全 文 ：收稿日期:2007-11-01
基金项目:贵州省优秀科技人才省长基金(2005185)资助。
作者简介:季祥彪(1962-), 男 ,副教授 , 主要从事植物种质资源研究
工作。
通讯作者:文晓鹏 , xpwen0121@yahoo.com.cn。
贵州 12种兰属植物资源形态学和 RAPD标记的比较分析
季祥彪 1, 2 , 王国鼎 1 , 康继川 1, 3 , 乔　光 1 , 文晓鹏 1
(1.贵州大学农业生物工程省建重点实验室 , 　贵阳 550025;
2.贵州大学生命科学学院 , 　贵阳 550025;3.贵州大学教育部生化工程中心 , 　贵阳 550025)
AComparativeStudyofRAPDandMorphologicalApproachestoCharacterize
theGeneticRelationshipsoftheTwelveSpeciesofCymbidiuminGuizhou
JIXiang-biao1, 2 , WANGGuo-ding1 , KANGJi-chuan1, 3 , QIAOGuang1 , WENXiao-peng1
摘要:采用 35个形态学形状和 272个 RAPD标记 ,对贵州 12种
兰属植物的亲缘关系进行研究。结果表明 ,引物 S13, S26及
S139扩增的谱带多 、清晰 、多态性明显 , 它们单独及结合使用 ,
能有效地将所有供试种类区分开来。 尽管这两种标记系统进
行亲缘关系分析时 , 存在一定的差异性 , 但仍具有很大的同一
性 , 经相关性检测 ,二者呈极显著相关。形态学形状分析显示 ,
莲瓣兰及春剑与菅草兰的亲缘关系高度同源 , 这一结果得到
RAPD分析的有力支持。因此 ,莲瓣兰及春剑应为菅草兰的变
种 , 而不应归为新种。
关键词:　兰属;亲缘关系;形态学;RAPD;Mantel检测
中图分类号:　S682.31　　　文献标志码:　A
文章编号:　1001-4705(2008)02-0056-05
我国生物资源十分丰富 ,又是生物多样性受到严
重威胁的国家之一。兰花为我国传统名花 ,花形奇特 、
花色绚丽多变 、芳香素雅 、叶形优美 ,具有很高的观赏
价值和经济价值 。贵州兰科(Orchidaceae)植物野生
资源十分丰富 ,是我国兰科植物的分布中心之一 [ 1] 。
由于种类繁多 ,加之变种以及自然杂种的存在和不断
出现 ,仅凭植株的形态学标记进行兰花种质资源鉴定
具有很大的局限性 ,利用现代分子标记技术进行兰属
植物种质资源鉴定 、亲缘关系研究 ,以及遗传多样性评
价等就显得尤为重要 [ 2 -4] 。本文拟采用形态学和分子
标记手段 ,对贵州 12种野生兰属植物的遗传关系进行
探讨 ,为种质资源的进一步研究和保护提供参考。
1　材料和方法
1.1　材　料
收集了贵州省兰属植物 12个野生种(变种)作为
实验材料(表 1)。
表 1　用于形态学和分子评价的兰属植物野生种
样品号 样品名 学　　名 采集地
1 春兰 Cymbidiumgoeringi 贵州省遵义市
2 建兰 Cymbidiumensifolium 贵州省遵义市
3 珍珠矮 Cymbidiumnanulum 贵州省都匀市
4 墨兰 Cymbidiumsinense 贵州省贵阳市
5 莎叶兰 Cymbidiumcyperifolium 贵州省凯里市
6 兔耳兰 Cymbidiumlancifolium 贵州省剑河县
7 蕙兰 Cymbidiumfaberi 贵州省贵阳市
8 寒兰 Cymbidiumkanran 贵州省贵阳市
9 莲瓣兰 Cymbidiumlianpan 贵州省贵阳市
10 落叶兰 Cymbidiumdefoliatum 贵州省毕节市
11 春剑 Cymbidiumlongibracteatum 贵州省开阳县
