全 文 ：第 51 卷 第 4 期
2012 年 7 月
中山大学学报 (自然科学版)
ACTA SCIENTIARUM NATURALIUM UNIVERSITATIS SUNYATSENI
Vol. 51 No. 4
Jul. 2012
江蓠属和龙须菜属 5种海藻 ITS序列分子系统学分析*
李婷婷1，陈 斌1，陈省平2，刘 翠1，姚 雪1，陈伟洲3，赖学文4，刘 涛1
(1． 中国海洋大学海洋生命学院，山东 青岛 266003;
2． 中山大学中山医学院，广东 广州 510080;
3． 汕头大学，广东 汕头 515063;
4． 汕头市水产研究所，广东 汕头 515000)
摘 要:测定了江蓠属 Gracilaria和龙须菜属 Gracilariopsis 5 个物种的 23 个群体的 ITS (含 5. 8S rDNA)序列，
并结合 GenBank数据库中现有江蓠科 Gracilariaceae的 16 个物种的 ITS序列进行分析，在不同分类阶元中探讨了
序列变异和和系统进化关系。江蓠科海藻 ITS序列长度在 893 ～ 1 508 bp之间，种间遗传距离在 0. 041 ～ 0. 600 之
间，种内遗传距离在 0. 000 ～ 0. 012 之间，其种间遗传距离均大于种内遗传距离;ITS 系统发育聚类结果显示江
蓠科分为两大分支，分别是江蓠属 /Hydropuntia分支、龙须菜属 /蓠生藻属 Gracilariophila分支;江蓠科海藻 5. 8S
序列种内种间变异很小，但存在稳定的属间区分位点，可用于属以上水平的分类鉴定;中国、美国和俄罗斯三
地的真江蓠群体的 ITS序列存在 9 个稳定的变异位点，可以将不同地理群体区分开。
关键词:江蓠科;江蓠属;龙须菜属;ITS;5. 8S rDNA;系统发育
中图分类号:Q949;Q349 文献标志码:A 文章编号:0529 － 6579 (2012)04 － 0097 － 09
Phylogeny of Five Gracilaria and Gracilariopsis Species
(Gracilariceae，Rhodophyta)Based on ITS Sequence Analysis
LI Tingting1，CHEN Bin1，CHEN Shengping2，YAO Xue1，LIU Cui1，
CHEN Weizhou3，LAI Xuewen4，LIU Tao1
(1． College of Marine Life Sciences，Ocean University of China，Qingdao 266003，China;
2． Zhongshan School of Medicine，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510080，China;
3． Shantou University，Shantou 515063，China;
4． Shantou Fisheries Research Institute，Shantou 515000，China)
Abstract:To analyze genetic diversity and phylogeny of Gracilariaceae (Gracilariales，Rhodophyta)．
We compared ITS (including 5. 8S rDNA)sequences of twenty three populations of five Gracilaria and
Gracilariopsis species (Gracilariaceae，Rhodophyta) ，with the ITS sequences of 16 Gracilariaceaen spe-
cies downloaded from GenBank database． The result showed that the length of ITS sequences of Gracilari-
aceae varies from 893 to 1 508 bp． The interspecific genetic distance ranges from 0. 041 to 0. 600;the in-
traspecific genetic distance ranges from 0. 000 to 0. 012，the former is much higher than the latter． Two
main lineages of Gracilariaceae were from:Gracilaria \ Hydropuntia and Gracilariopsis /Gracilariophila．
5. 8S sequences of Gracilariaceae has low variation among species and among populations，but the distinct
sites were found among the genera and can be used on genus level or above． There are 9 mutant sites that
can be used to distinguish the populations of G． vermiculophylla from China，Russia and USA．
Key words:Gracilariaceae;Gracilaria;Gracilariopsis;ITS;5. 8S rDNA;phylogenic
* 收稿日期:2011 － 11 － 07
基金项目:国家科技基础性工作专项资助项目 (2007FY210500) ;广东省科技攻关资助项目 (2006B20201056，
2010B060200010，2010B020201015)
作者简介:李婷婷 (1989 年生) ，女，硕士研究生;通讯作者:刘涛;E-mail:liutao@ ouc. edu. cn
中山大学学报 (自然科学版) 第 51 卷
江蓠科 Gracilariaceae 在自然分类系统上属于
红藻门 Rhodophyta 江蓠目 Gracilariales，包括江蓠
属 Gracilaria、龙须菜属 Gracilariopsis、蓠生藻属
Gracilariophila、 Hydropuntia、 Curdiea、 Melanthalia
和 Congracilaria 7 个属。在红藻门中，江蓠科无论
是解剖学层面［1 － 3］还是分子学层面［4 － 6］，都是很明
确的一个科，但是因缺乏足够多的形态学和生殖结
构特征，其属间种间存在着复杂的分类关系［7 － 10］。
