全 文 ：龙须菜 5.8S rRNA和 ITS 区的克隆与系统学分析
李　敏 , 隋正红1 , 易　恒1 , 张学成1 , 阎炳伦2 , 朱 　明2
(1.中国海洋大学海洋生命学院 , 山东 青岛 266003;2.淮海工学院海洋学院 , 江苏连云港 222005)
摘　要:　研究青岛产龙须菜居群内的遗传多样性和系统学分类 ,通过对龙须菜居群内不同个体的 5.8S rRNA-ITS 区(包
括 ITS1-5.8S rRNA-ITS2)进行 PCR扩增和序列分析 , 得到扩增 DNA 片段长度均为 1 066 bp ,包含完整的 ITS1(250 bp)、
5.8S(159 bp)和 ITS2(657 bp);利用 GenBank 数据库对 Gracilaria(江蓠属)和 Gracilariopsis 属共 20 个物种的 rRNA-ITS
相应序列进行了比较和系统进化分析。结果表明 ,龙须菜和江蓠科 19 个物种中 rRNA 的 5.8S 区的长度和序列非常保守 ,
而 ITS 区的长度和序列则变异较大 , 20 种江蓠科物种的遗传距离在 0.013 ～ 0.596 之间 ,龙须菜在 5.8S rRNA-ITS 区特性
上相比江蓠属物种与 Gracilariopsis属物种更为相似;采用 UPGMA 法构建了这 20 种江蓠科物种的系统发育树;分析结果
表明青岛产龙须菜的居群内不存在遗传差异 , 且应属于 Gracilariopsis 属 , 并且在江蓠科中较早分化 , 而龙须菜处于
Gracilariopsis属中比较古老的位置。
关键词:　龙须菜;江蓠科;5.8S rRNA-ITS;系统发育
中图法分类号:　Q75　　　　　文献标识码:　A　　　　　文章编号:　1672-5174(2009)01-77-07
　　江蓠属(Graci laria)红藻多为海产 ,在中国南北各
海区均有分布 ,生长在潮间带及大干潮线附近或以下 1
～ 3 m 处的岩礁 、石砾或贝壳上 ,江蓠属植物是制造琼
胶的主要原料。江蓠属物种龙须菜(Graci laria le-
manei formis),生长快 ,产胶量高 ,胶质好 ,是江蓠栽培
的首选良种 ,具有重要的经济价值。此外可以从中提
取藻红蛋白 、藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白等具有重要医用
和药用价值的成分 ,还可以用做鲍鱼的饵料 。目前已
成为第三大海藻栽培物种 ,市场潜力巨大 ,有很好的发
展前景[ 1-3] 。
真核生物的 rRNA 基因(rDNA)是高度重复的串
联序列单位 ,由 18S 、5.8S 和 28S rRNA 联结组成 1个
转录单位 ,彼此被转录单元内间隔(internal transcribed
spacer , ITS)区分开 。其中核糖体 RNA 中的内转录间
隔区(ITS)序列的进化速率较快 ,存在种内多态性 ,已
被广泛用于探讨属内种间甚至种下个体间的遗传关
系。在动物 、高等植物 、真菌以及藻类等种质鉴定及系
统进化研究中发挥了重要作用 。此外 ,在对许多高等
植物(尤其是中草药类植物)的 rDNA-ITS 区序列分析
发现 , ITS还与物种的功能性有关 。目前国内利用 rD-
NA-ITS 序列对大型海藻进行系统进化分析 、种质鉴定
和功能相关性研究报道极少 ,在红藻的遗传分子检测
中 ,国内外的研究多集中在基于 rbcL 以及 SSU-rRNA
基因构建系统树[ 4-6] ,且研究结果存在差异 ,还没有利
用 rDNA-I TS 区序列的差异对江蓠属红藻进行遗传系
统研究的报道。另外 ,由于龙须菜在世界范围内分布
广泛 ,有关龙须菜的进化地位存在争议[ 7] , Papenfuss[ 8]
认为 Graci lariopsis是属于江蓠属内的 ,但是最近几年
的研究结果显示越来越多的研究者认为 Graci lariopsis
是独立于江蓠属分支外的单独属种 。Gurgel就将江蓠
科(Gracilariaceae)分 成 Melanthalia 和 Curdiea ,
Gracilariopsis , Graci laria 3 个类群[ 9] 。因此本研究