12 菅草兰 Cymbidiumtortisepalum 贵州省贵阳市
1.2　形态学数据
参照前人的标准 [ 1, 5] ,对收集材料的叶 、花 、萼片 、
唇瓣等 35个形态学性状进行记载 、评分(表 2)。形态
学指标首先通过标准化去量纲 ,将标准化数据在 NT-
SYS2.10e软件上计算欧氏遗传距离 ,然后用 UPGMA
法进行聚类分析 。
采用改进的 CTAB-DNA法提取 12种兰属植物的
基因组 DNA[ 6] 。从 198个中筛选出 23个多态性较好
的随机引物(上海生工),采用 25μl反应体系进行扩
增 。反应液含 2.5μl10 ×反应缓冲液 , 2.5 mmol/L
Mg2 +, 0.15mmol/LdNTP, 0.4μmol/L引物 , 0.75U的
TaqDNA多聚酶 ,及 0.75ng模板 DNA。RAPD-PCR扩
增在 PTC-200(MJ, USA)PCR仪上完成。扩增程序:95
℃预变性 8min;接着 40个循环为 94℃变性 1min, 37
℃退火 90s, 72℃延伸 90s;最后在 72℃延伸 7min。
扩增产物在含有 EB(0.5 ～ 0.6μg/ml)的 1.6%琼脂
糖凝胶上电泳 ,在紫外凝胶成像仪上观察照像。为了
保证 PCR扩增的再现性 ,对各引物的扩增重复 2次 ,
将出现的带标记为 1,无带时记为 0,统计供试材料的
多态性数据 。以 RAPD数据在 NTSYS2.1 0e软件
·56·
第 27卷　第 2期　2008年 2月　　　　　　　 　　 　　种　子　(Seed)　　　　　　　　　 　　Vol.27　No.2　Feb.　2008
DOI :10.16590/j.cnki.1001-4705.2008.02.060
图 1　12种兰属植物形态学(左)及 RAPD(右)标记聚类图
上计算 NeiLi相似系数:Sij=2Nij/(Ni+Nj),以 1-
Sij计算遗传距离。其中 Nij为样品 i和样品 j共有的
带数 , Ni为样品 i特有的带数 ,而 Nj为样品 j特有的
带数。然后采用 UPGMA方法 ,在相同软件上进行聚
类分析 。
表 2　12种兰属植物的形态学性状特征和评分
编号 性状名 特征及评分
1 叶姿 下垂(0),半直立(1),直立(2)
2 叶片数(个) 取生长状况适中的株丛 3株作为统计对象 ,求其平均值
3 叶长(mm) 取株丛中央生长状况正常的成年叶 3 ～ 5片测量 ,取其平均值
4 叶宽(mm) 测叶片的最宽处 ,取均值
5 叶长 /宽 叶长与叶宽均值之比
6 叶面光泽 无(0),有(1)
7 叶缘锯齿 无(0),有(1)
8 叶色 用比色卡统一编码
9 叶艺 无(0),有(1)
10 着花数(个) 取 3 ～ 5株测量 ,取均值
11 花径(mm) 测量侧萼片间的宽度 , 3 ～ 5朵取均值
12 花色 用比色卡统一编码
13 瓣型 竹叶瓣(0),荷瓣(1),水仙瓣(2),梅瓣(3),蝶瓣(4)
14 肩形 落肩(0),平肩(1),飞肩(2)
15 香味 淡香(0),香(1),幽香(2)
16 萼片长(mm) 量中萼片的长度 5朵 ,取均值
17 萼片宽(mm) 量中萼片中上部最宽处 ,取 5朵花均值
18 萼片长 /宽 萼片长与宽的均值之比
19 紧边 否(0),是(1)
20 收根 ,放角 否(0),是(1)
21 唇瓣状态 反卷(0),舒直(1)
22 是否素心 否(0),是(1)
23 有无兰膏 否(0),是(1)
24 瓣起兜否 否(0),兜(1)
25 捧瓣着生姿态 五瓣分窠(0),分头合背(1),连肩合背(2)
26 花梗粗(mm) 量花序下部第一节花梗 3 ～ 5株取均值
27 花梗高(mm) 量至花序 -顶端小花柄基部
