全 文 ：分子植物育种，2015年，第 13卷，第 12期，第 2843-2848页
Molecular Plant Breeding, 2015, Vol.13, No.12, 2843-2848
研究报告
Research Report
携带芋兰属 LATERAL SUPPRESSOR (LS)-EGFP融合基因植物表达载体
的构建
陈秀珍 梁凌玲 李俊仁 汤小婷 詹若挺 何瑞 *
广州中医药大学中药资源科学与工程研究中心,岭南中药资源教育部重点实验室,广州, 510006
*通讯作者, ruihe@gzucm.edu.cn
摘 要 LATERAL SUPPRESSOR (LS)是 GRAS家族参与植物分生组织发育的转录因子，是控制植物分枝的
关键基因。增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)是目前应用广泛的分子生物学报告基因之一，为筛选转基因植
株提供了简便有效的方法。为了探讨 LS基因在青天葵及其同属植物广布芋兰中的功能，本研究利用降落-
重叠 PCR (Touchdown-Overlap Extension PCR, TD-OE PCR) 方法，分别构建了两种芋兰属植物 LS基因和
EGFP融合基因。通过酶切和连接的方法，将融合基因构建到植物双元表达载体 pRI 101-AN DNA中，成功
获得了两个携带芋兰属植物 LS-EGFP融合基因的植物表达载体 pRI 101-LS-EGFP，并成功转化至农杆菌，下
一步拟用于转化拟南芥，为深入研究该基因功能提供基础。
关键词 LS基因, EGFP融合基因,青天葵,降落-重叠PCR
Construction of Plant Expression Vector Containing the LATERAL SUPPR-
ESSOR (LS) and EGFP Fusion Gene from Nervilia Genus
Chen Xiuzhen Liang Lingling Li Junren Tang Xiaoting Zhan Ruoting He Rui *
Research Center of Chinese Medicinal Resource Science and Engineering, Key Laboratory of Chinese Medicinal Resources from Lingnan, Ministry
of Education, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou, 510006
* Corresponding author, ruihe@gzucm.edu.cn
DOI: 10.13271/j.mpb.013.002843
Abstract LATERAL SUPPRESSOR(LS)- which regulates the branching and development in plants, is a transcript-
ion factor belonging to GRAS family. EGFP (enhanced green fluorescent protein) gene is one of the widely used
reporter genes, providing effective and easy approach to screen transgenic plants. In order to elucidate the function of
the LS genes in Nervilia fordii and its close relative species Nervilia aragoana, here the EGFP gene, the NfLS gene
from N.fordii and the NaLS from N.aragoana, respectively, were fused by touchdown-overlap extension PCR (TD-OE
PCR), and were then cloned into plant binary expression vector pRI 101-AN DNA, resulted in two recombinant
expression vectors pRI 101-NfLS/NaLS-EGFP by restriction and ligation. The recombinant plasmids were
successfully transferred into Agrobacterium strain EHA105.Functional of NfLS/NaLS genes will be carried out using
transgenicArabidopsis thaliana transfected byAgrobacterium tumefaciens carrying recombinant plasmids.
