
样品 DNA提取参照 SDS法[ 7] 。RAPD随机引物 (10 bp的寡核苷酸随机引物)、 dN TP 、 Taq DNA聚合
酶 、琼脂糖 (Spanish进口 , 分装)均购自南京生通生物技术有限责任公司。PCR扩增反应采用 20 μL
反应体系:2 mmol·L-1 MgCl2 、 10×buf fer 2.5μL 、 0.2 mmol·L-1 dN TP 、 1 mmol·L-1引物 、 1 U Taq
E 、 模板 DNA 15 ng 、 ddH2O 。PCR仪为 PTC 0100 , 反应程序参照戴思兰等[ 7]方法并作适当调整:93
℃预变性 3 min;93 ℃1 min , 36 ℃1 min , 72 ℃2 min , 循环40次;72 ℃延伸10 min。反应产物 4 ℃
保存备用 。1.5%的琼脂糖凝胶 (含 0.5 μg·mL -1 EB)电泳分离 , 在紫外成像系统上观察并拍照。
1.2.3 数据分析 对照反应产物在凝胶上的位置记录反应产物分子量 , 以 “0” 和 “1” 分别表示无带
和有带 , 统计各位点条带 , 得到原始数据。应用 Jaccard 公式 (J ij =a/ (a+b), a 为 2个种共同拥有
的条带数 , b为仅在 1个种中出现的条带数总和)计算各试材间的相似系数 , 遗传距离为 D =1-J ij ,
使用 UPGMA法进行聚类分析[ 8] 。
2 结果与分析
2.1 RAPD扩增结果
以杂交亲本宜色菊 、 甘菊 、菊花脑 、河南野菊 、 毛华菊 、 黄英 、紫玉芙蓉 、紫勋章 、滁菊等 9份试
材为对象 , 用 40个 10 bp的寡核苷酸随机引物进行扩增 , 从中筛选出 15条带型清楚 、 多态性较好的引
物 (A-01 , A-02 , A-04 , B-04 , C-01 , I-18 , J-05 , L-12 , P-09 , P-16 , P-17 , S-03 , U-19 , W-03 , X-
03), 对 23份供试材料进行 RAPD扩增。23份材料共产生 153条扩增带 , 多态性带 118条 , 多态性达
·30· 南 京 农 业 大 学 学 报 第 27 卷
7 7.1 %;1 5条引物中 , S-03扩增出的条带最多(14条), A-01的最少(7条), 平均每条引物扩增出
10.2条条带 , 其中引物 J-05的扩增带
见图 1。对野生种 、 栽培菊花及菊属种
间杂种的扩增带分别进行统计 , 9个野
生种的扩增条带总数为 145条 , 平均每
种 16.1 条 , 其 中 多 态 性 条 带 占
68.8%;7个栽培菊花品种共产生 146
条带 , 平均每品种 20.9 条 , 其中多态
性条带占 61.9%;7个菊属种间杂种的
扩增条带总数为 149 条 , 平均每种
21.3条 , 其中多态性条带占 57.1%。
从野生种到栽培菊花 、 再到种间杂种 ,
呈现扩增条带逐渐增多 , 多态性逐渐降
低的趋势 。
2.2 遗传相似性分析
图 1 23份供试材料经引物 J-05扩增得到的 RAPD图谱
Fig.1 RAPD patterns of 23 materials amplified with the primer J-05 re-
spectively
(1 23.Codes of materials are the same as in Table 1 , the same as follow s.)
