全 文 ：菊属种间杂种的鉴定
李辛雷 , 陈发棣* , 崔娜欣
(南京农业大学园艺学院 , 江苏 南京 210095)
摘要:利用 RAPD技术 、 细胞学及形态学手段对菊属种间杂种进行鉴定。 RAPD标记结果表明:杂种表现出父本特异带
或双亲均不具备的新谱带。细胞学鉴定结果表明:杂种染色体数目为亲本平均值。形态学性状观察 、 统计表明:大多数
杂种性状介于双亲之间 , 但部分性状则较为明显地相似于多倍体;部分杂种表现父本特异性状 , 或出现双亲所不具备的
新性状;二倍体野生种与栽培菊花杂种形态分离广泛 , 说明多倍体栽培菊花具复杂的遗传背景。
关键词:菊属;种间杂种;RAPD;细胞学;形态学;鉴定
中图分类号:S682.1+1 文献标识码:A 文章编号:1000 2030 (2005) 01 0024 05
Identification of interspec ific hybrids inDendranthema
LI X in-le i, CHEN Fa-di* , CU INa-x in
(C ollege o fH o rticu lture, Nanjing Ag ricu ltu ra lUniversity, Nan jing 210095, Ch ina)
Abstract:RAPD, cy to log ical and m orpho log ica l ana ly sis we re used fo r the iden tifica tion o f interspecific hyb rids inDendran thema.
RAPD resu lts indicated tha t the hybrids produced specific bands ofm a le paren t o r new bands absent in bo th paren ts. The results o f
cy tologica l ana lysis indicated tha t ch rom osom e number of F1 hybridsw as the average of the ir paren ts. The obse rva tion and statistics
o fm o rpho logy sugge sted that the hybrids showed in te rspecific m orpho log ical traits and some tra its resemb led mo re close ly w ith the
highe r po lyploidy parents. Som e hybrids showed specificm orpho log ical tra its of theirm a le pa rent o r uniquem orpho log ical tra its their
paren ts did no t po ssess. The mo rpho log ical tra its of hybrids be tw een diplo ids and ch rysanthemum cultivars varied in a large range,
indica ting tha t the polyploid cu ltiva ted chrysanthemum contained com plexed gene tic backg round.
Key words:Dendran thema; interspecific hybrid;RAPD; cy tology;m orpho logy; identifica tion
在菊属植物育种中 , 通过幼胚拯救技术可以克服远缘杂交障碍 , 获得种间杂种 。由于菊花 (Den-
dran themamorifolium)的幼胚较小 , 不易取出 , 利用子房培养则相对简单 , 且不会伤害到幼小的胚 , 因
此 , 在菊花幼胚拯救中常用子房培养 [ 1] 。利用子房培养进行胚拯救时 , 所得再生植株中除了期望的杂
种之外 , 子房壁等组织能形成再生植株 , 因此有必要对再生植株进行鉴定 [ 1] 。常规杂种鉴定如形态学
鉴定 、 细胞学鉴定具有简单易行 、直观明了等特点 [ 1 ～ 3] 。同工酶鉴定技术部分克服常规鉴定技术的局限
性 , 但由于同工酶是基因表达加工后的产物 , 其特异性易受环境条件和发育阶段的影响 [ 4] 。 RAPD
