全 文 ：收稿日期:2011-03-17; 修订日期:2011-10-20
基金项目:河南省重点科技攻关资助项目(No． 082102310033)
作者简介:李喜凤(1952-) ，女(汉族) ，河南郑州人，现任河南中医学院教
授，学士学位，主要从事中药新药及其质量标准的研究工作．
蒲公英属植物 rDNA ITS序列测定及分析
李喜凤1，杜云锋2，张红梅3，郝 哲1
(1．河南中医学院，河南 郑州 450008;
2．河南省人民医院，河南 郑州 450003; 3．河南省医药科学研究院，河南 郑州 450052)
摘要:目的 研究蒲公英属内 4 种植物的 rDNA ITS序列遗传差异性，为探讨蒲公英属植物的系统演化关系、分类、品种鉴
定提供 DNA分子依据。方法 提取不同产地的蒲公英总 DNA，以核糖体基因组 ITS通用引物为引物进行扩增，扩增产物
经纯化后，用 PCR产物直接测序法进行测序。结果 蒲公英属植物 ITS序列总长度约为 641 ～ 642 bp，其中 ITS － 1 长度为
255 ～ 256 bp，5． 8S长度为 162 bp，ITS － 2 长度为 224 bp。序列间共有 23 个变异位点。运用 DNA Star软件进行系统分析
得到蒲公英属内 4 种植物的系统进化树，这一分析结果与来自形态学的研究结果基本吻合。结论 此法可用于蒲公英属
植物种间及真伪品鉴别。
关键词:蒲公英; 核糖体 DNA; ITS序列; 分子鉴定
DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2012． 03． 092
中图分类号:R284． 1 文献标识码:B 文章编号:1008-0805(2012)03-0714-02
蒲公英来源于菊科植物蒲公英 Taraxacum mongolicum Hand．
－ Mazz．、碱地蒲公英 Taraxacum sinicum Kitag． 或同属数种植物
的干燥全草［1］。据不完全统计，全世界约有蒲公英 2000 种，我国
有一百余种。由于蒲公英属植物形态特征相似，分类鉴别难度较
大。而常规的理化性质鉴别分类存在主观性强、重复性和稳定性
差等缺点。
近年来，随着生命科学的不断发展，DNA指纹分析技术和分
子标记技术广泛应用于药用植物种质鉴定，这为中药材品种鉴定
和揭示药用植物的遗传变异提供了新的方法和手段，而其中 rD-
NA ITS (internal transcribed spacer)序列进化速度较快，被广泛
应用于药用植物种内、种间及近缘属间的分子生物学研究［2］。
为此，本文对蒲公英属 4 种植物 13 个产地的蒲公英，采用 PCR
扩增以及测序技术进行了 rDNA ITS 序列的测定与分析，从分子
水平比较了不同品种、不同产地的差异，为蒲公英的种质资源道
地性的鉴定、质量控制以及蒲公英的 GAP的实施提供科学依据。
1 材料与试剂
1． 1 材料 实验材料为 2009 年 3 ～ 6 月采自河南省不同地区的
野生蒲公英，经河南中医学院药学院陈随清教授鉴定。取其幼嫩
叶片，用硅胶快速干燥后备用。材料名称及来源见表 1。每居群
5个个体，个体之间空间距离不小于 10 m，其中有 4 个居群限于
实际分布数量，个体数为 3 个，共计 13 个居群，57 个个体。
1． 2 仪器和试剂 DYY －6C型电泳仪，北京市六一仪器厂产品;
Gel Doc 2000TM型凝胶图像分析仪，德国 BIO － RAD 公司产品;
梯度 PCR仪，德国 Biometra 公司产品;GR22G 型高速低温离心
机，日本日立公司产品;微量移液器，德国 eppendorf 公司产品;
3730XL DNA全自动测序仪，美国 ABI公司产品;紫外投射仪，英
国 Uvitec公司产品。
CTAB(十六烷基三甲基溴化铵) ，上海山浦化工有限公司产
品;Tris(三羟甲基氨基甲烷) ，美国 Sigma 公司产品;EDTA(乙二
胺四乙酸二钠盐) ，美国 Amresco 公司产品;DL 15000 bp、DL
2000 bp DNA Marker，大连 TaKaRa 公司产品;Taq DNA 聚合酶、
大量琼脂糖凝胶 DNA回收试剂盒，北京天根生化科技有限公司
产品;琼脂糖，西班牙 Biowest 公司产品;其余化学试剂均为国产