菊属野生种 、栽培菊花及种间杂种的遗传相似性系数见表 2。陈发棣等[ 4]认为:菊属的系统演化是
一个从低倍到高倍异源多倍体化的过程 。菊属 9个野生种中 3个二倍体野生种宜色菊 、 甘菊及菊花脑倍
性较低 , 系较原始种;河南野菊与 3个二倍体野生种的平均遗传相似性系数为 0.779 , 明显高于其他野
生种 , 也较为原始;其次为南京野菊 (0.738), 小红菊 (0.733)和毛华菊 (0.697);紫花野菊与 3 个
二倍体野生种的遗传相似性最低 (0.585), 亲缘关系最远 , 四倍体菊花脑 (0.688)介于中间 。7 个栽
培菊花中 , 2个药用菊滁菊和杭白菊与 3个野生种的平均遗传相似性系数分别为 0.785和 0.763;单瓣
品种黄英与 3个二倍体野生种的遗传相似性最高 (0.734), 复瓣品种紫勋章与 3个野生种的遗传相似性
最低 (0.546), 其次为紫玉芙蓉 (0.637), 基本上随瓣性增强 , 平均遗传相似性系数降低 , 品种较为进
化。7个种间杂种与 3个二倍体野生种的遗传相似系数介于栽培菊花之间 , 且与宜色菊遗传相似性较
高 , 亲缘关系较近 (0.727), 其次为甘菊 (0.696), 亲缘关系最远的为菊花脑 (0.635)。
表 2 不同试材间的基因型相似性系数矩阵
Table 2 Pairwise simi larity of 23 materials
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
1 1.000
2 0.8831.000
3 0.7970.8261.000
4 0.7800.7940.7621.000
5 0.7500.7210.6610.7141.000
6 0.6960.7320.6590.7400.7501.000
7 0.5980.5910.5660.6200.6550.5321.000
8 0.7540.7260.7340.8020.7020.7000.6241.000
9 0.7660.7390.6950.8020.7290.7540.6240.7861.000
10 0.7010.6980.6640.6900.6720.6830.5750.7190.7891.000
11 0.8030.8030.7460.7980.7270.7520.6000.8110.8530.8151.000
12 0.5540.5560.5290.5850.5780.5470.5380.5520.5770.6070.5791.000
13 0.6690.6380.6030.6430.6240.5700.5910.6460.6590.6810.6470.5401.000
14 0.7500.7480.7050.7040.7120.7100.5730.7820.7690.7020.7790.4810.6561.000
15 0.8250.7720.6910.7150.7370.7480.5980.7930.8200.7670.8570.5540.6820.8421.000
16 0.7410.7390.6950.7070.7420.7130.5860.7460.7460.7050.7450.5650.6590.7690.8061.000
17 0.7030.6620.6410.6670.6490.7260.5190.6940.7330.7040.7310.5330.5800.6670.7030.7201.000
18 0.7220.7070.6290.7010.7090.7200.5480.7270.7910.6740.7380.4810.6420.8130.7970.7910.7261.000
19 0.6880.6590.6270.6640.6850.6560.6180.6970.6790.6620.6550.4960.6670.6880.7250.7160.6520.7351.000
20 0.7660.7270.6590.6960.6910.6760.5560.7210.6970.7070.7570.4890.6370.7430.7660.7210.7590.7900.7691.000
21 0.7340.7070.6520.6880.7220.6450.5710.7270.6900.6620.7130.4930.6300.7610.7710.7780.6760.7700.7740.8161.000
22 0.7250.7100.6190.7290.6620.6470.5490.7170.7050.6770.7160.4920.6070.7140.7010.7300.7560.7870.6880.8070.7481.000