(random amplified po lymo rphic DNA)标记是 DNA水平遗传变异的直接反映 , 能够在早期对幼苗进行鉴
定 , 不影响植株生长发育 [ 5, 6] 。关于菊属植物种间杂种的 RAPD及形态学鉴定 , 尚未见报道 。本研究应
用 RAPD技术 , 同时结合细胞学和形态学观察 、统计分析 , 对菊属种间杂种进行鉴定 , 以期为菊属植物
远缘杂种提供快速准确的鉴定方法 , 从而缩短育种周期 , 提高育种效率。
1 材料与方法
1.1 材料
二倍体野生种甘菊 (D. lavandulifilium)、 菊花脑 (D. nank ingense)、 宜色菊 (D. dichrum ), 四倍
体河南野菊 (D. indicum), 以及 5个栽培菊花品种紫勋章 、 紫玉芙蓉 、 黄英 、 滁菊 、 落霞 (六倍体及
收稿日期:2004 04 06
基金项目:江苏省基础计划青年创新人才基金项目 (BK2002417);江苏省教育厅高技术产业化项目 (JH02 086);江苏省三项工
程项目 [ S01 (48) 和 SX (2003) 065] ;江苏省高技术研究项目 (BG2003305)
作者简介:李辛雷 (1978 ), 硕士。*通讯作者 C orresponding au thor:陈发棣 (1970 ), 博士 , 教授 , 主要从事花卉遗传育种研究 ,
E-m ail: chen fd@n jau. edu. cn。
南京农业大学学报 2005, 28 (1):24 ～ 28
Journa l of Nanjing Agricu ltural University
其非整倍体 )及杂交后幼胚拯救所得植株 (表 1)。所有材料均来源于南京农业大学菊花种质资源保存
中心。
1.2 方法
1 .2.1 杂种 RAPD鉴定 取杂交亲本及其后代不同单株上新鲜嫩叶用液氮混合磨样 。样品 DNA提取参
照 SDS法 [ 7] 。 RAPD随机引物 、 dNTP、 Taq DNA聚合酶 、琼脂糖 (Spanish进口分装 )均购自南京生通
生物技术有限责任公司。 PCR扩增反应采用 20 μL反应体系:2 mmo l L - 1 MgC l2、 10×buffer 2.5 μL、
0.2mmo l L -1 dNTP、 1mmo l L -1引物 、 1 U Taq E、 模板 DNA 15 ng、 ddH2O。 PCR仪为 PTC 0100。
参照文献 [ 7] 的反应程序并作适当调整:93 ℃预变性 3 m in;93 ℃ 1m in, 36℃ 1 m in , 72 ℃ 2 m in,
循环 40次;72℃延伸 10m in。反应产物 4℃保存。 1.5%的琼脂糖凝胶 (含 0.5μg mL -1 EB)电泳分
离 , 在紫外成像系统上观察并拍照。
1 .2.2 杂种细胞学鉴定 取杂交后代植株的花粉母细胞进行减数分裂研究 。于晴天 8:00至 11:00时 ,
取直径 2 ～ 6mm的花蕾 , 剥去外层膜质苞片 , 立即用卡诺氏固定液 (95%酒精与冰醋酸的体积比为 3∶1)
固定 , 于冰箱中保存备用 。制片时 , 取出头状花序 , 置于 60℃ 1mo l L -1 HC l中解离 5 ～ 15m in, 席夫
试剂染色至管状花呈紫红色 , 取管状花的花药 , 在 45%醋酸中压片 , 用临时片统计染色体数并照相。
1 .2.3 杂种形态学鉴定 将父母本及其杂交后代植株于 4月同时定植在田间 , 6月起陆续对其株高 、
冠幅 、 叶长 、叶宽 、 叶型 、茎色 、叶裂 、花色 、 花序直径 、舌状花和筒状花数目等性状进行观察和统
计 , 性状登记均按李鸿渐等[ 8]标准进行 , 花色以英国皇家园艺学会的色谱为标准 (Co lour Chart, the
RoyalHo r.t Culture Society, London)。依据父母本及其杂交后代的表现型对所得植株进行检测 、鉴定。
2 结果与分析
2.1 杂种 RAPD鉴定
以杂交亲本宜色菊 、甘菊 、 菊花脑 、 河南野菊 、落霞 、 黄英 、紫玉芙蓉 、 紫勋章 、滁菊 9份试材为
对象 , 用 40个 10 bp的寡核苷酸随机引物进行扩增 , 从中筛选出 17条带型清晰多态性较好的引物 (A-
01 , A-02, A-04, B-02 , B-04, C-01, C-03, I-18, J-05, L-12, P-09, P-16, P-17, S-03, U-19 , W-
03 , X-03)对杂交后子房培养所得植株进行鉴定。将亲本及其后代植株 DNA一起进行 RAPD扩增 , 筛