的目的是通过对龙须菜野生株的 rDNA-I TS 序列进行
分析 ,并通过与 GenBank 数据库中已经公布的其它江
蓠 rDNA-ITS 序列的比较 ,为江蓠的系统进化 、种质鉴
定及功能性研究提供新的证据。
1　材料与方法
1.1 实验材料及试剂
野生型龙须菜采自青岛湛山湾 。引物由上海英骏
生物技术有限公司合成 ,其它化学试剂均为分析纯。
1.2 材料的选择和处理
在青岛湛山湾约 250 m2 范围内均匀分散分布的 5
个位点采样 ,每个采样点选取 1株新鲜龙须菜 ,刷去污
物后用消毒海水及清水洗净后备用。
1.3 DNA的制备 采用蛋白酶 K法
参照 Gof f等[ 10]方法 ,略有改动。取 1 g 处理后藻
体 ,在液氮中充分研磨后 ,加入大约 2 mL 提取缓冲液
[ 4% SDS , 0.05 mol/ LTris.HCl , pH8.0 , 0.1 mol/L
基金项目:国家高技术研究发展规划项目课题(2006AA10A413);山东省教学改革研究课题(B05009);江苏省海洋生物技术重点建设实验室开放
课题(2007HS005)资助
收稿日期:2008-04-16;修订日期:2008-05-21
作者简介:李　敏(1983-),女 ,硕士生。 E-mai l:andyamymin@hotmail.com;Tel:13668874093
通讯作者:E-mail:suizhengh@ouc.edu.cn
　 第 39卷　第 1期 　
2009年 1月　
中 国 海 洋 大 学 学 报
PERIODICAL OF OCEAN UNIVERSIT Y OF CHINA
39(1):77～ 83
Jan., 2009
EDTA ,0.2 mol/L NaCl] ,加蛋白酶 K(终浓度 100 μg/
mL), 50 ℃水浴间断震荡 3.5 ～ 4 h 。12 000 r/min 离
心 10 min ,取上清液 ,加等体积的酚抽提 ,12 000 r/min
离心 10 min ,取上清液 ,再以酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶
1)及氯仿抽提 , 12 000 r/min离心10 min ,取上清液 ,加
入二倍体积的无水乙醇和 1/10 体积的 NaAc使 DNA
沉淀 ,离心 ,用 70%的乙醇洗沉淀 2次 ,干燥后 ,溶解在
50 μL 无菌 TE(10 mmol/LT ris , 0.1 mmol/L EDTA ,
pH 8.0)中 , -20 ℃储存备用 。
1.4 5.8S rDNA和 ITS的 PCR扩增
根据GenBank数据库中相近物种 Gracilaria gracilis 、
Gracilaria verrucosa 等的18S和28S保守区设计PCR扩增
引物为:18S:5 -TCTTTTGGCTTGAACTTGGTC-3′;28S:
5-CGGGTCG(A)TCTTGTCTGATTTG-3′
采用 25 μL 反应体系 ,其中含 MgCl2 2.5 mmol/ L ,
dNTP(dATP , dTTP , dCTP , dGTP)各 100 μmol/L , 总
DNA 25 ng ,引物 0.2 μmol/L 和 Taq DNA聚合酶1U ,用
thermo cycle PCR扩增仪进行扩增。PCR扩增条件:94
℃预变性 5 min;94 ℃预变性 1 min ,60 ℃退火1 min ,72
℃延伸 1 min 30seconds ,30个循环;最终于 72 ℃延伸 5
min。PCR扩增产物用 1%琼脂糖进行电泳检测。
1.5 PCR产物的克隆和测序
PCR扩增产物用 TaKaRa 凝胶回收试剂盒(Agarose
Gel DNA Purification Kit)回收后用 T4 DNA连接酶将目
标片段连接到质粒载体 pMD 18-T 上 ,转入细菌 DH5α,
经过氨苄青霉素抗性筛选 ,挑取单菌落以 PCR反应检测
分子量 ,克隆产物由上海英骏生物公司测序。
1.6 5.8S rDNA 和 ITS 片段的序列分析及系统树构建
将 测 得 的 序 列 (GenBank Accession No.