在过去的 20 年里，分子生物学技术不断的应用到
江蓠科分类研究中，揭示江蓠科种水平上的系统发
生关系。目前江蓠科分子系统学研究多采用 18S
rDNA［10 － 11］、Rubisco spacer［11 － 13］、 ITS (internal
transcribed spacer )［10，12，14］、 rbcL［15 － 18］、 cox2 －
3［13，19］和 psbA［16］等序列。
ITS序列包括 ITS1 和 ITS2，是分别介于 18S与
5. 8S、5. 8S 与 28S rDNA 之间的非编码序列，呈
ITS1 － 5. 8S － ITS2 结构 (本文将 ITS1 － 5. 8S －
ITS2 简称为 ITS)。此结构中 5. 8S 是高度保守的基
因序列，而 ITS1 和 ITS2 是进化速度较快的序列，
利用 ITS序列可以从不同分类水平上探讨系统进化
关系。本文通过对来自江蓠属和龙须菜属总 5 个物
种 23 个种群的 ITS 序列进行扩增，并与 GenBank
中江蓠科海藻 ITS序列进行比对分析，从分子水平
上阐明江蓠科海藻系统发育和种群水平的遗传变
异，为江蓠科海藻的分类和鉴定提供更多数据。
1 材料与方法
1. 1 实验材料
本实验所用江蓠科海藻 5 个物种 23 个群体由
中国海洋大学大型海藻种质库提供 (见表 1)。每
个群体选取 2 ～ 3 株个体进行实验，总 66 株实验材
料。
表 1 实验材料信息1)
Table 1 Samples used in the ITS sequencing and their information
材料编号 物种 采样时间 采样地点 GenBank 获取号
201003031 芋根江蓠 G． blodgettii 2010 － 03 中国广东汕头 (养殖群体)2) JN935112 － JN935114
201005013 芋根江蓠 G． blodgettii 2010 － 05 中国广东汕头 (养殖群体)2) JN935109 － JN935111
201003032 龙须菜 Gp． lemaneiformis 2010 － 03 中国广东汕头 (养殖群体) JN935071 － JN935073
201003033 龙须菜 Gp． lemaneiformis 2010 － 03 中国广东汕头 (养殖群体) JN935080 － JN935082
201003034 龙须菜 Gp． lemaneiformis 2010 － 03 中国广东汕头 (养殖群体) JN935074 － JN935076
201003036 龙须菜 Gp． lemaneiformis 2010 － 03 中国广东汕头 (养殖群体) JN935083 － JN935085
201003076 龙须菜 Gp． lemaneiformis 2010 － 03 中国广东汕头 (养殖群体) JN935086 － JN935088
201003176 龙须菜 Gp． lemaneiformis 2010 － 03 中国福建连江 (养殖群体) JN935077 － JN935079
201004021 龙须菜 Gp． lemaneiformis 2010 － 04 中国福建连江 (养殖群体) JN935068 － JN935070
201009001 龙须菜 Gp． lemaneiformis 2010 － 09 中国山东威海 (养殖群体) JN935065 － JN935067
201003035 脆江蓠 G． ． chouae 2010 － 03 中国广东汕头 (养殖群体) JN935062 － JN935064
201003175 脆江蓠 G． chouae 2010 － 03 中国福建连江 (养殖群体) JN935059 － JN935061
201005004 真江蓠 G． vermiculophylla 2010 － 05 中国山东青岛 (野生群体) JN935115，JN935116
201006105 真江蓠 G． vermiculophylla 2010 － 06 中国山东青岛 (野生群体) JN935117 － JN935119
201003088 真江蓠 G． vermiculophylla 2010 － 03 中国海洋大学 (养殖群体)3) JN935089 － JN935091
201003089 真江蓠 G． vermiculophylla 2010 － 03 中国广东汕头 (养殖群体)4) JN935123，JN935124
201007588 真江蓠 G． vermiculophylla 2010 － 07 中国山东威海 (野生群体) JN935120 － JN935122
201004170 细基江蓠繁枝变种 G． tenuistipitata var ． liui 2010 － 04 中国海南 (养殖群体) JN935100 － JN935102
201004169 细基江蓠繁枝变种 G． tenuistipitata var ． liui 2010 － 04 中国福建 (养殖群体) JN935097 － JN935099
201004183 细基江蓠繁枝变种 G． tenuistipitata var ． liui 2010 － 04 中国福建 (养殖群体) JN935103 － JN935105
201004207 细基江蓠繁枝变种 G． tenuistipitata var ． liui 2010 － 04 中国福建 (养殖群体) JN935106 － JN935108
201006104 细基江蓠繁枝变种 G． tenuistipitata var ． liui 2010 － 06 中国广东汕头 (养殖群体) JN935092 － JN935094
2010081295 细基江蓠繁枝变种 G． tenuistipitata var ． liui 2010 － 08 中国广东汕头 (养殖群体) JN935095，JN935096
1)G．:Gracilaria江蓠属;Gp．:Gracilariopsis龙须菜属;2)G． blodgettii 原产地为印度尼西亚;3)G． vermiculophylla 原产
地为俄罗斯;4)G． vermiculophylla原产地为美国，由中国海洋大学宫庆礼教授提供
89
第 4 期 李婷婷等:江蓠属和龙须菜属 5 种海藻 ITS序列分子系统学分析
1. 2 实验方法
1. 2. 1 总 DNA 提取 总 DNA 提取采用改进的
CTAB法［20］。所提取 DNA用 w = 1%琼脂糖凝胶进
行电泳检测，使用 NanoDrop ND －1000 仪器，测定
A260 /A280、A260 /A230比值，对 DNA 浓度和纯度进行