28 小花柄长(mm) 一葶一花者无小花柄
29 萼片条纹 无(0),有(1)
30 苞片长(mm) 量花序最下端的一枝苞片 , 3 ～ 5株取均值
31 苞锋尖有无钩 无(0),有(1)
32 有无沙晕 无(0),有(1)
33 筋纹疏密 无(0),疏(1),密(2)
34 花梗弯挺 弯(0),挺(1)
35 唇瓣起兜 否(0),兜(1)
　　将形态学和分子标记系统得出的遗传距离 , 在
NTSYS2.10e软件上进行 Mantel相关性检测 [ 7] 。
2　结果与分析
2.1　贵州春兰及其近缘种的形态学评价
通过形态学性状的成对比较(PairwiseCompari-
son)分析 ,绘制出供试材料的遗传距离矩阵(表 3)。
形态学上 ,莲瓣兰和菅草兰的相似性最大 ,遗传距离仅
为 4.96;其次是莎叶兰和建兰 ,遗传距离为 5.50;有关
春兰的组合 ,与菅草兰的遗传距离最近(6.04),与落
叶兰(8.55)最远 ,其余的在 7.72(与墨兰)～ 8.41(与
兔耳兰)之间;在涉及珍珠矮的组合中 ,以与春兰的遗
传距离最近(6.39),与蕙兰(9.11)和墨兰(9.65)的遗
传距离较远;在所供试的材料中 ,珍珠矮与墨兰的亲缘
关心最远 ,遗传距离为 9.65。
表 3　12种兰属植物间的形态学距离
样品 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
1 0
2 6.64 0
3 6.39 6.74 0
4 7.72 7.80 9.65 0
5 6.48 5.50 7.44 7.37 0
6 8.41 7.70 6.71 8.94 7.73 0
7 7.21 7.18 9.11 9.25 6.52 9.30 0
8 7.92 7.55 8.62 6.37 6.58 8.77 6.70 0
9 6.06 7.28 7.10 8.52 6.32 7.51 7.03 7.95 0
10 8.55 8.08 8.71 8.11 7.62 7.88 7.93 7.24 7.15 0
11 6.87 7.44 7.44 7.04 6.29 6.49 6.78 6.79 5.92 6.39 0
12 6.04 7.61 6.91 7.72 5.99 7.46 6.67 6.38 4.96 6.09 6.09 0
　　以形态学距离为基础进行聚类分析(图 1)。如果
以遗传距离值 7.15为阈值 ,所有供试材料可分为 4
类 ,其中墨兰和寒兰为一类 ,珍珠矮和兔耳兰为一类 ,
落叶兰独成一类 ,其余材料为一类;若以 7.40为阈值 ,
所有材料可聚为 3类 ,其中墨兰和寒兰组成 1类 ,珍珠
矮和兔耳兰组合为另 1类 ,而包括春兰在内的其他兰
属近缘种为第 3类;与春兰亲缘关系较近的近缘种中 ,
莲瓣兰先与菅草兰聚为 1类 ,而后与春剑聚合 ,之后才
与春兰聚合 。
·57·
资源与利用　　季祥彪 等:贵州 12种兰属植物资源形态学和 RAPD标记的比较分析
2.2　12种兰属植物的 RAPD鉴别
采用引物 S13, S26及 S139,扩增出来的谱带多
态性最为明显(图 2),能有效地将所有供试样品鉴定
出来。使用 S13引物 ,通过 1 200bp、800bp和 500bp
特异带 ,可以将建兰 、蕙兰及落叶兰与其它种类区分
开;菅草兰通过 S26的 2 000bp特异带可以很易鉴别;
而采用 S139的 3 000bp和 500bp的特异带可以将莲
瓣兰和墨兰与其它材料区分开 。以上引物结合使用 ,
便可将其余供试种类有效地鉴别开来 。
图 2　引物 S13(上)、S26(中)及 S139(下)
对兰属植物的 RAPD扩增图
　注:M:DNAMarker(#SM0331, fermentas公司), 1～ 12代码见表 4。