选能够在父本中扩增出母本中没有的特异带的引物 9个 (表 1), 对二倍体野生种与四倍体野菊 、 栽培
菊花 10个杂交组合的 46个杂交后代植株及其亲本进行扩增 , 并多次重复试验 。图 1为引物 B-02对菊
花脑 ×黄英 6个后代植株的扩增结果 , 其中 2、 3、 4、 6号植株出现父本特异带 (箭头所指 ), 据此判
断其为杂种;而 1、 5号植株无父本特异带 , 说明其为假杂种 , 可能来源于子房壁等组织;在所得 4株
杂种植株中扩增谱带不完全相同 , 也并非均为父母本谱带之和 , 如 6号植株与 2、 3、 4号的扩增谱带明
显不同 , 且有父母本所不具有的新谱带出现。同时研究还发现可以用不同引物来鉴定同一杂交组合的后
代 , 如引物 A-04, B-04对黄英 ×甘菊后代植株的扩增 (图 2), 2个引物扩增的谱带虽然不同 , 但得到
的鉴定结果一致 , 表明黄英 ×甘菊的 2个后代植株为杂种。多次重复试验 , 结果完全一致 。可见同一引
物或不同引物对杂种的鉴定结果一致 。不同引物对不同杂交后代的鉴定结果见表 1。
表 1 不同杂交组合 RAPD鉴定结果
Tab le 1 The resu lts o f RAPD identifica tion o f d iffe ren t cross comb inations
杂交组合 C ross comb ination s 引物
P rim ers
植株数
P lan tlets
杂种数
H yb rids
菊花脑 ×河南野菊 D. nankingense×D. indicum B-02 (TGATCCCTGG), U-19 (GTCAGTGCGG) 12 8
菊花脑 ×滁菊 D. nankingense×D. morifo lium ‘C hu ju’ B-02 1 1
菊花脑 ×黄英 D. nankingense×D. morifo lium ‘H uangying’ B-02 6 4
黄英 ×菊花脑 D. m orifolium ‘H uangy ing’ ×D. nankingense W-03 (GTCCGGAGTG), X-03 (TGGCGCAGTG) 6 6
甘菊 ×黄英 D. lavandu lifilium ×D. m orifolium ‘H uangying’ B-04 (GGACTGGAGT) 4 4
黄英 ×甘菊 D. m orifolium ‘H uangying’ ×D. lavandulif ilium A-04 (AATCGGGCTG), B-04 2 2
宜色菊 ×紫玉芙蓉 D. d ichrum ×D. m orifolium ‘Z iyu fu rong’ C-03 (GGGGGTCTTT), P-09 (GTGGTCCGGG) 5 5
紫玉芙蓉 ×宜色菊 D. m orifolium ‘Ziyu fu rong’ ×D. d ichrum C-03 3 3
紫勋章 ×宜色菊 D. m orifolium ‘Zixunzhang’ ×D. d ichrum B-04 4 4
宜色菊 ×落霞 D. d ichrum ×D. m orifolium ‘Luoxia’ S-03 (CAGAGGTCCC) 3 3
25 第 1期 李辛雷等:菊属种间杂种的鉴定
图 1 菊花脑 ×黄英后代 RAPD分析 (引
物 B-02)
F ig. 1 RAPD ana lysis of D. nankin-
gense, D. morifo lium ‘ Huan-
gy ing ’ and the ir F1 offspr ings
(Prmi e r B-02)
(M. 菊花脑 D. nankingense;F. 黄英 Huangy-
ing;1 ～ 6. 杂交后代 F1 offsp rings)
图 2 黄英 ×甘菊后代 RAPD分析 (引物 A-04 (左), B-04 (右))
F ig. 2 RAPD ana lysis o fD. m or ifo lium ‘Huangy ing’ , D. lavan-
du lifilium and the ir F1 o ffsp rings (Prmi e r A-04 ( le ft), B-
04 ( right))
(1～ 2. 杂交后代 F1 offsp rings;M. 黄英 Huangying;F. 甘菊 D. lavan-
du lifi lium)
2.2 杂种细胞学鉴定