质量评价，并将 DNA 模板浓度统一调整到 50 ng /
μL。
1. 2. 2 PCR 扩增 用于 ITS 序列扩增的引物为
TW81:5 － GGGATCCGTTTCCGTAGGTGAACCTGC
－ 3; AB28: 5 － GGGATCCATATGCTTAAGT-
TCAGCGGGT － 3［21］，引物由上海博尚生物技术有
限公司合成。PCR 反应体系为 25 μL，反应体系:
ddH2O 16. 8 μL，10 × Buffer 2. 5 μL，MgCl2 (25
mmol /L)2. 3 μL，dNTP 2. 0 μL，正反引物 (10
μmol /L)各 0. 1 μL，DNA 模板 (50 ng /μL)1. 0
μL，Taq DNA 聚合酶 (5 U /μL)0. 2 μL。PCR 扩
增程序:94 ℃预处理 6 min 后，94 ℃变性 1 min，
51 ℃复性 1 min，72 ℃延伸 1 min，总 35 个循环，
最后在 72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存。
1. 2. 3 PCR产物纯化、克隆及测序 PCR 产物用
TIANgel Midi Purification Kit 试剂盒 (北京天根生
化科技有限公司)胶回收纯化后与 pMD19 － T 载
体 (TaKaRa 宝生物工程有限公司)连接后转化至
感受态 E. coli TOP 10 (北京天根生化科技有限公
司)中，经氨苄青霉素抗性筛选，每份 PCR 产物
挑取 3 个阳性克隆进行扩大培养，菌液 PCR 扩增
并利用 w = 1%琼脂糖凝胶电泳检测插入片段大小，
委托上海英骏生物技术有限公司公司进行双向测
序。
1. 2. 4 数据分析 利用 SeqMan 7. 1. 0 软件对测序
数据进行拼接和质量矫正，并与 GenBank 中下载
到的江蓠科 16 个物种的 19 条 ITS 全长序列进行对
比分析，选择长心卡帕藻 Kappaphycus alvarezii
(GQ869849)作为外群 (GenBank获取号以及详细
信息见表 1 和表 2)。用 MEGA 4. 0 计算其碱基含
量和变异位点，并选择 Kimura 2-parameter 和 Com-
plete Deletion计算遗传距离。选择不同物种和不同
地理种群的序列用 ClustalX 1. 83 软件进行序列比
对，用 PAUP 4. 0 软件在 Modeltest 3. 7 中计算不同
核酸替代模型的似然值并筛选出最适核酸替换模
型，最终按 Akatke Information Criterion (AIC)结
果得到的最适核酸替换模型为 GTR + I + G (参数:
Base frequencies:A = 0. 268 6，C = 0. 170 8，G =
0. 237 2，T = 0. 323 4;substitution rate matrix:A －
C =1. 19 8，A － G = 2. 385 8，A － T = 1. 334 1，C
－ G =1. 143 2，C － T = 2. 868 0，G － T = 1. 000 0;
proportion of invariable sites = 0. 093 0，gamma pa-
rameter = 2. 510 4) ，利用以上数据在 PAUP4. 0 中
依据邻接法 (Neighbor joining，NJ)和最大似然法
(Maximum likelihood，ML)构建系统树，自举值
Bootstrap为 1 000 次重复。依据最大简约法 (Maxi-
mum parsimony，MP)构建系统树时在 PAUP 4. 0
中采用启发式搜索 (Heuristic search)的逐步加入
式算法 (Stepwise addition)分支交换法 (Branch
swapping algorithm)设定为树二等分再连接算法
(Tree bisection reconnection，TBR) ，每轮搜索最大
尝试次数为 1 000 次，每步保留 20 个树，自举值
Bootstrap为 1 000 次重复。
2 结果与分析
2. 1 ITS序列长度和 GC含量分析
ITS序列长度和 GC 含量分析结果见表 2。江
蓠科海藻 ITS 存在较为丰富的长度变异，长度在
893 ～ 1 508 bp 之间，其中龙须菜属龙须菜 Gp．
lemaneiformis和 Gp． tenuifrons 的 ITS 序列长度较其
他物种短，分别为 1 065 (1 066)bp和 893 bp;江
蓠科海藻 ITS1 序列长度在 121 ～ 568 bp之间，ITS2
序列长度在 585 ～ 984 bp之间，同一物种的 ITS2 序
列明显长于 ITS1 序列，且其 GC 含量明显高于
ITS1 序列。
相比 ITS1 和 ITS2 序列，江蓠科海藻的 5. 8S
序列长度较为稳定，除无管篱生藻 Gp． oryzoides、
细基江蓠 G． tenuistipitata 和智利江蓠 G． chliensis 3
个物种外，其他物种 5. 8S 序列长度均为 159 bp;
5. 8S序列 GC含量也明显高于 ITS1 和 ITS2 序列的
GC 含量。细基江蓠 G． tenuistipitata 5. 8S 序列为
139 bp，在 60 bp位点后缺失 19 个碱基，在 114 bp
处缺失一个碱基;智利江蓠 G． chliensis 5. 8S 序列
为 140 bp，在 60 bp 位点后缺失 19 个碱基;蓠生
藻属无管篱生藻 Gp． oryzoides 的 5. 8S 序列长 162
bp，在 102 位点之后增加了 3 个 T碱基 (见图 1)。
99
中山大学学报 (自然科学版) 第 51 卷
表 2 江蓠科物种 ITS序列长度及碱基组成1)
Table 2 Length and GC contents of ITS sequences of Gracilariaceaen species
种名
ITS1
碱基数
/bp
平均 GC
含量 /%
5. 8S
碱基数
/bp
平均 GC
含量 /%
ITS2
碱基数
/bp
平均 GC
含量 /%
总长 /bp
平均 GC
含量 /%
GenBank
获取号
来源
G. blodgettii 372 ～ 373 35. 7 159 49. 1 972 ～ 976 39. 1
1 504 ～
1 508
39. 3 见表 1 This work
G. vermiculophylla 524 ～ 527 33. 8 159 49. 1 742 ～ 745 37. 1
1 425 ～
1 430
37. 2 见表 1 This work