Keywords LS gene, EGFP fusion gene, Nervilia fordii (Hance) Schltr, Touchdown-overlap extension PCR
基金项目：本研究由国家自然科学基金面上项目(30701090)、教育部留学回国人员科研启动项目(教外司留(2009)1001号)和 2010
年中央财政支持地方高校发展专项资金项目(粤财教(2010)358号)共同资助
LATERAL SUPPRESSOR (LS)最早在番茄(Lycop-
ersicon esculentum Mill.) lateral suppressor (ls)突变体
发现，是控制腋生分生组织形成的基因之一，参与调
控侧芽的起始过程。番茄 ls突变体植株腋生分生组
织受到抑制，在营养生长期侧枝无法正常形成；但过
渡到生殖阶段，侧芽开始从花序轴叶腋处形成，说明
LS基因只参与番茄营养生长期侧生分生组织的形成
(Malayer and Guard, 1964)。LS基因编码的转录因子
属于植物特有的 GRAS (GAI, RGA, SCR)蛋白家族，
而且含有该家族的核心结构域 VHIID结构域(Schu-
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
图 1 PCR产物电泳图
注: A:待融合基因扩增产物; B:降落 - 重叠PCR 扩增产物;
M1: DL 2000 DNA marker; 1: NfLS; 2: NaLS; 3: EGFP2; 4:
EGFP1; 5: NfLS-EGFP; 6: NaLS-EGFP
Figure 1 Electrophoresis of PCR products
Note: A: PCR products of target genes; B: PCR products of
Touchdown-Overlap extension PCR; M1: DL 2000 DNA marker;
1: NfLS; 2: NaLS; 3: EGFP2; 4: EGFP1; 5: NfLS-EGFP; 6: NaLS-
EGFP
macher et al., 1995; 1999)。GRAS蛋白在植物中广泛
分布，参与调控植物生长发育、信号传导以及胁迫相
关的应答等过程(Schumacher et al., 1995; 1999)。拟
南芥 LATERAL SUPPRESSOR (LAS) (Greb et al., 2003)
和水稻 MONOCULM1 (MOC1) (Li et al., 2003)等均为
番茄 LS的同源基因，也是 GRAS蛋白家族转录因
子，与番茄 ls突变体相似，拟南芥 las突变植株在营
养生长期几乎无法形成侧枝，水稻 moc1突变体植株
则呈独杆型，且表达模式也相似。由此可知，番茄、拟
南芥和水稻的侧枝发育调控机制具有一定的保守性。
青天葵(Herba Nervilia Plicatae)是中国一种珍稀
名贵药材，临床多用于治疗肺系疾病，对于急性支气
管炎、哮喘等效果显著，临床用量非常大，资源相当
紧缺(谢月英等, 2009;汪松和解炎, 2004)。最早记载
于《本草纲目拾遗》，原植物为兰科芋兰属植物毛唇
芋兰(Nervilia fordii (Hance) Schltr.)，以其块茎或全草
入药(南京中医药大学, 2006; 广东省食品药品监督
管理局, 2004,广东科技出版社, pp.122-124)。由于该
植物生长特性显著，以无性生殖为主，对环境要求
苛刻，每株每年一般只长 1~2 个新球茎，而每个球
茎只长一片叶子，所以又名独角莲、铁帽子、独叶
莲、珍珠草等。凌征柱等(凌征柱和梁学金, 1998)在
诱导青天葵试管苗时，发现存在 1 株多叶、多球茎
或丛生苗得现象。而青天葵的同属植物广布芋兰
(Nervilia aragoana Gaud.)的一株多叶、多球茎的现象
在野生苗就非常常见。因此，研究这两种芋兰属植物
的分枝发育功能基因，比较它们分枝发育调控机制
的差异，可为通过调控功能基因促进青天葵合理分
枝，提高青天葵的产量提供理论基础。
增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)是目前应用广
泛的分子生物学报告基因之一，能有效的筛选转基
因植株。本研究通过降落-重叠PCR及酶切连接的
方法，构建两个分别携带两种芋兰属植物 LS 与
EGFP融合基因的植物双元表达载体，并获得其农杆
菌菌株，旨在为进一步转化拟南芥研究该基因的功
能奠定基础。
1结果与分析
1.1融合基因的构建
根据降落 - 重叠PCR 法构建融合基因和酶切
连接构建植物表达载体的实验路线，设计引物通过
PCR的方法对目的基因 NfLS/NaLS和 EGFP进行修
饰，包括添加酶切位点 NdeⅠ和 EcoRⅠ，以及连接基
