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萝卜属抽薹开花相关基因FLC的预测及分析



全 文 :浙江农业学报 Acta Agriculturae Zhejiangensis,2014,26(3):656-660 http:/ /www. zjnyxb. cn
郭军,祖艳侠,吴永成,等. 萝卜属抽薹开花相关基因 FLC的预测及分析[J].浙江农业学报,2014,26(3):656-660.
DOI:10. 3969 / j. issn. 1004-1524. 2014. 03. 21
收稿日期:2013-04-30
基金项目:江苏省科技支撑计划项目(BE2012342);江苏省农业科技自主创新资金项目[CX(12)2006];盐城市农业科技发展计划项目
(YC201003)
作者简介:郭军(1969—),男,江苏滨海人,研究员,主要从事蔬菜遗传育种及栽培技术研究。E-mail:guojunyc@ 126. com
萝卜属抽薹开花相关基因 FLC的预测及分析
郭 军,祖艳侠,吴永成,郑佳秋,梅 燚
(江苏沿海地区农业科学研究所,江苏 盐城 224002)
摘 要:以控制拟南芥春化途径的关键基因 FLC全长 CDS为参考序列,在萝卜属(Raphanus)EST数据库中
进行 BLASTN检索,得到具备 Score≥100、E-value≤10 -10和 coverage ≥70%条件的 70 条萝卜 ESTs 作为候选
的拟南芥 FLC基因的同源 ESTs,并进行序列聚类拼接、注释及分析。结果显示:在普通萝卜和野生萝卜中各
发现两个旁系同源基因(RsFLCa和 RsFLCb及 RrFLCa和 RrFLCb)。RFLCs 与拟南芥 FLC 间在核酸水平上的
一致性为 78. 7% ~ 86. 9%;RFLCs旁系同源基因间的一致性为 75. 9% ~ 93. 4%;RFLCs与芸薹属 FLC直系同
源基因间的一致性绝大多数维持在 85%以上,且高于与拟南芥直系同源基因间的一致性。系统进化分析发
现,与白菜、甘蓝及甘蓝型油菜中 FLC多拷贝产生的机制可能类似,萝卜属 FLC 基因的多拷贝现象可能也是
伴随萝卜基因组的多倍化而产生的。
关键词:十字花科;萝卜属;开花时间基因
中图分类号:S 631. 1;Q 943. 2 文献标志码:A 文章编号:1004-1524(2014)03-0656-05
Prediction and analysis of flowering related genes RFLCs in Raphanus species
GUO Jun,ZU Yan-xia,WU Yong-cheng,ZHENG Jia-qiu,MEI Yi
(Institute of Agricultural Sciences of Jiangsu Coastal Area,Yancheng 224002,China)
Abstract:FLC (FLOWERING LOCUS C) in Raphanus species were identified using data mining method from
Raphanus EST database. The full length CDS sequence of Arabidopsis thaliana vernalization pathway key gene FLC
was used as reference to search the homologous ESTs in Raphanus EST database. Sequences with Score ≥100,E-
value ≤10 -10 and coverage ≥70% were considered as the candidate FLC-gene-like ESTs,which were assembled
and annotated in the following analysis. The results showed that 70 FLC-gene-like ESTs were identified in Raphanus,
and four FLC candidate genes (RsFLCa,RsFLCb,RrFLCa and RrFLCb)were predicted,among which RsFLCa and
RsFLCb were originated from Raphanus sativus,and the other two were originated from Raphanus raphanistrum. The
homologous FLC genes in Raphanus and Arabidopsis thaliana shared 78. 7% - 86. 9% nucleotide sequence identity,
and paralogs FLC genes in Raphanus shared 75. 9% - 93. 4% nucleotide sequence identity. Identities of FLC
orthologs between Raphanus and Brassica were more than 85%,which was higher than that between Raphanus and
A. thaliana. Moreover,phylogenetic analysis suggested that multi-copy of FLC genes in Raphanus may be
corresponded with genome polyploidy of Raphanus spieces,which was similar to that of FLC genes in Brassica
species.