分析纯。
表 1 材料来源
编号 产地 品种 个数 编号 产地 品种 个数
D 本学院药苑 蒲公英 3 P 漯河市区 蒲公英 5
F 焦作武陟县 蒲公英 5 Q 周口沈丘县 蒲公英 5
H 济源市区 蒲公英 5 R 安阳滑县 蒲公英 5
J 信阳罗山县 蒲公英 5 U 商丘市区 蒲公英 5
K 洛阳栾川 蒲公英 3 V 郑州市金水区 药用蒲公英 3
L 三门峡灵宝市 蒲公英 3 X 南阳内乡县 白缘蒲公英 5
O 济源九里沟 碱地蒲公英 5
2 方法
2． 1 DNA提取 取硅胶快速干燥的叶子，加液氮研磨成粉末后，
用改良的 CTAB法［3］提取基因组总 DNA，于 － 20℃冰箱保存，备
用。
2． 2 PCR扩增和产物纯化 利用 rDNA ITS区通用扩增引物 P1、
P2 进行该序列的扩增，引物序列分别为 P1:5 － CGT AAC AAG
GTT TCC GTA GGT GAA C － 3，位于 18S 上;P2:5 － TTA TTG
ATA TGC TTA AAC TCA GCG GG －3，位于 26S上［4］。
反应体系(以 50 μl反应体系为例) :10 × Taq Buffer 5 μl，2． 5
mmol /L dNTPMixture 4 μl，Taq酶(2． 5 U /μl)1 μ;，10 μmol /L引
物 P1、P2 各 1 μl，DNA 模板(20ng /μL)5 μL，dd H2O 33 μ;。
PCR扩增条件:95℃预变性 4 min;94℃变性 1 min，52℃复性 45
s，72℃延伸 2 min，循环 30 次;然后 72℃延伸 7 min，以 dd H2O代
替模板作空白对照。扩增产物用北京天根凝胶 DNA回收试剂盒
进行 PCR产物的纯化，然后使用 1． 0%琼脂糖凝胶电泳检测，备
用。
2． 3 PCR产物 ITS序列的测定 经宝生物工程(大连)有限公司
ABI 3730XL DNA Analyzer测定仪，以 P1、P2 引物为测序引物，进
行 DNA序列的正向和反向测定，以保证测定序列的准确性，测序
结果递交 Genbank。
2． 4 序列数据的处理 13 个样品的序列比对应用 DNA Star分析
软件 Clustal W程序进行分析，并给予人工校正，绘制 ITS序列系
统进化树。
3 结果
3． 1 DNA 提取 从 13 个不同居群样品中提取的 DNA 经 1． 5%
的琼脂糖凝胶电泳，均得到一条约 15 kb的条带。结果见图 1。
3． 2 PCR扩增产物纯化 用通用引物 P1、P2 进行扩增，扩增产
物经北京天根公司的大量琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒纯化，均
得到约 750 bp的 rDNA的扩增产物。结果见图 2。
3． 3 蒲公英 ITS序列的长度和变异 根据 GenBank 中已登录的
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时珍国医国药 2012 年第 23 卷第 3 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2012 VOL． 23 NO． 3
药蒲 公 英 Taraxacum officinale Wigg． (Genbank:AY548211、
AY862583、L48337． 1、L48338． 1)确定 rDNA 内转录区 ITS1 和
ITS2 与 3 个编码区 18S、5． 8S、26S 的界限。测得蒲公英 13 个产
地样品的 ITS1、5． 8S、ITS2 全序列及 18S、26S部分序列，共约 641
－ 642bp。对其 ITS区序列进行分析比较后显示，ITS － 1 约为 255
－ 256bp，5． 8S rDNA为 162bp，ITS － 2 为 224bp，共有 23 个碱基位
点发生了变异，其中 7 个位点为碱基颠换，1 个碱基缺失，另外 15
个位点为碱基转换。ITS － 1 有 12 个变异位点，ITS － 2 变异位点
有 11 个，5． 8S无变异位点。蒲公英 ITS － 1(GC)%量在 54． 90%
～ 55． 29%，ITS － 2(GC)%量在 49． 11% ～ 50． 45%［5］。