EU561239)和其他来自 GenBank公共数据库的江蓠科
物种 5.8S rDNA-ITS 序列用计算机软件进行序列对齐
排序 、系统进化树构建 、遗传距离值计算分析 。用
BioEdi t(verson7.0.5.2)包含的 Clustal W package进行
多序列对位分析;Gap open penal ty =15 , gap extend
penalty =6.66 。采用 MEGA 3.1 Unw eighted Pair-
G roup Method (UPGMA)建树 ,Kimura 2-parameter 计
算遗传距离值 ,重复 1 000次计算靴带值 。分析所用江
蓠科物种特性见表 1 。
表 1　各江蓠物种 rDNA+ITS 长度和 GC 含量
Table 1　Leng th and GC contents of rDNA+ITS of Gracilaria (Gracilariopsis)species
种名
SPecies name
总长
To tal
leng th
GC% ITS1 GC% 5.8S GC% IT2 GC%
NCBI 登录号
NCBI
Accession
来源 source
G.lemaneiformis 1 066 42.96 250 36.00 159 49.06 657 44.14 EU561239 Qingdao
G.vermiculophy lla 1 425 36.14 524 32.82 162 48.15 739 35.86 AY465829 Japan
G.sp.Mexico 1 422 37.27 521 33.97 160 48.75 741 37.11 AF468906 Mexico
G.domingensis 1 205 43.24 340 40.00 160 48.75 705 43.55 AF472420 Ceara
G.af f.Lacinulata 1 082 43.07 342 42.11 160 48.75 580 42.07 AF472419 Cumana
G.sp.Araya 1 312 43.83 426 41.08 160 48.75 726 44.35 AF468918 Araya
G.cervicornis 1 357 42.00 436 39.22 160 48.75 761 42.18 AF468917
G.foliifera 1 165 43.61 356 43.26 160 48.75 649 42.53 AF468912 Santa Catarina
var.angustissima rina
G.tikvahiae 1 131 42.18 347 38.90 160 48.75 624 42.31 AF468911
G.caudata strain Santa 1 238 41.44 342 36.84 160 49.38 736 41.85 AF468910
Catarina
G.af f.tepocensis strain 1 186 42.16 348 37.64 160 48.75 678 42.92 AF472418
Sao Paulo4B
G.crassissima 1 211 42.11 324 37.96 160 49.38 727 42.37 AF468907
G.caudata strain Araya 1 236 41.26 347 37.18 160 49.38 729 41.43 AF468908 Araya
G.caudata strain Co ro 1 238 41.28 346 37.28 160 49.38 732 41.39 AF468909 Co ro
G.af f.mammillaris 1 136 42.78 321 43.30 150 48.00 665 41.35 AF468914 Sao Paulo
strain Sao Paulo
G.sp.Buzios 1 057 43.05 304 40.79 160 48.75 593 42.66 AF468915 Buzios
G.af f.mammillaris 1 136 41.46 315 38.41 160 48.75 661 41.15 AF468916 Co ro
strain Coro
G-opsis.tenuifrons 911 44.86 116 31.3 153 47.71 635 46.77 GT U21246 Venezuela
G-opsis.sp.Plymouth 873 43.53 118 27.97 154 48.05 601 45.42 GSU21339 England
G-opsis.lemaneifo rmis 832 40.02 117 26.50 155 48.39 560 40.54 GLU21243 USA
78 中　国　海　洋　大　学　学　报 2 0 0 9 年
791期 李　敏,等:龙须菜 5.8S rRNA和 ITS 区的克隆与系统学分析
图 1　20种江蓠科物种 5.8S 和 ITS 序列比对