Key words:Cruciferae;Raphanus;flowering time gene
萝卜(Raphanus sativus L.)是我国重要的蔬
菜作物,抽薹开花是萝卜生产中重要的农艺性
状。“先期抽薹”会降低产品的产量和品质,是春
季十字花科蔬菜生产的主要问题。培育晚抽薹
品种是解决这一问题的根本途径。拟南芥中关
于开花时间调控的机理已经进行了较为详尽的
研究,并认为开花时间的变异主要是由 FLC
(FLOWERING LOCUS C)以及控制 FLC 表达的
FRI(FRIGIDA)等位变异控制的[1 - 3]。FLC 编码
MADS-box的转录调控因子,其表达受春化影响,
随着低温持续时间的延长,FLC 的表达持续下
调,直至解除 FLC 对开花的抑制作用[4 - 6]。因
此,FLC 被认为是拟南芥春化途径的开关
基因[5 - 6]。
目前,芸薹属蔬菜作物中的白菜(B. rapa)、
甘蓝(B. oleracea)和甘蓝型油菜(B. napus)均已
克隆到 FLC 的同源基因[7 - 10]。而同为十字花科
的萝卜属中关于 FLC基因的研究却鲜有报道,本
研究以生物信息分析为主要技术手段,充分挖掘
萝卜属 EST数据库,并对萝卜属 FLC候选基因进
行预测及分析。本研究将为萝卜属 FLC 基因的
克隆、萝卜抽薹机理的探索及萝卜晚抽薹品种的
选育提供理论基础。
1 材料与方法
1. 1 材料
拟南芥 FLC基因(AT5G10140)来源于 TAIR
数据库(www. arabidopsis. org,TAIR10),萝卜属
ESTs、甘蓝 BoFLCs基因及甘蓝型油菜 BnFLCs 基
因均来源于 NCBI(www. ncbi. nlm. nih. gov),白菜
BrFLC1 (Bra009055)、BrFLC2 (Bra028599)和
BrFLC3(Bra006051)来源于 http: / /Brassicadb.
org。
1. 2 方法
利用拟南芥 FLC 基因的全长 CDS 序列在
NCBI(www. ncbi. nlm. nih. gov)中对萝卜属物种
ESTs进行 BLASTN 检索,得到具备 Score ≥100、
E-value ≤10 -10 s 和 coverage ≥70%作为候选的
拟南芥 FLC基因的萝卜属同源 ESTs,利用 Cap3
软件进行序列聚类拼接,Cap3 软件参数默认。基
因注释采用 Softberry 网站(www. softberry. com /)
基因注释模块 FGENESH软件。多序列比对及聚
类分析采用 Mega 软件[11]。序列一致性分析采
用 EMBOSS 软件包的 Needle 程序 (emboss.
sourceforge. net)。
2 结果与分析
2. 1 RFLCs候选基因的预测
表达序列标签 EST(expressed sequence tags)
携带某些基因片段的信息。近年来,随着测序技
术的飞速发展,EST 数据库迅猛增长,大大增加
了从 EST出发寻找新基因的可能性。迄今为止,
萝卜属植物数据库中的 EST 数量已达到 316 593
条,覆盖了普通萝卜和野生萝卜基因组的大部分
表达区域。通过 BLASTN 检索,在萝卜属中共获
得 70 条与拟南芥 FLC 基因同源的 EST,其中 26
条来源于普通萝卜(Raphanus sativus L.),44 条
来源于野生萝卜(Raphanus raphanistrum L.)。通
过序列聚类拼接及注释后在普通萝卜和野生萝
卜中分别获得两个 FLC 候选基因,暂命名为
RsFLCa,RsFLCb和 RrFLCa,RrFLCb。
拟南芥 FLC 基因蛋白序列全长包含 196 个
氨基酸,同时存在 MADS-box(3 ~ 57 aa)和 K-box
(80 ~ 168 aa)两个结构域(图 1)。多序列比对结
果显示(图 1):普通萝卜、野生萝卜 FLC 基因在
蛋白质水平上与拟南芥 FLC 基因保持高度的一
致性。萝卜属 FLC基因与拟南芥同源 FLC 基因
在 MADS-box和 K-box结构域高度保守。RsFLCb
和 RrFLCb在 K-box结构域中的(82 ~ 83 aa)间存
在 1 个氨基酸的插入突变,同时又在(111 ~ 112
aa)间存在 1 个氨基酸的缺失突变。RrFLCa 和
RrFLCb在蛋白序列末端分别存在 18 个氨基酸和