G. chouae 369 38. 7 159 49. 1 601 41. 1 1129 41. 5 见表 1 This work
G. tenuistipitata
var． liui
567 ～ 568 35. 7 159 49. 1 578 ～ 580 36. 7
1 307 ～
1 305
37. 8 见表 1 This work
G. tenuistipitata 568 35. 9 139 48. 9 578 36. 8 1 285 37. 8 GTU21343 Goff et al．［22］
G. chilensis 361 36. 0 140 50. 0 593 36. 3 1 094 37. 8 AF034265 Goff et al．［22］
G. verrucosa 156 33. 3 159 49. 1 778 40. 6 1 092 40. 7 U21342 Goff et al.［22］
G. domingensis 344 39. 8 159 49. 1 705 43. 6 1 208 43. 2
AF468913，
AF472420
Bellorin et al．［10］
G. aff. lacinulata 346 42. 0 159 49. 1 585 41. 7 1 090 42. 9 AF472419 Bellorin et al．［10］
G. aff. mammillaris 319 38. 2 159 49. 1 661 41. 2 1 139 41. 5 AF468916 Bellorin et al．［10］
G. aff. tepocensis 350 ～ 352 37. 7 159 49. 1 678 43. 0
1 187 ～
1 189
42. 3
AF472417，
AF472418
Bellorin et al．［10］
G. cervicornis 440 39. 0 159 49. 1 761 42. 2 1 360 42. 0 AF468917 Bellorin et al．［10］
G. foliifera var 360 43. 1 159 49. 1 649 42. 6 1 168 43. 6 AF468912 Bellorin et al．［10］
G. tikvahiae 351 38. 8 159 49. 1 624 42. 4 1 134 42. 2 AF468911 Bellorin et al．［10］
G. pacifica 327 44. 3 159 49. 1 745 42. 8 1 230 44. 0 U21341 Goff et al．［22］
Gp. lemaneiformis 250 36. 0 159 49. 1 666 ～ 667 44. 1
1 065 ～
1 066
42. 9
见表 1，
EU561239
This work ，
Li et al．［23］
Gp. tenuifrons 121 31. 4 159 48. 4 614 46. 9 893 45. 1 GTU21246 Goff et al.［22］
H. caudata 346 ～ 351 36. 9 159 49. 7 729 ～ 736 41. 5
1 239 ～
1 241
41. 3
AF468910，
AF468909
Bellorin et al．［10］
H. crassissima 328 37. 8 159 49. 7 727 42. 8 1 214 42. 3 AF468907 Bellorin et al．［10］
Gp. oryzoides 109 33. 1 162 48. 1 463 46. 4 734 44. 8 U33139 Goff et al．［22］
1)Gl．:Gracilariophila蓠生藻属;H．:Hydropuntia
2. 2 ITS序列比对分析
对所有江蓠科的 ITS 序列用 MEGA 4. 0 进行比
对，比对后序列长度为 1 781 bp (including gaps) ，
计算遗传距离结果显示，江蓠科各属内的种间遗传
距离明显大于种内遗传距离 (见表 3)。江蓠属各
物种的种内遗传距离在 0. 000 ～ 0. 012 之间，存在
0 ～ 36 个变异位点;细基江蓠繁枝变种和细基江蓠
G． tenuistipitata种间遗传距离为 0. 004，存在 25 个
变异位点，包括了 14 个种间区分位点;江蓠属其
他物种的种间遗传距离在 0. 041 ～ 0. 411 之间，存
在 111 ～ 611 个变异位点。龙须菜属的种内遗传距
离为 0. 000，龙须菜和 Gp． tenuifrons 种间遗传距离
为 0. 382。Hydropuntia中 H． caudata 种内遗传距离
为 0. 009，存在 14 个变异位点;H． caudata 和 H．
crassissima种间遗传距离为 0. 128，存在 252 个变
异位点。江蓠属与龙须菜属物种间的遗传距离在
0. 401 ～ 0. 554 之间。江蓠属与 Hydropuntia 物种间
的遗传距离在 0. 193 ～ 0. 409 之间。江蓠属与篱生
藻属物种间的遗传距离在 0. 527 ～ 0. 600 之间。龙
须菜属与 Hydropuntia物种间的遗传距离在 0. 382 ～
0. 535 之间。龙须菜属与篱生藻属物种间的遗传距
离在 0. 267 ～ 0. 406 之间。Hydropuntia 与篱生藻属
物种间的遗传距离在 0. 533 ～ 0. 578 之间。
在本文研究的江蓠属和龙须菜属 5 个物种的
23 个群体中，龙须菜 8 个群体 24 株个体的平均遗
传距离为 0. 000，存在 2 个变异位点;芋根江蓠 2
个群体 6 株个体的平均遗传距离为 0. 003，存在 12
个变异位点;脆江蓠 2 个群体 6 株个体的平均遗传
距离为 0. 000，存在 1 个变异位点;细基江蓠繁枝
变种 6 个群体 17 株个体的平均遗传距离为 0. 004，
001
第 4 期 李婷婷等:江蓠属和龙须菜属 5 种海藻 ITS序列分子系统学分析
图 1 江蓠科海藻 5. 8S核苷酸序列比对
Fig. 1 The alignment of 5. 8S among Gracilariaceaen species
存在 16 个变异位点;上述物种不存在群体区分位
点。真江蓠 5 个群体 13 株个体的平均遗传距离为
0. 002，13 个变异位点，且中国、俄罗斯和美国三
地的种群间存在 9 个稳定有效的信息位点，可区分
三地的群体 (见图 2) ，但在中国两野生真江蓠群
体间存在 6 个变异位点，均为个体的随机变异，并
无稳定有效的信息位点。