F ig.1　The alignment of 5.8S and ITS sequences of 20 G racilariaceae species
(图中方框部分为 5.8S , →示 ITS1区间;※示 ITS 2区间
1 G.vermiculophyl la 2 G.domingensis 3 G.af f.Lacinulata 4 G.sp.Araya 5 G.cer vicornis 6 G.folii f era var.angustissima
7 G .t ikvahiae 8 G.caudata st rain Santa Catarina 9 G.af f.tepocensi s st rain Sao Paulo4B 10 G.sp.Mexico 11 G.crassissima
12 G.lemaneiformis(Qingdao)13 G.caudata st rain Araya 14 G.caudata strain Coro 15 G.a f f.mammillaris st rain Sao Paulo 16 G.sp.Buzios
17 G .af f .mammillaris strain Coro 18 G.-opsis ten ui f rons 19 G .-opsis sp.Plymouth(England)20 G.-opsis lemanei formis(USA))
2　结果与讨论
2.1 龙须菜种群内 5.8S rDNA 和 ITS 片段序列分析
经测序检测 5 株青岛产野生型龙须菜的 5.8S
rDNA和 ITS 序列片段完全一致 ,长度均为 1 066 bp ,
GC含量为 42.96%,Blast 同源性分析结果表明所克隆
rDNA 片段含完整的 ITS1 、5.8S和 ITS2 区 ,确定的各
段 rDNA 和 ITS 序列的边界见图 1。说明在同一地点
的龙须菜居群内不存在遗传差异性 ,在稳定的环境条
件下 ,龙须菜的变异率较小 ,遗传特性稳定 。这与某些
动物存在居群内遗传差异的现象不同 ,王师等[ 11]对栉
孔扇贝(Chlamys farreri)的研究结果发现山东长山栉
孔扇贝居群内 ITS 序列区存在多个位点(SAn)n 形式
(S 代表 C 或 G)的碱基多态性 ,但是未发现有其他报
道在红藻内存在与动物中类似的现象。
2.2 江蓠科物种 5.8S rDNA ITS 序列的比较分析
龙须菜以及从 GenBank 获得的其它江蓠科物种的
rDNA 和 ITS 序列的长度及GC含量见表1。从表 1中
可以看出 ,几种江蓠属红藻 5.8S 片段的长度基本一
致 ,均为 160 bp左右 ,龙须菜 5.8S长度为 159 bp , 3种
Gracilariopsis属江蓠的 5.8S 区比其余江蓠物种长度
稍短 ,在 154 bp左右 ,各江蓠物种的 5.8S rDNA 序列
的GC含量为 47.71%～ 49.38%,变化不大。
从CLUS TALx1.83比对结果(见图1)中看出江蓠
属内的 5.8S 区非常保守 ,只有 1个位点出现了 C和 T
的碱基替换;在 3种 Gracilariopsis属之间存在 3个位
点的碱基差异 ,有 1个位点是 C碱基与 T 碱基间的替
换 ,另外两个位点是 G碱基与 C 碱基间的替换。与江
蓠属物种对比 ,在龙须菜 5.8S 区域中存在 7个位点的
碱基变异 ,且大部分集中在碱基C 与 T 之间的替换;而
龙须菜和 3 种 Graci lariopsis 属江蓠比对其中只有 4
个碱基与其它 3种不同 ,其中有 3 个位点均是由 C 碱
基代替了 T 碱基。由 5.8S 的保守性可见龙须菜与
Gracilariopsis属江蓠间的差异更小。同时 ,江蓠科保
守的5.8S区内碱基 T 和 C之间的替换发生频率较高。
由于选定的各江蓠属物种地理位置差异较大 ,
rDNA的 ITS1和 ITS2区在长度和碱基序列上都有较
大的变异 , ITS1区的长度在 304 ～ 524 bp 之间;ITS2
区的长度为 580 ～ 761 bp;同 ITS1相比 I TS2区的 GC
含量较为稳定 ,均在 42%左右。3种 Gracilariopsis属
江蓠 ITS1序列长度和 GC 含量均明显少于江蓠属物
种 , ITS2序列长度没有明显差别 ,GC 含量却较高。龙
须菜的 ITS1 区序列也较短为 250 bp , GC 含量为
36%,二者均小于大部分的江蓠属物种;同 Graci lari-
opsis属一样 ,龙须菜 I TS2序列长度与江蓠属没有明显
差别 ,GC 含量较高 。
从CLUSTALx1.83比对结果上(见图1)看龙须菜
与江蓠属物种相比 ITS 区的碱基序列变异程度较高 ,
80 中　国　海　洋　大　学　学　报 2 0 0 9 年
但是与 3种 Gracilariopsis属江蓠相比 ITS 区的碱基
变异明显较少。综上所述 ,龙须菜在 5.8S rDNA-ITS
区特性上相比江蓠属物种与 Gracilariopsis 属物种更