菊花脑 (2n=2x =18) ×黄英 (2n=6x =54)杂种 F1为一四倍体种间杂种 , 2n =4x =36, 其花粉
母细胞减数分裂中期 Ⅰ (po llenmo ther ce ll, me taphase Ⅰ , PMC MⅠ )染色体配对构型主要以二价体为
主 , 部分细胞出现单价体和四价体 。其中含 18Ⅱ和
16Ⅱ +1Ⅳ构型的细胞出现频率最高 , 各占观察细胞
总数的 36.4%。含单价体和四价体的细胞频率分别
为 15.2%和 57.6%。每个花粉母细胞的平均构型为
0.30Ⅰ +16.45Ⅱ +0.70Ⅳ, 每细胞平均交叉结数为
21.32 (每对染色体 1.18)。减数分裂过程基本正常 。
黄英 ×菊花脑的 F1减数分裂行为与菊花脑 ×黄
英的 F1相类似 , 每个花粉母细胞染色体平均配对构
型为 0.29Ⅰ +16.07Ⅱ +0.89Ⅳ。其中 16Ⅱ +1Ⅳ构
型出现频率最高 (图 3), 为 35.7%;其次为 18Ⅱ构
型 , 出现频率为 32.1%。含四价体的细胞占 64.3%,
25%的细胞含有 2个四价体 。 14.3%的细胞出现 2个
单价体 。少数细胞观察到染色体桥 , 减数分裂过程基
本正常 。
图 3 黄英 (2n =54) 与菊花脑 (2n =18) 杂种花
粉母细胞减数分裂中期Ⅰ配成 16Ⅱ +1Ⅳ
F ig. 3 16Ⅱ +1Ⅳ chrom osome pa iring con figu ra tion in
PMC MⅠ o f F
1
hyb rid be tw een D. m or ifo lium
‘Huangy ing’ (2n =54) andD. nank ingense
(2n=18)
2.3 杂种形态学鉴定
对 10个组合亲本及其后代的叶长 、 叶宽 、 株高 、冠幅 、花序直径及舌状花和筒状花数目等性状进
行观察比较 、统计。菊花脑 、 黄英及其后代的相应性状见表 2。植株 6的叶长为 7.0 cm , 植株 2的株高
为 24 cm , 植株 7的冠幅为 84 cm , 植株 4和 7的筒状花数目分别为 133和 106, 表现超亲或低亲现象;
植株 2、 3、 4、 6和 7的其他性状均介于双亲之间 , 据此即可判断植株 2、 3、 4、 6和 7为杂种植株 。植
株 1和 5的形态性状大多与母本菊花脑接近 , 可能是由菊花脑子房壁等组织发育而来 , 为假杂种。
从菊花脑 、 黄英及其 5个杂种株系的花序和叶片 (图 4)可以发现杂种花序直径 、 叶长 、 叶宽 、叶
裂及叶缘锯齿等性状大多介于双亲之间 , 真叶外部形态更相似于栽培菊花黄英;不同株系的花序及真叶
的形态特征不同 。
试验中还发现杂交后代具备的某些父本特异性状或父母本不具备的新性状 , 亦可以作为判定杂种的
有效证据。如二倍体野生种菊花脑茎绿色 、花黄色 、茎及叶光滑无毛 、无托叶 、叶缘有锯齿且浅裂;四
26 南 京 农 业 大 学 学 报 第 28卷
倍体野菊茎 、叶皆被绒毛;栽培菊花黄英和滁菊茎均为紫色 、有托叶 、叶缘浅或中裂 、 茎及叶上均被绒
毛 , 黄英花黄色 , 滁菊花白色 。菊花脑与野菊的杂交后代中 , 杂种植株茎 、叶皆被绒毛 , 表现父本特异
性状。菊花脑与黄英的杂交后代中 , 表现父本黄英茎紫色 、 有托叶 、 茎及叶被绒毛特点的植株均为杂
种 。黄英与菊花脑杂交后代叶缘深裂 , 此为父母本均不具备的新性状 , 说明其全部为杂种。菊花脑与滁
菊后代除具有父本茎紫色 、 有托叶 、 茎及叶上均被绒毛特征外 , 不能正常开花 , 表现典型的杂种难稔
性 。
表 2 菊花脑 、 黄英及其后代的性状
Tab le 2 T ra its ofD. nankingense, D. morifo lium ‘Huangy ing’ and the ir F1 offspr ings
叶长 /cm
Length
of leaf
叶宽 /cm
W id th
of leaf
株高 /cm
S eed ling
heigh t
冠幅 /cm
C row n
d iam eter
花序直径 /cm
Flow er h ead
d iam eter
舌状花数目
Num ber of
ray f lorets
筒状花数目
Num ber of
tubu lar-f lorets
菊花脑 D. nankingense 4. 9 3. 0 40 71 1. 7 16 108
植株 1 P lan tlet1 5. 0 3. 0 44 72 1. 7 15 104
植株 2 P lan tlet2 5. 8 3. 3 24 47 1. 9 23 117