单独对江蓠科海藻的 5. 8S 序列进行分析，比
对后序列长度为 162 bp (including gaps) ，存在 36
个变异位点，其中包括了 14 个信息位点，序列比
对结果见图 1。江蓠属与龙须菜属物种间的遗传距
离在 0. 046 ～ 0. 084 之间，存在 7 ～ 11 个变异位点，
其中 4 个位点可进行属的鉴别。江蓠属与 Hy-
dropuntia物种间的遗传距离在 0. 006 ～ 0. 026 之间，
存在 1 ～ 4 个变异位点，其中有 1 个位点可进行属
的鉴别。江蓠属与蓠生藻属物种间的遗传距离在
0. 099 ～ 0. 116 之间，存在 13 ～ 17 个变异位点，其
中 12 个位点可进行属的鉴别。龙须菜属与 Hy-
dropuntia物种间的遗传距离在 0. 052 ～ 0. 080 之间，
存在 8 ～ 12 个变异位点，其中 5 个位点可进行属的
鉴别。龙须菜属与蓠生藻属物种间的遗传距离为
0. 073 ～ 0. 101，存在 11 ～ 15 变异位点，其中 7 个
位点可进行属的鉴别。Hydropuntia 与蓠生藻属物
种间的遗传距离为 0. 123，存在 18 个变异位点，
均可进行属的鉴别。在江蓠属中，除细基江蓠 G．
tenuistipitata、智利江蓠 G． chilensis 和 G． pacifica
外，其他物种的 5. 8S序列完全一致;细基江蓠 G．
tenuistipitata和智利江蓠 G． chilensis除碱基缺失外，
101
中山大学学报 (自然科学版) 第 51 卷
两者与其他江蓠属物种都存在一个位点的变异;
G． pacifica 与细基江蓠 G． tenuistipitata、智利江蓠
G． chilensis的遗传距离均为 0. 029，与其他江蓠属
物种间的遗传距离均为 0. 019，存在 3 个变异位
点。龙须菜属的龙须菜种内遗传距离为 0. 000，与
Gp． tenuifrons物种间的遗传距离为 0. 060，存在 10
个变异位点。Hydropuntia中 H． caudata和 H． cras-
sissima两物种 5. 8S 序列完全一致。所有江蓠科物
种的 5. 8S序列种内遗传距离都为 0. 000。
图 2 真江蓠不同地理群体间 ITS序列稳定有效信息位点
Fig. 2 The information sites of ITS sequences among the geographical populations of G． vermiculophylla
表 3 江蓠科海藻的种间遗传距离1)
Table 3 Genetic distance among Gracilariaceaen species
No． 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
1 －
2 0. 250 －
3 0. 366 0. 333 －
4 0. 367 0. 367 0. 364 －
5 0. 374 0. 372 0. 371 0. 004 －
6 0. 386 0. 386 0. 343 0. 064 0. 066 －
7 0. 053 0. 226 0. 357 0. 352 0. 359 0. 371 －
8 0. 115 0. 244 0. 352 0. 363 0. 367 0. 361 0. 102 －
9 0. 115 0. 213 0. 362 0. 348 0. 354 0. 347 0. 098 0. 142 －
10 0. 063 0. 222 0. 339 0. 343 0. 349 0. 352 0. 041 0. 102 0. 095 －
11 0. 088 0. 227 0. 334 0. 344 0. 349 0. 357 0. 072 0. 066 0. 112 0. 060 －
12 0. 145 0. 230 0. 361 0. 375 0. 381 0. 368 0. 139 0. 169 0. 091 0. 144 0. 125 －
13 0. 189 0. 258 0. 381 0. 405 0. 411 0. 409 0. 189 0. 192 0. 185 0. 189 0. 174 0. 189 －
14 0. 170 0. 258 0. 410 0. 383 0. 389 0. 385 0. 170 0. 177 0. 188 0. 188 0. 200 0. 219 0. 215 －
15 0. 200 0. 273 0. 401 0. 333 0. 339 0. 334 0. 207 0. 181 0. 196 0. 196 0. 211 0. 184 0. 188 0. 115 －
16 0. 246 0. 193 0. 359 0. 358 0. 361 0. 380 0. 242 0. 258 0. 214 0. 214 0. 233 0. 241 0. 266 0. 253 0. 250 －
17 0. 281 0. 226 0. 377 0. 393 0. 400 0. 409 0. 265 0. 294 0. 252 0. 252 0. 256 0. 277 0. 311 0. 294 0. 299 0. 128 －
18 0. 472 0. 468 0. 401 0. 488 0. 494 0. 471 0. 467 0. 450 0. 434 0. 434 0. 435 0. 466 0. 450 0. 504 0. 440 0. 472 0. 506 －
19 0. 488 0. 554 0. 516 0. 498 0. 504 0. 521 0. 513 0. 534 0. 500 0. 500 0. 494 0. 529 0. 515 0. 471 0. 487 0. 514 0. 535 0. 382 －
20 0. 546 0. 553 0. 536 0. 593 0. 600 0. 568 0. 554 0. 570 0. 545 0. 545 0. 546 0. 565 0. 556 0. 526 0. 527 0. 533 0. 578 0. 406 0. 267 －
1) 1:G． chouae;2:G． blodgettii;3:G． vermiculophylla;4:G． tenuistipitata var． liui;5:G． tenuistipitata;6:G． chilensis;7:
G． aff． Lacinulata;8:G． aff． Tepocensis;9:G． aff． Mammillaris;10:G． foliifera var;11:G． tikvahiae;12:G． domingensis;13:
G． cervicornis;14:G． pacifica;15:G． verrucosa;16:H． crassissima;17:H． caudate;18:Gp． Lemaneiformis;19:Gp． Tenui-
frons;20:Gl． oryzoides
201
第 4 期 李婷婷等:江蓠属和龙须菜属 5 种海藻 ITS序列分子系统学分析
图 3 江蓠科海藻 ITS 序列系统进化树 (MP)
Fig. 3 Phylogenic tree of Gracilariaceae based on ITS sequences by MP method
(●:养殖种群;▲:野生种群)
2. 3 ITS系统树构建
根据江蓠科物种 ITS 序列用 NJ、MP 和 ML 法
构建系统树，3 种方法聚类结果一致，仅列出 MP
法构建的系统树 (见图 3)。比对后总 1772 位点矩
阵，302 个稳定位点，91 个变异位点但无信息的位
点，1 379 个信息位点，启发式搜寻后最终获得 1
个最优简约树，步长为 5 435，一致性指数 (CI)
和严格性指数 (RI)分别是 0. 586 和 0. 765。从系
统树结构中可以看出，20 种江蓠科海藻可基本分
为 2 大分支，包括龙须菜属 /蓠生藻属分支，江蓠
属 /Hydropuntia分支。其中龙须菜属和蓠生藻属处
在系统树的最基部，说明其分化时间可能早于江蓠
属 /Hydropuntia。江蓠属 /Hydropuntia形成了 3 个小
的分支，分别是细基江蓠繁枝变种 G． tenuistipitata
var． liui分支、真江蓠 G． vermiculophylla 分支、脆
江蓠 G． chouae与芋根江蓠 G． blodgettii分支;青岛
与威海的野生真江蓠关系最近，其次是俄罗斯和美
国的养殖真江蓠，支持率分别为 100、84 和 100。
3 讨 论
江蓠科 4 个属 20 个物种 ITS 长度差异较大，
遗传距离和系统聚类分析结果显示，不同种、属之
间存在较为广泛的变异。Yamamoto 等［24］根据精子
囊窠的发生位置将江蓠属分为江蓠属、Hydropuntia
和龙须菜属。但在本研究中用 ITS 序列构建系统
树，结果显示 Hydropuntia 物种聚类到江蓠属内，
并未形成单独的分支，不存在明显的属间遗传分
化，但与龙须菜属 /蓠生藻属分别聚在两大分支上，
存在明显的属间遗传分化。这与之前报道的 SSU
rDNA、Rubisco spacer和 rbcL序列系统聚类的结果
是一致的［10，12，15］。在江蓠属系统分类中，江蓠属和
Hydropuntia海藻精子囊窠包括了 “V”型、 “T”
型和“P型”3 种类型，而龙须菜属精子囊窠则属
于“C型”［25］，在系统树中可以将其分为两组;但
江蓠属和 Hydropuntia 海藻并未按其精子囊窠排列
方式的类型而形成单独的分支，也没有形成与地域
分布相关的分支，这可能与这两个属存在着并系起
源关系有关。篱生藻属寄生于江蓠属、Hydropuntia
和龙须菜属海藻，其藻体内部构造和生殖结构同于
江蓠属、Hydropuntia 和龙须菜属［26］;蓠生藻属海
藻是从最初的宿主藻体进化而来［27］，在寄生过程
中可从宿主获取叶绿体，而保留自身的核基因组和
线粒体基因组［28］，Bellorin 等［10］认为篱生藻属与
龙须菜属海藻属于并系起源，至少有一个篱生藻属
301
中山大学学报 (自然科学版) 第 51 卷
物种是由龙须菜属演化而来;本研究也显示了同样
的结果。但是蓠生藻属海藻寄生过程中是否会与宿
主发生遗传物质的水平转移，以及在不同寄主中是
否多次发生遗传物质的水平转移还有待证实。
ITS序列无论是在序列长度还是变异程度上都
能很好地区分和鉴定江蓠科物种。细基江蓠和细基
江蓠繁枝变种的形态学主要差异是前者分枝 1 ～ 2
次，后者具有更多纤细的分枝;尽管细基江蓠和细
基江蓠繁枝变种的 ITS序列遗传距离低于江蓠科全
部海藻的种间差异，属于种内差异水平，但其存在
着 25 个变异位点，包括了 14 个种间区分位点，同
时细基江蓠 5. 8S 序列较江蓠属海藻缺失 20 个碱
基，显示出独特的序列结构，这可能意味着细基江
蓠与细基江蓠繁枝变种之间的分类地位还需要进一
步的研究确认。
江蓠科海藻 5. 8S 序列长度相对 ITS1 和 ITS2
保守，且种内和种间变异很小，存在着特定的稳定
属间区分位点，且对于具有并系关系的属 (江蓠
属 /Hydropuntia和龙须菜属 /蓠生藻属)也具有稳
定的区分位点，因此利用这些位点可以进行江蓠科
属水平上的分类鉴定。同样已报道的江蓠科 18S
rDNA序列，也存在这特定的属间区分位点，能够
很好地区分属 ［12］。
本研究显示，龙须菜、脆江蓠和真江蓠 (美
国和俄罗斯)的养殖群体的群体间和群体内变异
相比野生群体遗传变异较小，江蓠科海藻养殖主要
通过无性繁殖进行，不发生有性生殖过程的杂交以
及无性繁殖的遗传重组，这种养殖群体变异水平降
低的情况可能是由于养殖筛选的影响;但在细基江
蓠繁殖变种的养殖群体存在相对较高的遗传变异，
这可能是由于其自然分布和养殖主要集中在亚热带
和热带海域，生长速率和养殖继代频率高，导致其
群体 ITS序列变异幅度高于其他江蓠种群。在来自
中国、俄罗斯和美国三地的真江蓠群体中，存在着
9 个与地理分布相关的信息位点，可以进行群体的
有效区分。这与在真江蓠、提克江蓠 G． tikvahiae、
绳江蓠 Gp． chorda、张氏江蓠 G． changii的 cox1 和
rbcL基因序列存在的与地理位置相关的单倍型是一
致的［29 － 32］。但在青岛和威海的真江蓠野生群体间
并不存在种群间的稳定区分位点，因此，信息位点
在地理群体识别的方面应用需要考虑到群体数量以
及地理距离的因素。
4 前景展望
随着分子生物学研究的不断深入发展，核酸数
据的不断积累，利用单个或多个 DNA 序列并结合
物种形态学研究物种分类与系统进化，逐渐成为现
代生物学研究的有力工具。目前，DNA 序列分析
在藻类分类鉴定中得到了广泛的应用，对阐明系统
进化关系提供了重要的证据。但从分子系统学研究
手段本身而言，也存在很多需要进一步研究和探讨
的问题。不同类群同一 DNA 序列的进化速率有所
差异，同一类群中不同 DNA 序列的进化速率也不
相同，另外由于藻类早期演化中存在着线粒体和叶
绿体内共生现象，其在平行演化中又存在着并系起
源和直系起源现象，这为研究藻类系统发育与分化
增添了较大的难度。从多个层次以及多个基因位点
上系统地研究藻类形态结构进化、生态适应以及基
因进化的内在关系则显得更为重要和迫切。
参考文献:
［1］ FREDERICQ S，HOMMERSAND M H． Comparative