为相似。
这种 ITS 序列高变区和 5.8S 保守区交替出现的
方式 ,为种质鉴定和遗传进化分析提供了很大方便。
5.8S 区的保守性可以通过序列测定来进行物种的分
类 ,而 ITS 区的高变异性又可以使我们方便地通过分
析 ITS 区的序列变异来判断各品系之间的系统进化关
系[ 12] 。 ITS1和 ITS2 片段的长度有限 ,各自所能提供
的信息有限 ,因此将这 2 个片段及 5.8S 片段综合起
来分析 ,以 NJ法和 ME 法重建系统树 ,可以为江蓠属
遗传检测提供丰富的信息 。
2.3 系统进化关系
青岛产龙须菜与另外16种江蓠属 、3种 Gracilariopsis
属红藻(G.-opsis lemanei formis 、G.-opsis tenuifrons 、G.-
opsis sp.Ancon)的 rDNA+ITS ,用 UPGMA 、NJ法和 ME
法构建的系统树(见图 2)结构完全相同 ,且除个别节点外
大部分节点的支持率都很高。从整体系统进化树上分析
G.vermiculophylla 与 G.sp.Mexico 遗传关系较近聚
成 1支 ,且二者 rDNA+ITS总的G+C%最小。 G.le-
manei formis 与 G.-opsis lemaneiform is , G.-opsis
tenui formis , G.-opsis sp.Ancon这 3种 Graci lariopsis
属江蓠聚成单独 1支。 Gracilariopsis 属处在系统树的
最基部 ,说明该集团先于江蓠科其它物种分化 ,是比较
原始的 1个属种 ,青岛产龙须菜是其中最早分化的 1
个物种 ,与它关系最近的是产自美国的 G.-opsis le-
manei formis ,但二者由于地理位置相距较远故存在一
定的遗传距离 ,这与 Goff[ 7 , 13 ,14] 等人对其他产地的龙
须菜间的分子系统研究结果一致 。
图 2　用 UPGMA(NJ、ME)法根据 5.8S rDNA+ITS 序列构建的江蓠科物种系统树
Fig.2　Phylogenic tree of G racilariaceae species based on 5.8S rDNA+ITS sequences
(分支上的数字表示 1 000次重复抽样所获得的靴带值;Values above the branches represent percentage of 1 000 bootst rap resamplings)
　　龙须菜的分类地位一直以来存在分歧[ 7] , 与
Gargiulo等[ 15] 的分类结果不同的是龙须菜(G.le-
manei formis)与其余各种江蓠遗传距离都较远 , 均
>0.46(见表 2),与其他江蓠属物种 G.sp , G.tikvahi-
ae 并不聚类而是与 Gracilariopsis属物种聚类 ,因此龙
须菜应该是属于独立于江蓠属(Graci laria )之外的
Gracilariopsis 属 , 这与 Gurgel[ 6] 等人的研究结果一
致。
与龙须菜不同的是 G.af f.Lacinulata 与 G.
af f .tepocensis strain Sao Paulo4B , G .af f .mammil-
laris st rain Co ro 与 G .af f .mammil laris st rain Sao
Paulo 却处于不同的分支上 ,说明这 2 种江蓠种内变异
较高 ,这可能与他们的地理位置相差较远有关 ,在环境
因素的趋同影响下 ,地理位置较近的往往趋向于聚为
同一支 ,随着进化时间的推进和环境因素的影响 ,距离
较远的逐渐分化成不同的地理群 。
同Gurgel、Gargiulo[ 15-17]等构建的江蓠系统树比较推
测江蓠科物种在进化史上可能是多起源的 ,3个不同类
群(Melanthalia 和 Curdiea , Gracilariopsis , Gracilaria)
811期 李　敏,等:龙须菜 5.8S rRNA和 ITS 区的克隆与系统学分析
的江蓠物种可能起源于不同地理群的祖先 ,龙须菜所在
的单起源 Graci lariopsis属较早出现了分化 ,逐步进化成
独立于另外 2个江蓠属群的单独一支。这可能也是不
同地理位置的江蓠属红藻存在较大的遗传差异的原因。
表 2　江蓠科物种间的遗传距离
Table 2　Genetic distance among species of G racilariaceae
　　　　(数字所指物种同图 3;Numbers stand for the species the same as those in Fig.3)
　　赵国平 、刘玉萍 、张英等[ 18-20]对当归 、川芎 、广藿香
等药用植物 rDNA-ITS 的研究发现:同一属内的药用
植物其功效相似的分子系统学证据证明其亲缘关系较
近 ,反之则较远 ,表明同属内的物种其性状可能与物种
间的亲缘关系有关。 G .verm iculophyl la 与 G.sp.
