全 文 ：浙江农业学报 Acta Agriculturae Zhejiangensis，2015，27(8) :1362 － 1366 http:/ /www． zjnyxb． cn
汪巧英，张雪，左诗璇，等． 万代兰属植物 rDNA ITS序列的克隆与分析［J］．浙江农业学报，2015，27(8) :1362 － 1366．
DOI:10. 3969 / j． issn． 1004 － 1524. 2015. 08. 09
收稿日期:2015-03-16
基金项目:台州学院校立学生科研项目(14XS23)。
作者简介:汪巧英(1993—) ，女，浙江临海人，本科，研究方向为植物分子生物学。E-mail:15968684293@ 163． com
* 通讯作者，蒋明，E-mail:jiangming@ tzc． edu． cn
万代兰属植物 rDNA ITS序列的克隆与分析
汪巧英，张 雪，左诗璇，郑梦如，张梦琼，章燕如，蒋 明*
(台州学院 生命科学学院，浙江 椒江 318000)
摘 要:通过测定 7 种万代兰属植物的 rDNA ITS序列，为该属植物的分子鉴定和遗传多样性研究奠定基础。
以叶片基因组 DNA为模板，利用 PCＲ扩增 7 种万代兰属植物的 ITS 序列，在测序的基础上进行生物信息学
分析。结果表明，ITS的全长为 653 ～ 657 bp，其中 5. 8S和 ITS2 的长度十分保守，分别为 163 和 260 bp，ITS1
的长度为 230 ～ 234 bp。7 种万代兰属植物的 5. 8S序列完全一致，而 ITS1 和 ITS2 序列中存在转换、颠换、插
入 /缺失现象。系统发育分析结果表明，7 种植物的平均遗传距离为 0. 021，它们在发育树上可分为 3 组。
关键词:万代兰属;ITS序列;克隆;分子鉴定
中图分类号:S 682. 31;Q 949. 71 + 8. 43 文献标志码:A 文章编号:1004-1524(2015)08-1362-05
Cloning and analysis of rDNA ITS sequences from Vanda plants
WANG Qiao-ying，ZHANG Xue，ZUO Shi-xuan，ZHENG Meng-ru，ZHANG Meng-qiong，ZHANG Yan-ru，JIANG
Ming*
(College of Life Science，Taizhou University，Jiaojiang 318000，China)
Abstract:To provide evidences for molecular identification and genetic diversity studies，rDNA ITS sequences of 7
Vanda plants were isolated． ITS sequences were cloned by polymerase chain reaction using leaf genomic DNA as tem-
plates，and bioinformatic analysis was performed． Ｒesults indicated that the full length of ITS sequences ranged from
653 to 657 bp，and the sequences of 5. 8S and ITS2 were conserved with an identical length of 163 and 260 bp，re-
spectively;however，sequence length of ITS1 varied from 230 － 234 bp． The 5. 8S sequences of 7 Vanda plants were
identical，while some cases of transitions，transversion，and deletions / insertions were identified in both ITS1 and
ITS2 sequences． Phylogenetic analysis results showed that the average genetic distance of 7 Vanda plants was 0. 021，
and they were divided into 3 groups．
Key words:Vanda;ITS sequence;cloning;molecular identification
兰科(Orchidaceae)是被子植物中最进化的
类群，约有 700 个属组成，物种数多达 20 000，我
国的兰科资源十分丰富，有 171 属 1 200 多个
种［1］。万代兰属(Vanda)又称万带兰属，分布于
亚洲热带和亚热带地区，该属植物种类较少，全
世界仅约 60 种，均为附生植物;我国有 14 个种
和 1 个变种，以云南分布最为集中［2］。万代兰属
植物的不少种类花朵奇特、花色艳丽，具有较好
的观赏价值;另外，它们可与近缘属指甲兰属
(Aerides)、蜘蛛兰属(Brassia)、蝴蝶兰属(Phalae-