morphology and taxonomic status of Gracilariopsis
(Gracilariales，Rhodophyta) ［J］． J Phycol，1989，25:
228 － 241．
［2］ FREDERICQ S，HOMMERSAND M H． Proposal of the
Gracilariales ord． nov． (Rhodophyta)based on an analy-
sis of the reproductive development of Gracilaria verrucosa
［J］． J Phycol，1989，25:213 － 227．
［3］ FREDERICQ S，HOMMERSAND M H． Diagnoses and
key to the genera of the Gracilariaceae (Gracilariales，
Rhodophyta) ［J］． Hydrobiologia，1990，204 /205:173
－ 178．
［4］ FRESHWATER D W，RUENESS J． Phylogenetic rela-
tionships of some European Gelidium (Gelidiales，Rhodo-
phyta)species based on rbcL nucleotide sequences analy-
sis［J］． Phycologia，1994，33:187 － 194．
［5］ SAUNDERS G W，KRAFT G T． A molecular perspective
on red algal evolution:focus on the Florideophycidae［J］．
Plant Systematics and Evolution，1997，11:115 －138．
［6］ HARPER J T，SAUNDERS G W． Molecular systematics
of the Florideophyceae (Rhodophyta)using nuclear large
and small subunit rDNA sequence data［J］． J Phycol，
2001，37:1073 － 1082．
［7］ BIRD C J，RICE E L，MURPHY C A，et al． Phylogenet-
ic relationships in the Gracilariales (Rhodophyta)as de-
termined by 18S rDNA sequences［J］． Phycologia，1992，
31:510 － 522．
［8］ BIRD C J． A review of recent taxonomic concepts and de-
velopments in the Gracilariaceae (Rhodophyta) ［J］． J
Appl Phycol，1995，7:255 － 267．
［9］ BIRD C J，RAGAN M A，CRITCHLEY A T，et al． Mo-
lecular relationships among the Gracilariaceae (Rhodo-
401
第 4 期 李婷婷等:江蓠属和龙须菜属 5 种海藻 ITS序列分子系统学分析
phyta) :further observations on some undetermined spe-
cies［J］． Europ J Phycol，1994，29:195 － 202．
［10］ BELLORIN A M，OLIVEIRA M C，OLIVEIRA E C．
Phylogeny and systematics of the marine algal family
Gracilariaceae (Gracilariales，Rhodophyta) based on
small subunit rDNA and ITS sequences of Atlantic and
Pacic species［J］． J Phycol，2002，38:551 － 563．
［11］ IYER R，TRONCHIN E M，BOLTON J J，et al． Molec-
ular sysytematics of the Gracilariaceae (Gracilariales)
with emphasis on southern Africa［J］． J Phycol，2005，
41:672 － 684．
［12］ GUILLEMIN M L，AKKI S A，GIVERNAUD T，et al．
Molecular characterisation and development of rapid mo-
lecular methods to identify species of Gracilariaceae from
the Atlantic coast of Morocco［J］． Aquatic Botany，
2008，89:324 － 330．
［13］ BYRNE K，ZUCCARELLO G C，WEST J， et al．
Gracilaria species (Gracilariaceae，Rhodophyta) from
southeastern Australia， including a new species，
Gracilaria perplexa sp． nov．:Morphology，molecular
relationships and agar content［J］． Phycological Re-
search，2002，50:295 － 311．
［14］ WEINBERGER F，GUILLEMIN M L，DESTOMBE C，
et al． Defense evolution in the Gracilariaceae (Rhodo-
phyta) :substrate-regulated oxidation of agar oligosac-
charides ia more ancient than the oligoagar-activated oxi-
dative burst［J］． J Phycol，2010，46:958 － 968．
［15］ GARGIULO G M，MORABITO M，GENOVESE G，et
al． Molecular systematics and phylogenetics of Gracilari-
aceaen species from the Mediterranean Sea［J］． J Phy-