图 1 蒲公英总 DNA提取物电泳图谱
图 2 PCR扩增 ITS序列
3． 4 不同种源蒲公英的亲缘关系 不同产地的蒲公英 rDNA ITS
序列用 DNA Star软件包中的 MegAlign 软件采用 Clustal W 法计
算各序列间的遗传距离，各样品间的遗传距离在 0． 0% ～ 3． 4%。
结果见表 2。将上述 16 个不同产地蒲公英碱基序列用 Clustal W
法构建系统发育树。结果见图 4。系统树显示，郑州市金水区药
用蒲公英(O)首先与济源市碱地蒲公英(V)聚在一起，这说明两
者的亲缘关系较近;而蒲公英按不同产地聚在一起，南阳内乡白
缘蒲公英(X)与蒲公英聚在一起，这说明白缘蒲公英与蒲公英的
亲缘关系比较近，而这一结果与形态学分类结果基本吻合［6］。
表 2 不同产地蒲公英 ITS序列间的同源性和差异性 %
No． D F H J K L O P Q R U V X
D 99． 4 100 99． 9 100 99． 9 96． 8 99． 9 99． 4 99． 4 99． 6 97． 0 99． 9
F 0． 6 99． 4 99． 6 99． 6 99． 6 96． 7 99． 6 100 100 100 96． 8 99． 6
H 0． 0 0． 6 99． 9 100 99． 9 97． 0 99． 9 99． 4 99． 4 99． 6 97． 0 99． 9
J 0． 1 0． 4 0． 1 100 100 97． 1 100 99． 6 99． 6 99． 6 97． 3 100
K 0． 0 0． 4 0． 0 0． 0 100 97． 2 100 99． 6 99． 6 99． 6 97． 2 100
L 0． 1 0． 4 0． 1 0． 0 0． 0 97． 1 100 99． 6 99． 6 99． 6 97． 3 100
O 3． 2 3． 4 3． 1 2． 9 2． 8 2． 9 97． 1 96． 7 96． 7 96． 8 99． 9 97． 1
P 0． 1 0． 4 0． 1 0． 0 0． 0 0． 0 2． 9 99． 6 99． 6 99． 6 97． 3 100
Q 0． 6 0． 0 0． 6 0． 4 0． 4 0． 4 3． 4 0． 4 100 100 96． 9 99． 6
R 0． 6 0． 0 0． 6 0． 4 0． 4 0． 4 3． 4 0． 4 0． 0 100 96． 9 99． 6
U 0． 4 0． 0 0． 4 0． 4 0． 4 0． 4 3． 3 0． 4 0． 0 0． 0 96． 8 99． 6
V 3． 1 3． 2 3． 1 2． 8 2． 8 2． 8 0． 1 2． 8 3． 2 3． 2 3． 3 97． 3
X 0． 1 0． 4 0． 1 0． 0 0． 0 0． 0 2． 9 0． 0 0． 4 0． 4 0． 4 2． 8
图 4 蒲公英属植物 rDNA ITS系统树
4 讨论
ITS序列在蒲公英属植物系统学研究中的意义 我国蒲公英
资源丰富且分布广泛，随着气候的变化和地理环境的差异，从而
引起蒲公英较大的变异，而这些变异让蒲公英具有丰富的遗传多
样性，也就形成了不同的居群。不同居群的蒲公英 5． 8S 序列高
度保守，无变异位点，而 ITS － 1 和 ITS － 2 序列共有 23 个变异位
点。以上结果表明，蒲公英 ITS序列分析为蒲公英属植物种质资
源鉴别和分类提供了新方法和手段，得到的 ITS序列为蒲公英属
植物的分子生物学研究提供了理论依据［7］。
蒲公英品种间的聚类分析及遗传多样性 从分析结果中可
见，本学院药苑蒲公英(D)与济源市区(H)、洛阳栾川(K)和南
阳镇平县(S)序列基本相同，说明它们之间有较近的亲缘关系;
济源九里沟蒲公英(O)与焦作武陟蒲公英(F)的遗传距离高达
3． 4%，说明它们之间的亲缘关系较远。所得结果与传统的形态
学资料基本吻合。以上研究表明，ITS 序列分析在研究蒲公英属
植物种质资源鉴别、分类及种群间的亲缘关系等方面具有十分重
要的意义和应用前景，为进一步开发利用蒲公英种质资源提供了
参考。
参考文献:
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