nopsis)、钻喙兰属(Ｒhynchostylis)和火焰兰属
(Ｒenanthera)等兰科植物杂交得到属间杂种，并
育成了一些新品种［3］。
近年来，研究人员在栽培技术、品种选育、组
织培养、资源调查和形态发生等方面对万代兰属
植物进行了研究［4 － 10］，但有关 rDNA ITS 的克隆
和分析未见报道。核糖体 DNA内转录区(riboso-
mal DNA internal transcribed spacer，ITS)由 ITS1，
5. 8S和 ITS2 三部分组成，ITS 序列的长度保守，
信息位点丰富，已广泛应用于植物种间、属间及
科内的系统发育、遗传结构和物种鉴定［11］。本
研究以 7 种万代兰属植物为材料，在克隆 ITS 序
列的基础上，利用生物信息学方法对它们进行分
析，为该属植物的分子鉴定和遗传多样性研究奠
定基础。
1 材料与方法
1． 1 材料
万代兰属植物由实验室栽培，共 7 种，它们
是小蓝万代兰(V． coerulescens)、矮万代兰(V．
pumila)、白柱万代兰(V． brunnea)、大花万代兰
(V． coerulea)、纯色万代兰(V． subconcolor)、垂头
万代兰(V． alpina)和琴唇万代兰(V． concolor)。
1． 2 基因组 DNA的提取
采集新叶，用无菌水冲洗后备用。DNA采用
北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司新型植物
基因组 DNA 快速提取试剂盒(NEP023-1)提取，
操作根据其提供的说明书进行。
1． 3 ITS序列的克隆、转化和测序
ITS的扩增采用通用引物，分别是上游引物
5-AACAAGGTTTCCGTAGGTGA-3 和下游引物
5-TATGCTTAAAYTCAGCGGGT-3［12］。反应总体
积为 25 μL，分别加入 40 ng模板 DNA、2. 5 μL 10
× PCＲ buffer(含 20 mmol·L －1 Mg2 +)、0. 6 μL
dNTPs(10 mmol·L －1)、0. 5 μL Taq DNA 聚合酶
(2 U·μL －1)、各 0. 5 μL 20 μmol·L －1的上、下游
引物，最后加无菌 ddH2O 至终体积。扩增程序
为:95℃预变性 5 min，95℃变性 30 s，56. 5℃退火
40 s，72℃延伸 70 s，31 个循环后，72℃继续延伸
10 min。PCＲ 产物经电泳检测后割胶、回收和纯
化，纯化产物与 T-easy 载体连接过夜，用热击法
转入 DH5α受体菌，经 PCＲ检测后各挑取 3 个阳
性克隆用于测序。
1． 4 生物信息学分析
GC值含量的计算采用 DNASTAＲ软件;序列
比对用 ClustalX 1. 83 软件完成;MEGA 5. 0 软件
用于检测信息位点和变异位点，系统发育树的构
建采用邻接法(Neighbor Joining Method) ，自举检
测次数为 1 000。
2 结果与分析
2． 1 ITS序列的长度和 GC值
测序结果表明，7 种万代兰属植物的 ITS 全
长为 653 ～ 657 bp，琴唇万代兰的 ITS 序列最长，
纯色万代兰次之，为 656 bp，大花万代兰最短;
5. 8S的序列长度十分保守，均为 163 bp;ITS1 的
长度为 230 ～ 234 bp，琴唇万代兰的 ITS1 序列最
长，纯色万代兰次之，为 233 bp，大花万代兰的最
短;7 种万代兰属植物 ITS2 的长度也十分保守，
均为 260 bp(表 1)。ITS1 的 GC 值为 64. 1% ～
66. 1%，5. 8S 的 GC 值均为 58. 3%，而 ITS2 的
GC值为 56. 9% ～59. 2%。
表 1 万代兰属植物 ITS序列的长度及 GC值
Table 1 Length and GC contents of ITS sequences of Vanda
植物名称 ITS全长 /bp 5. 8S ITS1 ITS2
长度 /bp (G + C)/% 长度 /bp (G + C)/% 长度 /bp (G + C)/%
Vanda coerulescens 654 163 58. 3 231 64. 5 260 57. 3
Vanda pumila 655 163 58. 3 232 65. 1 260 58. 1
Vanda brunnea 654 163 58. 3 231 64. 1 260 56. 9
Vanda coerulea 653 163 58. 3 230 64. 3 260 56. 9
Vanda subconcolor 656 163 58. 3 233 66. 1 260 59. 2
Vanda alpina 655 163 58. 3 232 65. 5 260 58. 5
Vanda concolor 657 163 58. 3 234 64. 5 260 58. 1
·3631·汪巧英，等． 万代兰属植物 rDNA ITS序列的克隆与分析
2． 2 5. 8 S，ITS1 和 ITS2 序列的比较分析
利用 ClustalX 1. 83 对 7 种万代兰属植物的