7 个氨基酸的连续缺失。
2. 2 萝卜属 FLC候选基因与拟南芥及重要芸薹
属蔬菜 FLC基因的同源比较
萝卜属与拟南芥及重要芸薹属蔬菜 FLC 基
因的同源比较如表 1 所示,萝卜属与拟南芥 FLC
基因在核酸水平上的一致性保持在 78. 7% ~
86. 9%;与白菜 FLC基因间的一致性为 75. 1% ~
93. 8%;与甘蓝 FLC基因间的一致性为 70. 2% ~
94. 9%;与甘蓝型油菜 FLC 基因间的一致性维持
在 72. 7% ~95. 1%。普通萝卜两个旁系同源 FLC
·756·郭 军,等.萝卜属抽薹开花相关基因 FLC的预测及分析
图 1 萝卜属 FLC候选基因与拟南芥 FLC在蛋白质水平上的全局比对
Fig. 1 Global alignment of protein sequences between RFLC in Raphanus and FLC in Arabidopsis thaliana
表 1 萝卜属 FLC候选基因与多个近缘物种 FLC基因在核酸水平上的一致性
Table 1 Identification between Raphanus FLC candidate genes and several Cruciferae species FLC genes in the nucleic
acid level
物种 基因 RsFLCa /% RsFLCb /% RrFLCa /% RrFLCb /%
拟南芥 Arabidopsis thaliana AT5G10140 86. 9 85. 8 78. 7 82. 0
白菜 B. rapa BrFLC

1 91. 0 83. 2 81. 9 79. 0
BrFLC2 87. 5 90. 3 78. 3 86. 0
BrFLC3 86. 4 93. 8 75. 1 89. 1
甘蓝 B. oleracea BoFLC

1 94. 9 87. 1 85. 7 82. 4
BoFLC2 75. 3 93. 6 86. 2 89. 1
BoFLC3 86. 4 93. 5 75. 3 88. 8
BoFLC5 82. 2 86. 4 70. 2 82. 0
甘蓝型油菜 B. napus BnFLC

1 95. 1 86. 9 84. 1 82. 6
BnFLC2 87. 5 90. 3 76. 9 86. 0
BnFLC3 86. 4 93. 8 75. 1 89. 1
BnFLC4 86. 5 88. 2 76. 3 83. 8
BnFLC5 84. 2 88. 6 72. 7 84. 0
普通萝卜 Raphanus sativus RsFLCa

100
RsFLCb 85. 9 100
野生萝卜 Raphanus raphanistrum RrFLCa

86. 2 75. 0 100
RrFLCb 81. 2 93. 4 75. 9 100
基因间的一致性高达 85. 9%;野生萝卜两个旁系
同源基因间的一致性为 75. 9%。普通萝卜 FLC与
野生萝卜 FLC 基因间的一致性为 81. 2% ~
93. 4%。
RsFLCa 与 其 在 白 菜 (BrFLC1)、甘 蓝
(BoFLC1)、甘蓝型油菜(BnFLC1)及野生萝卜
(RrFLCa)中的同源基因一致性较高,分别高达
91. 0%,94. 9%,95. 1% 和 86. 2%;RsFLCb 与其
·856· 浙江农业学报 第 26 卷 第 3 期(2014 年 5 月)
在白菜(BrFLC3)、甘蓝(BoFLC2)、甘蓝型油菜
(BnFLC3)及野生萝卜(RrFLCb)中的同源基因一
致性较高,分别为 93. 8%,93. 6%,93. 8% 和
93. 4%。RrFLCa 与其在白菜(BrFLC1)、甘蓝
(BoFLC2)、甘蓝型油菜(BnFLC1)中的同源基因
的一致性较高,分别为 81. 9%,86. 2%和 84. 1%;
RrFLCb与其在白菜(BrFLC3)、甘蓝(BoFLC2)、
甘蓝型油菜(BnFLC3)间的同源基因一致性较
高,分别为 89. 1%,89. 1%和 89. 1%。可见,萝卜
属 FLC基因与拟南芥直系同源 FLC 基因间的一
致性明显低于其与芸薹属直系同源基因间的一
致性。
2. 3 十字花科植物中 FLC基因的系统进化分析
系统进化分析发现(图 2),17 个 FLC基因聚
为 3 大类,拟南芥 FLC 为一独立分支;萝卜属