因间的同源序列等。按照 3.2.2中的反应体系和条件
扩增得到待融合 DNA片段，包括 1 218 bp的目的基
因片段 NfLS、NaLS和 755 bp的 EGFP1片段，同时也
获得了两端分别添加了 NdeⅠ和 EcoRⅠ酶切位点的
EGFP2基因片段(图 1A)。
以回收的 NfLS/NaLS和 EGFP1为模板，利用引
物 P1 (或 P2)和 P6，经降落-重叠PCR扩增获得了
约 1 928 bp的 NfLS/NaLS基因和 EGFP 融合基因片
段(NfLS-EGFP、NaLS-EGFP) (图 1B)，所得片段的组
成为：NdeⅠ (酶切位点)-NfLS/NaLS-EGFP-EcoRⅠ(酶
切位点)。
1.2表达载体 pRI 101 -EGFP、pRI 101-NfLs/NaLs-
EGFP的构建和鉴定
PCR产物 EGFP2和 NfLS/NaLS-EGFP融合基因
片段经 NdeⅠ和 EcoRⅠ双酶切处理后进纯化回收
(图 2A)，与质粒 pRI 101-AN DNA经同样酶切处理
后回收的大片段连接，转化 Ecoli. Top10 (图 2B)。挑
取单克隆，扩大培养后提取质粒(图 3A)，选取重组质
粒上的两个单酶切位点 HindⅢ和 EcoRⅠ进行双酶
切鉴定，酶切重组表达载体 pRI101-EGFP后应获得两
条条带，分别为 9 455 bp和 1 652 bp，pRI 101-NfLs/
NaLs-EGFP则分别为 9 455 bp和 2 840 bp，酶切结果
(图 3B)符合预期。测序结果表明，插入片段 EGFP和
NfLS/NaLS-EGFP与设计相符，并已插入植物表达载
体，成功获得重组植物表达载体 pRI 101-EGFP、pRI
101-NfLS-EGFP和 pRI 101-NaLS-EGFP。
2844
图 2重组植物表达载体构建图谱
注: A:对照表达载体 pRI 101-EGFP; B: LATERAL SUPPRES－
SOR (Ls)-EGFP融合基因植物表达载体 pRI 101-LS-EGFP
Figure 2 The Construction of recombinant plant expression vec-
tors
Note: A: Expression control vector pRI 101-EGFP; B: LATERAL
SUPPRESSOR (Ls)-EGFP fusion gene plant expression vector pRI
101-LS-EGFP
图 3重组植物表达载体及其 HindⅢ和 EcoRⅠ双酶切产物
注 : M2: DL15000 DNA marker; M3: DL10000 DNA marker;
7,10: pRI 101-EGFP; 8,11: pRI 101-NfLS-EGFP; 9,12: pRI 101-
NaLS-EGFP
Figure 3 Recombinant plant expression vectors and restriction
analysis of recombinant plant expression vector
Note: M2: DL15000 DNA marker; M3: DL10000 DNA marker;
7,10: pRI 101-EGFP; 8,11: pRI 101-NfLS-EGFP; 9,12: pRI 101-
NaLS-EGFP
图 4农杆菌中重组质粒的 PCR鉴定
注: M1: DL2000 DNA marker; N: NTC; 13,14: pRI 101-NfLS-
EGFP; 15,16: pRI 101-NaLS-EGFP; 17,18: pRI 101-EGFP
Figure 4 PCR analysis of plasmids extracted form transfected
Agrobacterium
Note: M1: DL2000 DNAmarker; N: NTC; 13,14: pRI 101-NfLS-
EGFP; 15,16: pRI 101-NaLS-EGFP; 17,18: pRI 101-EGFP
1.3农杆菌转化和鉴定
用冻融法将重组表达载体 pRI 101-EGFP、pRI
101-NfLS-EGFP和 pRI 101-NaLS-EGFP导入农杆菌
EHA105，在含利福平(Rif)和卡那霉素(Kan)的 YEB
平板上，挑取单菌落接种于含有 20 μg/mL Rif 和
50 μg/mL Kan的 YEB液体培养基培养 24 h，提取
质粒，并进行 PCR扩增鉴定，获得与插入片段大小
一致的产物(图 4)，表明成功获得了含有目的片段
的表达载体的农杆菌菌株，可用于转化拟南芥。
2讨论
报告基因是一种表达产物易于被检测的编码蛋
白或酶的基因，可在遗传转化过程中用于检测外源
基因在转基因受体中是否表达。常用的报告基因有