Mexico的遗传距离最近 ,仅为 0.003 ,龙须菜 、G.ver-
miculophyl la与 G.tikvahiae 外型相近 ,两者都是较好
的产琼胶品系[ 23 ,24] ,而且在他们的细胞内都发现了质
粒的存在 ,但是二者的距离相差较远为 0.610(见表
2)。这说明江蓠属品种在功能上与遗传距离不存在关
联性。而目前对江蓠属其他活性成分的研究较少 ,所
以暂时无法鉴定其亲缘关系与活性成分差异之间是否
存在相关性。
2.4 结论
随着生物种群的不断进化 、发展以及分子生物学
技术的进步 ,利用具有物种特异性的 DNA序列结合形
态学 、细胞学和化石记录等方面的证据从多角度来分
析 ,能够使分析结果更接近物种的系统发育历史。 rD-
NA和 I TS 区序列保守与多变交替的特征能够为物种
的系统发育史提供可靠的依据 ,更是种类鉴定的有力
工具 。
本研究对来自中国青岛地区的龙须菜样品的 rD-
NA和 ITS 序列进行了研究 ,并与 GenBank 数据库中
的其余江蓠科红藻进行了比对分析 。结果表明 ,在青
岛产龙须菜的居群内不存在遗传差异性 ,但是在江蓠
科大型红藻中 5.8S 比较保守 , ITS 序列具有多态性。
龙须菜应该是属于独立于江蓠属(Graci laria)之外的
Gracilariopsis 属 ,这为确定青岛产龙须菜的分类地位 ,
同时为鉴定江蓠科内不同属红藻提供了可靠依据 。
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Cloning and Sequence Analysis of 5.8S rRNA and ITS region between
18S and 28S rRNA of Gracilaria lemaneiformis (Rhodophyta)
LI Min , SUI Zheng-Hong1 , YI Heng1 , ZHANG Xue-Cheng1 , YAN Bing-Lun2 , Zhu Ming
(1.College of Marine Life Sciences , Ocean University of China , Qingdao 266003 , China;2.Huaihai Institute of Technology , Lian
Yungang 222005 , China)
Abstract:　For the purpuose of investigating genet ic diversity and relationship in Gracilaria lemanei formis
populat ion of Qingdao.The 5.8S rRNA ITS region(including ITS1-5.8S rRNA-ITS2)of individuals between
18S and 28S rDNA of dif ferent st rains wi thin the population of Gracilaria lemanei form is were amplified and
analy zed.The whole sequence was 1 066 bp in leng th , including 250 bp of ITS1 , 159 bp of 5.8S and 657 bp of
ITS2.Phylogenetic analysis w as done by using the sequence of rDNA-ITS region f rom 20 different species of
Gracilaria and Gracilariopsis adopted f rom Genbank database Sequence analy sis showed that there w as no ge-
netic difference wi thin the population of Gracilaria lemanei formis.The sequences of 5.8S were highly con-
served among Gracilaria lemanei form is and 19 Gracilariaceae species.While the I TS regions varied f rom the
nucleo tide acid to the sequence length.The genetic distances betw een 20 Gracilariaceae species w ere between
0.013 and 0.596.Graci laria lemanei formiswas much similar to Gracilariopsis species than to Graci laria
species referring to the 5.8S rRNA ITS characters.The UPGMA phy logenic t ree w as const ructed of the 20
Gracilariaceae species.The result indicated that Graci laria lemanei formis of Qingdao strain should be included
in the genus Graci lariopsis , which evolved earlier from the family Gracilariaceae.Gracilaria lemanei formis
was situated at an ancient position wi thin the clade.
Key words:　Graci laria lemanei formis;Gracilariaceae;5.8S rRNA-ITS;phylogenic
责任编辑　于　卫
831期 李　敏,等:龙须菜 5.8S rRNA和 ITS 区的克隆与系统学分析