表 4　12种兰属植物 RAPD标记的相似系数
样品 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
1 1.00
2 0.80 1.00
3 0.64 0.63 1.00
4 0.66 0.76 0.68 1.00
5 0.84 0.85 0.75 0.75 1.00
6 0.77 0.65 0.74 0.67 0.75 1.00
7 0.75 0.74 0.44 0.63 0.73 0.53 1.00
8 0.70 0.78 0.63 0.77 0.76 0.68 0.54 1.00
9 0.73 0.71 0.71 0.74 0.76 0.75 0.56 0.67 1.00
10 0.63 0.75 0.49 0.72 0.66 0.65 0.70 0.66 0.60 1.00
11 0.73 0.73 0.59 0.74 0.73 0.66 0.67 0.64 0.82 0.68 1.00
12 0.78 0.76 0.75 0.71 0.77 0.79 0.61 0.71 0.86 0.64 0.78 1.00
2.3　兰属植物亲缘关系的 RAPD分析
以筛选出的多态性最好的 23个随机引物扩增 12
种兰属植物的基因组 DNA,共扩增出 272条 RAPD谱
带 ,其中多态性带 159条 ,平均每个引物可产生 6.9条
多态性带。尽管 RAPD的稳定性比其它分子标记稍
差 ,但只要建立了优化的 PCR体系 ,选择适合的引物
进行扩增 ,该技术仍然可以应用于兰属植物的遗传多
样性分析。
表 4 表明 , 珍珠矮与蕙兰的相似系数最小
(0.44),其次是落叶兰与珍珠矮(0.49);相似系数最
大的组合是莲瓣兰和菅草兰(0.86), 相似系数大于
0.80的组合还有莎叶兰与建兰(0.85),莎叶兰与春兰
(0.84)以及莲瓣兰与春剑(0.82);春兰与其近缘种的
相似系数较大 ,在 0.63(春兰与落叶兰)～ 0.84(春兰
与莎叶兰)之间 ,平均为 0.73。在涉及春剑的组合中 ,
以与莲瓣兰的相似系数(0.82)最大 ,其次是与菅草兰
(0.78),而与春兰的遗传差异性相对较大 ,相似系数
为 0.73。
以相似系数为基础 ,经聚类分析显示(图 1),如果
以相似系数值 0.66为阈值 ,所有供试材料可归为 2
类 , 7号蕙兰和 10号落叶兰为一类 ,其余所有样品为
另一类;若以 0.73为阈值 ,所有样品可聚为 5类 ,从上
至下依次为:春兰 、建兰 、莎叶兰 、莲瓣兰 、菅草兰 、春剑
为第 1类 ,墨兰和寒兰聚为第 2类 ,珍珠矮和兔耳兰为
第 3类 ,蕙兰与落叶兰单独各成一类 。其中 ,在第 1类
中 ,莲瓣兰与菅草兰亲缘关系最近 ,莎叶兰与建兰的亲
缘关系次之 ,这与形态学得到的结论是一致的 。
2.4　遗传距离的相关性检测
前面分析显示 ,以形态学指标及 RAPD标记所获
得的遗传距离来评判 12种兰属植物的亲缘关系会出
现一定的差异(Discrepancy)。为了检验 2种标记的可
靠性 ,我们以二者的距离矩阵为基础 ,进行相关性检
测 。结果表明 ,形态学距离和 RAPD距离间极显著相
关(r=0.68>P0.01)。因此 ,不同标记系统得出的结
果具有很大程度的同一性 ,这不但意味着采用 RAPD
标记对 12种兰属植物种质资源研究和鉴定的可靠性 ,
也反映了本文中所选用的形态学性状在资源评价中的
合理性 。
3　讨　论
遗传标记是植物不同基因型特殊的 、易于识别的
表现形式 ,可以体现在形态学 、细胞学和分子生物学等
水平上 。理想的遗传标记可以成为植物种质鉴别及亲
缘关系研究的有力工具 ,在名 、特 、优种质资源的知识
产权保护上具有重要意义。分子标记是植物 DNA水