RsFLCa和 RrFLCa聚为一个分支,然后与芸薹属
FLC1 聚在一起;萝卜属 RsFLCb 和 RrFLCb 与芸
薹属 FLC3 基因距离最近,其次为 FLC5 及 FLC2。
因此,不难推断,RsFLCa 和 RrFLCa 基因与芸薹
属 FLC1 基因亲缘关系最近,而 RsFLCb 和
RrFLCb与芸薹属其他基因中的 FLC3 亲缘关系
更近一些。这也说明,RsFLCa 和 RrFLCa 与芸薹
属 FLC1 应属直系同源基因;RsFLCb 和 RrFLCb
与芸薹属 FLC3 为直系同源基因。
注:At,Bo,Bn和 Br分别表示来源于拟南芥、甘蓝、甘蓝型油
菜和白菜,其他均为本研究预测的基因
图 2 不同物种 FLC的系统进化分析
Fig. 2 Phylogenetic relationship among FLC genes from
different species
3 小结与讨论
本研究借助生物信息分析技术,在普通萝卜
和野生萝卜中分别预测到两个 FLC 旁系同源候
选 基 因 (RsFLCa 和 RsFLCb 及 RrFLCa 和
RrFLCb)。萝卜属 FLC 基因与拟南芥同源基因
在 MADS-box和 K-box结构域区域高度同源。萝
卜 FLC基因与拟南芥 FLC 基因间在核酸水平上
的一致性为 78. 7% ~86. 9%;萝卜属 FLC旁系同
源基因间的一致性为 75. 9% ~ 93. 4%;萝卜属
FLC与芸薹属 FLC 直系同源基因间的一致性绝
大多数维持在 85%以上,且高于与拟南芥直系同
源基因间的一致性。系统进化分析发现,RsFLCa
和 RrFLCa可能与芸薹属 FLC1 存在直系同源关
系,而 RsFLCb 和 RrFLCb 更可能与芸薹属 FLC3
基因存在直系同源关系。但是由于该研究所涉
及的萝卜属 FLC均为预测产物,相关基因真实序
列尚需进行克隆、测序等工作的进一步验证。
拟南芥、白菜、甘蓝和甘蓝型油菜基因组大
小分别为 157,485,650 和 1 100 Mb[12 - 13]。拟南
芥中存在 1 个 FLC 基因,而在白菜、甘蓝及甘蓝
型油菜中存在多拷贝现象,并且有研究表明这种
多拷贝现象与芸薹属基因组多倍化密切相
关[13]。在白菜中的研究表明,白菜基因组经过
了两次二倍化,存在三套亚基因组(LF,MF1 和
MF2),其中 LF 基因密度较大,是较为年轻的亚
基 因 组[13]。 BrFLC1 (Bra009055 )、 BrFLC3
(Bra006051)和 BrFLC2(Bra028599)分别来源于
LF,MF1 和 MF2 三 套 亚 基 因 组 (http: / /
Brassicadb. org),并且存在严格的共线性,类似的
基因组多倍化事件也发生在其他多种芸薹属作
物中[14]。
有研究表明,萝卜基因大小为 520 Mb 左右,
远远大于拟南芥基因组,而与芸薹属中的白菜和
甘蓝基因组大小相近[15]。而且在普通萝卜和野
生萝卜中各发现两个旁系同源基因,可见萝卜中
FLC基因与芸薹属作物中 FLC 存在多倍化的现
象极为类似。序列比对及系统进化分析发现
RsFLCa和 RrFLCa 与芸薹属 FLC1 亲缘关系较
近,可能为直系同源关系;而 RsFLCb 和 RrFLCb
与芸薹属 FLC3 一致性更高。依据芸薹属白菜中
·956·郭 军,等.萝卜属抽薹开花相关基因 FLC的预测及分析
FLC进化途径,我们推测萝卜属中的 FLC 也存在
类似的进化途径,但萝卜中 FLC旁系同源基因间
是否也存在共线性关系尚待研究。
白菜中 FLC基因存在多拷贝现象,同时不同
的 FLC 基因拷贝间存在明显的交互作用,不同
FLC基因本身也存在明显的变异,这是引起白菜
开花时间存在极其丰富类型的重要原因;在白菜
中针对 FLC基因存在的变异,已开发了基因特异
性的 CAPs标记和 InDel标记,并且在白菜耐抽薹
育种中得到有效应用[16 - 18]。萝卜花开花时间也
存在极为丰富的变异,萝卜中不同的 FLC 基因拷
贝间是否存在交互作用,是否不同 FLC 基因本身
也存在 SNP,InDel等多种变异也有待考证。
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(责任编辑 张 韵)
·066· 浙江农业学报 第 26 卷 第 3 期(2014 年 5 月)