5. 8S，ITS1 和 ITS2 序列进行分别比对，结果表
明，7 种植物的 5. 8S 序列完全一致，163 个位点
均属于保守位点，没有发生变异(图 1)。ITS1 序
列有 219 个保守位点，另有可变位点 14 个，其中
7 个为信息位点，分别位于 + 9，+ 43，+ 81，
+ 105，+ 117，+ 120，+ 187 处(图 2)。序列存在
转换、颠换、插入 /缺失现象，如白柱万代兰的 +
49 位和小蓝万代兰的 + 107 位由 G 颠换成 T;小
蓝万代兰的 + 66 由 C 转换成 T，而 + 72 位的 A
转换成 G;序列的 + 97，+ 98，+ 99 和 + 112 位有
4 次插入 /缺失现象。
ITS2 序列的比对结果表明，7 种万代兰属植
物的 ITS2 具 238 个保守位点，另有可变位点 22
个。22 个可变位点中有 6 个信息位点，它们分别
位于 + 25，+ 33，+ 73，+ 128，+ 209 和 + 245 处
(图 3)。与 ITS1 类似，ITS2 序列中也存在一系列
的转换、颠换、插入 /缺失现象，如纯色万代兰的
+ 2 及琴唇万代兰的 + 95 和 + 205 位存在转换，
图 1 万代兰属植物 5． 8 S序列的比对
Fig． 1 Comparison of 5. 8S sequences of Vanda
图 2 万代兰属植物 ITS1 序列的比对
Fig． 2 Comparison of ITS1 sequences of Vanda
·4631· 浙江农业学报 第 27 卷 第 8 期
这 3 个位点的碱基均为 C，而其他物种中为 T;
小蓝万代兰的 + 25，+ 22，+ 66 和 + 116 位均为
C，其他物种为 T，发生了转换现象;与其他万代
兰属植物相比，大花万代兰 + 28 和 + 80 发生
颠换。
2． 3 系统发育分析
用 MEGA软件构建 7 种万代兰属植物的系
统发育树，它们处于 3 个不同的分支，用Ⅰ，Ⅱ和
Ⅲ表示(图 4)。7 种万代兰属植物的平均遗传距
离为 0. 021，矮万代兰和垂头万代兰之间的遗传
距离最小，仅 0. 009，白柱万代兰和纯色万代兰次
之，为 0. 011，而琴唇万代兰和小蓝万代兰之间的
遗传距离最大，为 0. 038。Ⅰ组由大花万代兰、垂
头万代兰和矮万代兰组成，Ⅱ组则由白柱万代
兰、纯色万代兰和琴唇万代兰组成，而小蓝万代
兰单独处于分支Ⅲ。
图 3 万代兰属植物 ITS2 序列的比对
Fig． 3 Comparison of ITS2 sequences of Vanda
图 4 基于邻接法构建的系统发育树
Fig． 4 The phylogenetic tree constructed using Neighbour-
Joining method
3 讨论
随着分子生物学理论和实践的不断深化，涌
现了大量的分子标记技术，包括 ＲAPD(random
amplified polymorphic DNA，随机扩增多态性 DNA)、
AFLP(amplified fragment length polymorphism，扩
增片段长度多态性)、ISSＲ(inter-simple sequence
repeat，简单重复序列间多态性)、SＲAP(se-
quence-related amplified polymorphism，相关序列
扩增多态性)、叶绿体基因(matK，rbcl，atpB 及
trnL等)和 rDNA ITS 等，它们各有优点，已在物
种鉴定、系统进化、分子辅助育种和遗传多样性
方面有大量应用［11 － 17］。rDNA ITS是基于测序的
分子标记，具有操作简单、重复性好和成本低廉
等优点，已广泛应用于植物物种的鉴定［18］。本
研究中，7 种万代兰属植物的 ITS 序列具有丰富
的信息位点，利用这些位点可将它们完全区分。
5. 8S为编码序列，通常十分保守，如芭蕉科
(Musaceae)植物 5. 8S 的长度为 154 或 155
bp［19］，沙棘属(Hippophae)为 166 或 167 bp［20］，兰
科植物萼距兰属(Disa)的 5. 8S 长度为 162 或
163 bp［21］，杜鹃花科映山红亚属的 5. 8S均为 164
·5631·汪巧英，等． 万代兰属植物 rDNA ITS序列的克隆与分析
bp，而且序列完全一致［22］。本研究中，7 种万代
兰属植物的 5. 8S 长度均为 163 bp，它们的序列
组成完全相同。而 ITS1 和 ITS2 为非编码序列，
在进化过程中所受的压力较小，能积累较多的变
异。本研究中，ITS1 与 ITS2 分别有 14 和 22 个变
异位点，占总位点数的 5. 98%和 8. 46%。与同为
兰科植物的石斛属(Dendrobium)相比，万代兰属
的 ITS1 和 ITS2 相对保守，石斛属的 ITS1 有 176
个变异位点，而 ITS2 有 166 个［23］。万代兰属 ITS
序列的克隆和分析，为该属植物分子鉴定和遗传
多样性研究奠定了基础。
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(责任编辑 张 韵)
·6631· 浙江农业学报 第 27 卷 第 8 期