GUS (β-glucuronidase, β-葡糖苷酸酶)基因(杨丹丹
等, 2014)、β-galactosidase (β- 半乳糖苷酶)基因(程
英豪, 1997)和 GFP (green fluorescent protein,绿色荧
光蛋白)基因等(Cormack et al., 1996)。GFP最早是从
海洋生物多管水母分离得到的一种荧光蛋白，作为
新型的报告基因，GFP具有其他报告基因所没有的
优势，首先其荧光稳定，易于检测，而且无需任何底
物或辅助因子，以紫外光和蓝光激发即可发出绿色
荧光，灵敏度高，用肉眼或荧光显微镜就可以观察；
而且 GFP分子量小，构建融合蛋白容易，融合基因的
荧光激发活性不便，且不影响目的基因的功能等(马
金石, 2009)。增强型绿色荧光蛋白(EGFP)是 GFP的
突变体，其荧光强度比 GFP提高了 35倍，而且在激
发后更稳定，16到 24小时内仍可检测到荧光(Zhang
et al., 1996)。由此 GFP及其突变体越来越广泛地应
用于基因的表达和调控、蛋白质的定位、细胞内物质
代谢和信号传递等方面。
LS基因编码的蛋白属于高等植物所特有的转录
因子家族 GRAS家族，该家族分为 DELLA、HAM、
LISCL、PAT1、LS、SCR、SHR和 SCL3等 8个亚家族，
由 400~770个氨基酸组成，N端结构高度变异；C端
结构高度保守且具有同源序列，全部家族成员均含
有 VHIID基序，与其两侧氨基酸残基组成的亮氨酸
丰富区共同构成了 GRAS家族的标志性结构域。LS
基因是 GRAS 家族中参与调控植物分生组织的起
始、腋芽和侧芽的形成发育等过程的转录因子，是调
控植物分枝形成的关键基因(Pysh et al., 1999)。前期，
本课题组在两种芋兰属植物中克隆了 LS的同源基
因，本研究构建了它们的植物表达载体以进一步研
究该基因的功能。为了能够高效地筛选转基因植株，
利用降落-重叠PCR法分别将青天葵 NfLS、广布芋
携带芋兰属 LATERAL SUPPRESSOR (LS)-EGFP融合基因植物表达载体的构建
Plant Expression Vector Containing the LATERAL SUPPRESSOR (LS) and EGFP Fusion Gene from Nervilia Genus 2845
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
表 1引物信息
Table 1 Primers information
引物
Primer
P1
P2
P3
P4
P5
P6
引物序列(5-3)
Primer sequence (5-3)
gggaattccatATGAAGGCCCGCTTAACG
gggaattccatATGAAGACCCGCTTAACG
ctcgcccttgctcaccatGAACCAAGAAGACACTGAATAGAGA
gggaattccatATGGTGAGCAAGGGCGAG
tctctattcagtgtcttcttggttcATGGTGAGCAAGGGCGAG
ccggaattcTTACTTGTACAGCTCGTCCATGC
附加序列功能
Function of additional sequence
添加酶切位点 NdeⅠ
Add NdeⅠrestriction site
与 EGFP上游序列同源
Homologous with the 5 end of EGFP gene
添加酶切位点 NdeⅠ
Add NdeⅠrestriction site
与 NfLS, NaLS下游序列同源
Homologous with the 3 end of NfLS and
NaLS gene
添加酶切位点 EcoRⅠ
Add EcoRⅠ restriction site
扩增片段
Amplified fragment
NfLS, NaLS
EGFP
图 5降落-重叠PCR构建融合基因实验设计示意图
Figure 5 Schematic diagram of constructing fusion gene by
touchdown-overlap extension PCR
兰 NaLS与 EGFP基因融合，插入表达载体成功构建
了携带两种芋兰 LS-EGFP 的融合基因植物表达载
体，可用于转化拟南芥等双子叶植物，可进一步对 LS
基因编码蛋白的定位、基因的表达和功能的等方面
进行深入研究。
3材料与方法
3.1菌株和载体
大肠杆菌 Top10、农杆菌 EHA105、质粒 pGEM-
NfLS和 pGEM-NaLS均为本实验室保存。质粒 pC-
AMBIA-2300-35S-EGFP 为中国医学科学院药用植
物研究所马艺沔老师馈赠。植物表达载体 pRI101-AN
DNA购自 TaKaRa大连宝生物工程有限公司。
3.2主要试剂