平上遗传多样性的直接反映 ,与传统的遗传标记相比 ,
具有多态性丰富 、不受环境因子影响等优点 ,已广泛应
用于种质鉴别 、亲缘关系研究 、遗传图谱构建及遗传多
样性评价等领域 [ 8, 9] 。
兰属植物种类繁多 ,共有近 50个种 ,我国有 30余
种 ,其中贵州 18种 , 1亚种和 5个变种 ,但贵州兰属野
生种受到肆意采掘已日益减少 [ 1] 。进行该属植物的
遗传多样性研究对其系统演化 ,种质资源的鉴定以及
·58·
第 27卷　第 2期　2008年 2月　　　　　　　 　　 　　种　子　(Seed)　　　　　　　　　 　　Vol.27　No.2　Feb.　2008
对这些珍贵资源的生物多样性保护具有特殊的意义。
对兰属植物的形态学上的分析均有报道 ,但仅从形态
学上分析 ,很多种往往模棱两可 ,加之变种的存在和杂
种的不断出现 ,更为种质资源的鉴别和遗传关系的解
析增添了难度 ,因此建立稳定可靠 、多态性检出率高的
鉴别技术非常必要。后来在 DNA水平上 ,有的学者对
部分国兰品种的亲缘关系及种质资源的鉴别进行了研
究 [ 2, 4] 。文李等对兰属 5个种 2个变种的 13个品种进
行 RAPD分析 ,结果发现 ,各种间的亲缘关系与形态学
分类结果不完全一致 ,并认为 RAPD技术可用于兰属
植物的系统学研究 [ 3] 。但这些工作不够深入 ,所用材
料也非常有限 ,更没有将 DNA标记与传统的 、直观的
形态学标记结合起来 ,因此研究结果都具有一定的局
限性。本研究利用 35个形态学形状和 272个 RAPD
标记对贵州 12种野生兰属植物的亲缘关系进行研究 ,
较深入地 、全面地分析了供试材料的遗传关系 ,并对某
些种质的起源演化提出了新见解。通过 S13、S26及
S139等 3个随机引物进行扩增所获得的分子标记 ,构
建了 12种兰属植物的 DNA指纹图谱 ,可以快速而准
确地将它们区分开来 。
无论是形态学还是 RAPD分析 ,莲瓣兰和菅草兰
都表现出高度的同源性 ,其亲缘关系非常接近。在形
态学上 ,春兰与落叶兰的遗传距离较远 ,而 RAPD标记
揭示的亲缘关系却很近 ,两种标记表现出相异性。其
原因可能是相对于兰属其他植物 ,春兰有较高的变异
率 ,在分子水平的变异很易被 RAPD标记检测到 ,而形
态上的变化却相对滞后。作者在春兰不同居群野生资
源的遗传多样性分析中也发现了类似现象 。在统计的
35个形态学指标中 ,春兰的形态学差异非常不明显 ,
很多指标都表现一致性。尽管如此 ,经相关性检测 ,形
态学距离和 RAPD距离高度相关 ,因此不同标记系统
间得出的结果具有很大程度的同一性 。
一段时间以来 ,种质资源研究中形态学数据和分
子数据的相对价值一直困扰着人们。形态学方法传统
而又直观 , DNA标记则相反 ,稳定性较好 ,已发展成为
植物种质资源研究的重要手段 。实际上 ,现行的任何
一种检测技术都不是万能的 ,但都能提供许多有价值
的信息 ,应该注重它们的协同性(Concordence)。 DNA
技术与传统的方法相结合 ,已成功地应用于资源研究
和利用的许多方面[ 8, 10] 。实际上 ,形态学差异和分子
水平的差异所经受的进化压力不同 ,遵循的规律也不
同 ,彼此是相互独立的 [ 11] ;形态学上的差异并不一定
是 DNA水平变异的真实反映 [ 12] 。因此 ,单纯采用形
态学性状或分子标记进行兰属植物的种质鉴定和亲缘
关系分析 ,都具有一定的局限性 。
莲瓣兰为地生草本植物 ,是否为兰属的一个种 ,学
术界至今尚无定论。它曾被命名为 Cymbidium
lianpanTangetWang,未正式发表 ,但被后人沿用。陈
心启认为 , 莲瓣 兰 (Cymbidium tortisepalum var.