植株 3 P lan tlet3 5. 1 3. 1 26 49 2. 1 21 115
植株 4 P lan tlet4 5. 7 3. 8 40 60 2. 3 17 133
植株 5 P lan tlet5 4. 9 2. 8 47 70 1. 6 16 101
植株 6 P lan tlet6 7. 0 4. 1 35 57 3. 2 21 121
植株 7 P lan tlet7 6. 2 4. 4 38 84 2. 0 22 106
黄英 D. m orifolitum ‘Huangying’ 6. 5 4. 9 25 46 3. 9 23 126
图 4 菊花脑 ×黄英杂种及其亲本的叶 、 花序特征
F ig. 4 Morpho log ica l tra its o f in flo rescence and lea f o fD. nankingense, D. morifo lium
‘Huangying’ and the ir hyb r ids
(M. 菊花脑 D. nanking en se;F. 黄英 D. m orifolium ‘H uangy ing’ ;2、 3、 4、 6、 7. 杂种 Hybrid s)
二倍体野生种甘菊茎绿色 、叶缘深裂至叶柄。甘菊与黄英的杂交后代全部表现父本黄英茎紫色的特
点 , 而反交后代均出现叶缘深裂特点 , 据此判断甘菊与黄英正反交后代均为杂种。
二倍体野生种宜色菊茎绿色 、花黄色 、叶缘深裂至叶柄 , 栽培菊花紫勋章 、落霞及紫玉芙蓉茎均为
紫色 、 花紫色 、 叶缘浅或中裂 。紫勋章与宜色菊后代全部表现宜色菊叶缘深裂的特点;宜色菊与落霞杂
交后代均表现父本落霞茎紫色 、 花紫色的特异性状;宜色菊与紫玉芙蓉后代茎紫色 , 反交后代叶缘深
裂 , 同时正反交后代均开白色花 , 出现父母本不具备的新性状 , 据此可判断它们全部为杂种。
杂交后代中杂种表现出父本的某些特异性状如花色 、茎色 、 叶裂等 , 同时亦可能出现亲本不具有的
新性状 , 这与 RAPD扩增谱带的结果吻合。将田间形态学观察和统计分析与 RAPD技术鉴定 、染色体鉴
定进行比较 , 结果完全一致。
3 讨 论
形态学鉴定具有直观 、具体 、简单易行的特点 , 且试验成本较低 , 但形态特征易受到环境条件的影
响 , 且工作量较大。当具备某些具体特异识别性状时 , 可靠性高 , 鉴定较容易。细胞学鉴定简单明了 ,
可靠性高。 RAPD标记具有数量多 、多态性高 、 遗传稳定 , 不受栽培条件 、环境变化 、 组织器官 、 发育
阶段的影响等特点 , 具有更高的稳定性和可靠性 , 且用量少 , 快速简便 。 RAPD技术作为一种辅助育种
手段 , 其反应条件可标准化 , 在进行大规模杂种鉴定时 , 可在苗期去除一部分假杂种 , 减轻了工作量 。
本试验应用 RAPD技术鉴定菊属杂种 , 相同引物及不同引物对杂种的鉴定结果一致 , 可重复性较好 , 结
27 第 1期 李辛雷等:菊属种间杂种的鉴定
果比较可靠 。
W atanabe
[ 1]曾报道菊属种间杂种中染色体消亡及部分染色体双二倍体化的现象。菊花为异源六倍体
及其非整倍体 , 在遗传上高度杂合 , 产生的配子具有不同的基因型 , 而二倍体野生种产生的配子多比较
一致 , 因此结合后产生的后代具有不同的遗传组成 , 从而导致杂种的 RAPD扩增谱带并不一定是父母本
扩增谱带之和 , 而可能会出现某些谱带的消失或新的谱带出现 , 不同杂种株系的扩增谱带不同 。远缘杂
交过程中是否存在染色体缺失 、重复 、易位等结构变化 , 从而表现为杂种谱带的变化 , 有待于进一步深
入研究 。
二倍体野生种与栽培菊花杂种性状的变异谱较广 , 同时有新的性状出现 , 说明栽培菊花具复杂的遗
传基础 。无论正反交杂种部分形态特征均更多相似于多倍体 , 可能由于多倍体的遗传物质在杂种中占有
较大的比例 。至于杂种中是否存在基因的累积 、互作及显隐性作用 , 有待于进一步研究 。
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责任编辑:沈 波
《南京农业大学学报》荣获
2003年 “百种中国杰出学术期刊” 称号
2003年度中国科技论文统计结果发布会于 2004年 12月 7日在北京召开 。《南京农业大学学报》荣
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28 南 京 农 业 大 学 学 报 第 28卷