23 0.7020.6990.6180.6540.6370.6470.5230.6690.6810.6150.6810.4770.6180.7280.7020.7190.7050.7760.6760.7700.7250.8081.000
·31·第 3 期 李辛雷等:菊属野生种 、 栽培菊花及种间杂种的 RAPD分析
2.3 聚类结果分析
通过聚类分析 , 以 10 为阈值 , 将
23份材料分为 7组:A 组包含 3 个二
倍体野生种宜色菊 、 甘菊和菊花脑;B
组中 2个瓣性较低的栽培菊花黄英 、彩
霞及菊花脑与栽培菊花黄英的杂种聚在
一起 , 河南野菊与南京野菊聚在一起 ,
2个药用菊滁菊 、 杭白菊先聚类再与小
红菊 、四倍体菊花脑聚在一起;C 组为
野生种毛华菊和栽培菊花白霞;7个菊
属种间杂种除菊花脑与栽培菊花黄英的
杂种外均聚在一起 (D组);另外紫花
野菊与 2 个瓣性较高的菊花品种紫勋
章 、 紫玉芙蓉单独成组。
2.4 遗传距离与杂交亲和性分析
不同杂交组合的结实率 、 幼胚拯救
成苗率及杂交亲本之间的遗传距离 (根
据遗传相似性分析)见表 3。二倍体野
生种甘菊与宜色菊 、 黄英 、彩霞和南京
图 2 23份菊属试材的 RAPD聚类分析树状图
Fig.2 The cluster dendrogram of RAPD in 23 materials
野菊的遗传距离分别为 0.117 、 0.252 、 0.261和 0.274 , 除与宜色菊组合得到种子外 (结实率 5.4), 其
余组合均未成功;杂交后进行胚拯救 , 甘菊与宜色菊 、黄英组合的成苗率分别为 17.0%和 1.0%, 而与
彩霞 、 南京野菊组合的成苗率为 0。毛华菊与白霞 、 河南野菊 、甘菊的遗传距离分别为 0.250 、 0.260
和 0.268 , 其杂交结实率分别为 1.8 、 0.5 和 0 。二倍体菊花脑与宜色菊 、 滁菊的遗传距离为 0.203 和
0.254 , 杂交结实率为 1.5和 0 , 幼胚拯救的成苗率为 2.9%和 1.8%;将菊花脑加倍为四倍体后 , 它与
宜色菊的遗传距离从 0.203变为 0.299 , 杂交及幼胚拯救没有得到种子及幼苗 , 而与滁菊的遗传距离从
0.254变为 0.185 , 杂交得到种子 (结实率 0.8)。可见随遗传距离增大 , 杂交结实率及幼胚拯救成苗率
降低 , 遗传距离较远时 , 远缘杂交不易结实 , 幼胚拯救难以成功。以菊花脑为母本进行远缘杂交与幼胚
拯救时 , 除个别情况外 (如菊花脑与宜色菊 、甘菊组合的成苗率偏低), 随遗传距离变大 , 杂交结实率
与幼胚拯救成苗率降低的趋势也很明显 。
表 3 遗传距离与杂交亲和性分析
Table 3 Analysis of genetic distance and compatibility of hybridization
杂交组合 (♀×♂)
Cross combinat ion
遗传距离
Genet ic distance
结实率
Seed rate
成苗率/ %
Plantlet rate
杂交组合 (♀×♂)
Cross combination
遗传距离
Genetic distance
结实率
S eed rate
成苗率/ %
Plan tlet rate
甘菊×宜色菊 0.117 5.4 17.0 菊花脑×河南野菊 0.238 0.0 6.7
甘菊×黄英 0.252 0.0 1.0 菊花脑×滁菊 0.254 0.0 1.8
黄英×甘菊 0.252 0.0 0.4 滁菊×菊花脑 0.254 0.0 0.0
甘菊×彩霞 0.261 0.0 0.0 菊花脑×南京野菊 0.266 0.0 0.0
甘菊×南京野菊 0.274 0.0 0.0 菊花脑×黄英 0.295 0.0 1.3
毛华菊×白霞 0.250 1.8 8.3 黄英×菊花脑 0.295 0.0 0.7
河南野菊×毛华菊 0.260 0.5 菊花脑×杭白菊 0.309 0.0 0.0
毛华菊×甘菊 0.268 0.0 1.2 黄英×南京野菊 0.218 2.8 24.4
菊花脑×宜色菊 0.203 1.5 2.9 黄英×小红菊 0.231 2.5 16.1
菊花脑 (4)×宜色菊 0.299 0.0 0.0 黄英×毛华菊 0.290 2.0 7.2
菊花脑 (4)×滁菊 0.185 0.8 黄英×河南野菊 0.296 1.5 2.3
菊花脑×甘菊 0.174 1.2 0.6 黄英×宜色菊 0.250 0.0 0.4
注:(1)杂交亲本的拉丁名见表 1。 Latin name of paren ts see Table 1.
(2)结实率为每个花序所得种子数。S eed rate i s seeds per inflorescence.