lianpan)与菅草兰 (Cymbidiumtortisepalum)和春剑
(Cymbidiumgoeringivar.longibracreatum)近似 , 但
因叶较狭且下弯 ,应为前者的一个变种较合理[ 13] 。而
陈俊愉把莲瓣兰视为兰属的一个种 [ 5] ,陈于敏等也认
为 ,由于它是天然形成的类型 ,既有相对稳定的特点 ,
在不断的发展演化中 ,又具有种的自然性 ,故将其视为
一个种更为合理[ 14] 。本研究通过 35个形态学性状的
聚类分析 ,反映出莲瓣兰与菅草兰在形态学上的高度
相似性 ,仅叶片较狭长而已 ,而这一结果又在 DNA水
平上的分析得到进一步验证 ,两种标记系统在这一种
质的亲缘关系上表现出惊人的一致性 。也说明将莲瓣
兰孤立于菅草兰作为兰属的一个种欠妥。同样 , RAPD
分析表明 ,在涉及春剑组合的相似系数中 ,以与莲瓣兰
及菅草兰的相似系数最大 ,而与春兰的遗传差异性相
对较大 ,这一结果又为形态学距离(表 3)所支持。因
此 ,作者支持陈心启和刘仲健的观点 ,将春剑归为菅草
兰的变种较为合理。
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收稿日期:2007-11-06
基金项目:上海市自然科学基金和上海市重大基础研究项目 “登山计
划 ”资助。
作者简介:刘龙洲(1978-),男 ,新疆乌鲁木齐人;在读博士研究生 ,研
究方向:植物生物技术。
120份黄瓜种质白粉病 (Sphaerothecafuliginea)抗性鉴定
刘龙洲 , 　何欢乐 , 　潘俊松 , 　杜　辉 , 　蔡　润
(上海交通大学农业与生物学院 , 　上海 201101)
Identificationof120 CucumberGermplasmResistancetoPowderyMildew
(Sphaerothecafuliginea)
LIULong-zhou, HEHuan-le, PANJun-song, DUHui, CAIRun
摘要:应用苗期室内喷雾接种法 ,对从国内外搜集的 120份黄
瓜种质材料进行两次重复接种鉴定。 接种菌为上海地区优势
黄瓜白粉菌生理种 , 单孢分离和纯化。共鉴定出高抗材料 17
份 , 耐病材料(中抗 , 中感)82份 , 严重感病材料 21份。抗病材
料包括中国 10份 , 中国台北 、日本各 2份 , 美国 、荷兰 、菲律宾
各 1份。本研究为黄瓜培育抗病品种和跨种植区引种 , 提供了
基本的技术支持。
关键词:　黄瓜;白粉病;抗病鉴定
中图分类号:　S642.2　　　文献标志码:　A
文章编号:　1001-4705(2008)02-0060-03
黄瓜是世界性重要蔬菜 , 白粉病 (Sphaerotheca
fuliginea)是危害黄瓜的主要疾病之一。白粉病在黄瓜
苗期严重爆发时 ,造成产量损失 20% ～ 50%[ 1] 。黄瓜
白 粉 菌 主 要 包 括 Sphaerotheca fuliginea 和
Golovinomycescichoracearum两属 ,中国黄瓜白粉菌属
于 Sphaerothecafuliginea属 [ 2] ,目前 ,使用杀菌剂和种
植抗病品种是防御病害的主要方法。黄瓜白粉菌是专
性活体寄生真菌 ,在菌种的保存和相关研究上有很大
的难度 ,小种鉴定纯化工作研究较少 ,关于黄瓜种质的
白粉病抗性评价很少有报道。开展黄瓜种质材料的白
粉病抗性鉴定对于国际间和国内省区间引种 ,选育材
料 、配制抗病品种有极其重要的意义 。
1　材料和方法
1.1　鉴定材料
从全国和世界各地征集到的 120份黄瓜种质材
料 ,其中包括从美国北方种质中心引进的材料 40份
(编号为 PI系列)。各种质在人工气候室 1次种植 16
株 ,重复 2次 。
1.2　病菌保存
单孢分离后 ,保存在极易感病的黄瓜品种长春密
刺幼苗植株上。用专门的培养箱进行隔离培养 ,温度
18 ～ 23℃,湿度 50% ～ 75%。
1.3　接种准备
从长春密刺幼苗感病叶片上分离。用无菌水洗
刷 、过滤 ,通过血球记数器统计 ,孢子的悬浮液被调至
2或 5×104个孢子 /ml。用 L型手持喷雾器在幼苗长
到 2叶 1心 ,均匀的把调配好的孢子悬浮液喷到叶片
上 。然后保持湿度 75±10%, 24h。
表 1　方差分析
变异来源 总方差SS
自由度
d.f.
均方差
MS F F0.05
重复间 1.82 1 1.82 28.53 3.92
种质间 1 405.63 119 11.81 184.96 1.35
误差 7.59 119 0.064
总变异 1 415.05 239
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第 27卷　第 2期　2008年 2月　　　　　　　 　　 　　种　子　(Seed)　　　　　　　　　 　　Vol.27　No.2　Feb.　2008