限制性内切酶 NdeⅠ、EcoRⅠ-HF购自 NEB公
司，T4 DNA连接酶购自 Promega公司，DL2000 DNA
Marker、DL10000DNAMarker、DL15000DNAMarker、
高保真酶 PrimeSTAR Max Premix(2×)、Premix Taq
(LA Taq)均购自 TaKaRa大连宝生物工程有限公司；
高保真酶 Pfu DNA Polymerase、FastDigest EcoRⅠ、
FastDigest HindⅢ等购自赛默飞世尔科技公司；质粒
小提试剂盒(TIANprep Mini Plasmid Kit）购自 TIAN-
GEN公司；多功能 DNA纯化回收试剂盒购自北京
BioTeke公司。本研究采用的引物合成和普通测序服
务由华大基因提供。
3.3引物设计
利用基因分析软件 SnapGene对目的基因及载
体序列进行酶切位点分析，根据降落-重叠PCR构
建融合基因(图 5)和以酶切连接的方法构建重组质
粒的实验路线进行引物设计。将酶切位点 NdeⅠ引
入到目的基因 NfLS/NaLS的 5端，同时将 NfLS/NaLS
基因的 3末端的终止子去掉，加入部分与 EGFP基
因上游同源的序列；将酶切位点 EcoRⅠ引入到
EGFP 基因的 3 端，并在 5 端加入部分目的基因
NfLS/NaLS下游同源的序列。同时构建 EGFP表达载
体 pRI 101-EGFP作为对照，在 EGFP基因 3端引入
NdeⅠ酶切位点和 5端引入 EcoRⅠ酶切位点，设计
引物如表 1。
3.4 NfLS、NaLS 和 EGFP基因的获得
以 pGEM-NfLS为模板，用引物 P1 和 P3 扩增
NfLS，PCR反应体系 50 μL，包含 PrimeSTAR Max
Premix (2×)25 μL，上游引物(10 μmol/L) 1.25 μL，下
2846
游引物(10 μmol/L)1.25 μL，模板 2.5 μL，MilliQ超纯
水(灭菌)补足 50μL。扩增条件为：预变性 98℃ 2 min；
变性 98℃ 10 s，退火 55℃ 5s，延伸 72℃ 30 s，30 个
循环；再延伸 72℃ 5 min。
以 pGEM-NaLS为模板，用引物 P2和 P3扩增
NaLS，PCR反应体系和扩增条件同上。而 EGFP基因
是以 pCAMBIA-2300-35S-EGFP为模板，用引物 P4
和 P6扩增获得添加了酶切位点 NdeⅠ和 EcoRⅠ的
EGFP1，和用引物 P5 和 P6 扩增获得待融合片段
EGFP2。反应体系和条件与上述基本一致，只是基因
较短，延伸时间缩短为 10 s。
以 1%琼脂糖凝胶电泳检测 PCR产物，然后进行
切胶回收，按照多功能 DNA纯化回收试剂盒操作。
3.5降落-重叠 PCR法构建融合基因
降落-重叠PCR法是柴冉等(2012)提出的一种
融合 PCR策略(图 5)，该方法是在常规重叠 PCR的
两步反应中均增加了一个降落 PCR程序，大大地提
高了扩增的效率和特异性。以下采用该方法进行
NfLs-EGFP/NaLs-EGFP融合基因的克隆，并进行了实
验条件的优化。
降落-重叠PCR法克隆融合基因分为两步，第
一步待融合片段的连接，形成融合片段，反应体系为
47 μL，包含模板 DNA1 (扩增产物 NfLS 或 NaLS)
2 μL，DNA2 (扩增产物 EGFP2) 2 μL，10×Pfu Buffer
with MgSO4 5 μL，Pfu DNA Polymerase(Recombinant,
2.5 U/μL) 0.5 μL，dNTPMixture (10 mmol/L) 3.75 μL，
MilliQ超纯水(灭菌)补足 47 μL。Touch-down PCR
扩增程序为：94℃预变性 5 min，94℃变性 30 s，将退
火设为由 61.5℃降落到 57℃，分别在不同的温度退
火 30 s，68℃延伸 4 min，以 10个循环完成梯度降温
循环；然后选 57℃为最佳温度，94℃变性 30 s，57℃
退火 40 s，68℃延伸 4 min，再进行 10个循环；72℃
再延伸 10 min。
完成第一步反应后，直接在反应液中加入引物
P1(或 P2)和 P6，补加 Pfu DNA Polymerase 0.5 μL，以
上述形成的融合片段为模板进行扩增，Touch-down
PCR扩增程序为：94℃预变性 5 min，94℃变性 30 s，
将退火设为由 60.5℃降落到 56℃，分别在不同的温
度退火 30 s，72℃延伸 4 min，以 10个循环完成梯度
降温循环；然后选 56℃为最佳温度，以 94℃30 s，
56℃40 s，72℃4 min，进行 25个循环后，最后 72℃延
伸 10 min。
以 1%琼脂糖凝胶电泳检测 PCR产物，参照多
功能 DNA纯化回收试剂盒说明书纯化目的片段，得