菊花脑与滁菊 、 黄英及甘菊与黄英等组合在以二倍体野生种作母本时成苗率分别为 1.8%、 1.3%
和 1.0%, 而反交时分别为 0 、 0.7%和 0.4%。二倍体野生种作父本与栽培菊花杂交 , 幼胚拯救成苗率
·32· 南 京 农 业 大 学 学 报 第 27 卷
明显降低。黄英与南京野菊 、 小红菊 、 毛华菊和河南野菊的遗传距离分别为 0.218 、 0.231 、 0.290 和
0.296 , 其杂交结实率分别为 2.8 、 2.5 、 2.0和 1.5 , 幼胚拯救的成苗率分别为 24.4%、 16.1%、 7.2%
和 2.3%;而黄英与菊花脑 、甘菊 、 宜色菊的遗传距离分别为 0.295 、 0.252和 0.250 , 但杂交没有得到
种子 , 幼胚拯救的成苗率亦较低 , 分别为 0.7%、 0.4%和 0.4%;菊花脑与宜色菊组合的幼胚拯救成苗
率 (2.9%)低于菊花脑与河南野菊 (6.7%), 高于菊花脑与甘菊 (0.6%)。说明除遗传距离外 , 不同
杂交父本的花粉管生长情况亦有可能影响杂交结实率及幼胚拯救成苗率 , 花粉管太短或生长缓慢难以到
达母本胚囊时 , 杂交难以结实 , 幼胚拯救成功率较低 。
3 讨 论
二倍体野生种与栽培菊花 (六倍体及其非整倍体)杂交 , 二倍体野生种作父本时 , 幼胚拯救的成苗
率明显降低 。Watanabe亦报道二倍体野生种作父本与多倍体杂交 , 幼胚拯救难以成功[ 2] ;Kaneko[ 9]和
Shimo tomai[ 10]认为二倍体野生种作父本与多倍体杂交 , 由于花粉管太短难以到达多倍体的胚囊 , 导致
远缘杂交失败。本研究在以黄英为母本 , 二倍体野生种菊花脑 、甘菊和宜色菊分别作父本 , 及菊花脑作
母本 , 宜色菊和甘菊分别作父本进行远缘杂交与幼胚拯救时 , 遗传相似性虽较高 , 亲缘关系较近 , 但幼
胚拯救的成苗率反而较低 , 说明不同二倍体野生种花粉管生长能力存在较大差异 。通过诱导同源多倍
体 , 缩短遗传距离 , 可以提高菊属种间杂交及幼胚拯救的成功率。
菊花脑与南京野菊均原产南京 , 分布在相同的地理区域 , 但无论是远缘杂交后幼胚拯救的成苗率还
是遗传相似性分析 , 均说明菊花脑与河南野菊的亲缘关系比南京野菊近 , 杂交亲和性好 , 是何原因有待
于进一步深入研究。
遗传相似性分析与聚类分析结果表明:9个野生种的进化趋势符合从低倍到高倍异源多倍体化的过
程[ 4] 。栽培菊花品种中 , 2个药用菊滁菊 、杭白菊较为原始;栽培菊花随瓣性增强 , 品种较为进化 , 再
次印证栽培菊花演化过程为野生菊 、 药用菊到观赏菊 , 栽培菊花从小花单瓣向大花重瓣进化的过
程[ 11 , 12] 。栽培菊花与野生种的聚类较为分散 , 说明小菊类群进化上的复杂性[ 6] 。在本研究中除菊花脑
与栽培菊花黄英的杂种外 , 所有种间杂种均聚类在一起;菊属野生种 、栽培菊花及种间杂种的扩增带逐
渐增加 , 但多态性降低。这表明菊花可能是多起源演化 , 很多野生种可能参与了栽培菊花的形成 , 杂交
在起源过程中起了重要作用 , 随进化类群不断发展 , 基因组不断丰富;而并非仅仅由某一个或几个种进
化而来。
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责任编辑:沈 波
·33·第 3 期 李辛雷等:菊属野生种 、 栽培菊花及种间杂种的 RAPD分析