col，2006，18:497 － 504．
［16］ KIM M S，YANG E C，BOO S M． Taxonomy and phy-
logeny of attened species of Gracilaria(Gracilariceae，
Rhodophyta)from Korea based on morphology and pro-
tein-coding plastid rbcL and psbA sequences［J］． Phy-
cologia，2006，45 (5) :520 － 528．
［17］ GURGEL C F D，FREDERICQ S． Systematics of the
Gracilariaceae(Gracilariales，Rhodophyta) :A critical
assessment based on rbcL sequence analyses［J］． J Phy-
col，2004，40:138 － 159．
［18］ GURGEL C F D，LIAO L M，FREDERICQ S，et al．
Systematics of Gracilariopsis (Gracilariales，Rhodophy-
ta)based on rbcL sequence analyses and morphological
evidence［J］． J Phycol，2003，39:154 － 171．
［19］ ZUCCARELLO G C，URGER G B，WEST J A，et al．
A mitochondrial marker for red algal intraspecic rela-
tionships［J］． Molecular Ecology，1999，8:1443 －
1447．
［20］ 孙晓宇，罗丹，赵翠，等． 不同保存条件下五种大型
海藻的 DNA 提取和 PCR 分析［J］． 分子植物育种
(online) ，2011，9(95) :1680 － 1691．
［21］ COLEMAN A W，VACQUIER V D． Exploring the phy-
logenetic utility of ITS sequences for animals:A test
case for abalone (Haliotis) ［J］． Journal of Molecular E-
volution，2002，54:246 － 257．
［22］ GOFF L J，MOON D A，COLEMAN A W． Molecular
delineation of species and species relationships in the
red algal agarophytes Gracilariopsis and Gracilaria
(Gracilariales) ［J］． J Phycol，1994，30(3) :521 －
537．
［23］ 李敏，隋正红，易恒，等． 龙须菜 5． 8S rRNA 和 ITS
区的克隆与系统学分析［J］． 中国海洋大学学报:自
然科学版，39(1) :77 － 83．
［24］ YAMAMOTO H． The relationship between Graciariopsis
and Graciaria from Japan［J］． Bull Fac Fish． Hokkaido
Univ，1975，26:217 － 222．
［25］ ISABELLA A A，ZHANG Junfu，XIA Bangmei． Gra-
ciaria mixta，sp． nov． and other western Pacific species
of the genus (Rhodophyta:Gracilariaceae) ［J］． Pacif-
ic Science，1991，45(1) :12 － 27．
［26］ 夏邦美，张峻甫． 中国海藻志［M］． 北京:科学出版
社，1999:17．
［27］ GOFF L J，ZUCCARELLO G． The evolution of parasit-
ism in red algae:Cellular interactions of adelphopara-
sites and their hosts［J］． J Phycol，1994，30:695 －
720．
［28］ GOFF L J，COLEMAN A W． Fate of parasite and host
organelle DNA during cellular transformation of red al-
gae by their parasites［J］． The Plant Cell Online，
1995，7(11) :1899 － 1911．
［29］ YANG E C，KIM M S，GERALDINO P J L，et al． Mito-
chondrial cox1 and plastid rbcL genes of Gracilaria ver-
miculophylla (Gracilariaceae，Rhodophyta) ［J］． J Appl
Phycol，2008，20:161 － 168．
［30］ GURGEL C F D，FREDERICQ S． Phylogeography of
Gracilaria tikvahiae (Gracilariaceae，Rhodophyta) :A
study of genetic discontinuity a continuously distributed
species based on molecular evidence［J］． J Phycol，
2004，40:138 － 159．
［31］ KIM M S，YANG E C，KIM S Y，et al． Reinstatement
of Gracilariopsis chorda (Gracilariaceae，Rhodophyta)
based on plastid rbcL and mitochondrial cox1 sequences
［J］． Algae，2008，23(3) :209 － 217．
［32］ YOW Y Y，LIM P E，PHANG S M． Genetic diversity of
Gracilaria changii (Gracilariaceae，Rhodophyta) from
west coast，Peninsular Malaysia based on mitochondrial
cox1 gene analysis［J］． J Appl Phycol，2011，23:219
－ 226．
501