到的两个融合基因 NfLS-EGFP和 NaLS-EGFP。
3.6表达载体的构建
以NdeⅠ和EcoRⅠ分别对载体 pRI101-ANDNA、
融合基因(NfLS-EGFP和 NaLS-EGFP)以及 EGFP2进
行双酶切处理，100 μL的酶切反应体系：10×CutSmart
10 μL，NdeⅠ2 μL，EcoRⅠ2 μL，DNA 适量，MilliQ
超纯水(灭菌)补足 100μL，37℃酶切过夜，65℃ 20min
酶失活后，目的片段经 1%琼脂糖凝胶电泳，以多功
能 DNA纯化回收试剂盒进行切胶回收。
取双酶切处理后的 pRI 101-AN DNA适量，分
别和融合基因 NfLS-EGFP、NaLS-EGFP 以及 EGFP2
按一定比例进行连接反应，加入 10×T4 DNA Ligase
Buffer 1 μL，T4 DNA Ligase 1 μL，MilliQ超纯水(灭
菌)补足 10 μL，4℃孵育过夜。
参照《分子克隆实验指南(第三版)》以氯化钙法
制备 Ecoli. Top10感受态细胞并以热击法进行连接
产物的转化，在含 Kan 50 μg/mL的 LB固体培养基
培养过夜，挑取单克隆用含有 50 μg/mL Kan的液体
培养基培养过夜，然后采用质粒小量提取试剂盒提
取重组质粒，琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度检测
质粒的浓度和纯度。
3.7重组质粒酶切和测序鉴定
取上述重组质粒约 1μg，用 HindⅢ和 EcoRⅠ双
酶切。反应体系如下：质粒DNA适量，10×Buffer 2μL，
HindⅢ1 μL，EcoRⅠ1 μL，质粒 5 μL，MilliQ超纯水
(灭菌)补足 20μL，37℃酶切 15min，65℃酶失活 10min
后，进行琼脂糖凝胶电泳检测。将鉴定为阳性重组
质粒的菌液送华大基因测序。
3.8农杆菌的转化和鉴定
采用冻融法将重组表达载体转化根癌农杆菌
EHA105中。取 2 μL重组质粒加入到 100 μL EHA-
105感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴 30 min；液氮速
冻 1 min；取出后 37℃温浴 3 min；冰上冷却 2 min后，
加入 900 μL YEB液体培养基，28℃，180 rpm振荡培
养 3 h；1 2000 g离心 3 min收集菌体，去除培养基后，
再重悬于 100 μL YEB液体培养基中，涂布在含有
20μg/mL Rif和 50μg/mL Kan的 YEB固体培养基，
倒置培养 2~3 d。挑取单克隆用含有 25 μg/mL Rif和
50 μg/mL Kan的 YEB液体培养基培养 24 h，然后采
用质粒小量提取试剂盒提取重组质粒。
以提取的重组质粒为模板，及获得插入片段的
携带芋兰属 LATERAL SUPPRESSOR (LS)-EGFP融合基因植物表达载体的构建
Plant Expression Vector Containing the LATERAL SUPPRESSOR (LS) and EGFP Fusion Gene from Nervilia Genus 2847
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
扩增引物(即上游引物: P1, P2和 P4,下游引物 P6)进
行 PCR扩增鉴定。PCR反应体系 20 μL，包含 Pre-
mix Taq (LA Taq) 10μL，上游引物(10μmol/L) 0.5μL，
下游引物(10 μmol/L) 0.5 μL，模板 1 μL，MilliQ超纯
水(灭菌)补足 20 μL。扩增条件为：94℃模板预变性
3 min，以 94℃10 s，63.5℃30 s，72℃2 min进行 30个
循环；72℃再延伸 5 min。
作者贡献
陈秀珍是本研究的实验设计和实验研究的执行
人，负责论文写作和修改；梁凌玲、李俊仁和汤小婷
参与实验设计和试验结果分析；詹若挺参与指导实
验执行及结果分析；何瑞是项目的主要构思者和负
责人，指导实验设计和执行，结果分析，论文修改。全
体作者都阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究由国家自然科学基金面上项目(30701090)，
教育部留学回国人员科研启动项目(教外司留[2009]
1001号)和 2010年中央财政支持地方高校发展专项
资金项目—南药可持续利用研究与综合开发利用技
术平台(粤财教[2010]358 号)共同资助，特此感谢。
同时感谢无私馈赠质粒的马艺沔老师和质粒最初
的来源 - 中国科学院遗传与发育生物学研究所储
成才研究员。
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