全 文 ：2010 第十二卷 第三期 ★Vol.12 No.3
〔World Science and Technology/Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica〕
收稿日期：2010-06-04
修回日期：2010-06-12
＊ 科技部国际科技合作项目（2007DFA30990）：中药材 DNA条形码鉴定研究，负责人：陈士林；卫生部卫生行业科研专项（200802043）：药用
植物 DNA barcoding（条形码）鉴定研究，负责人：陈士林。
＊＊ 联系人：李妮，硕士研究生，主要研究方向：中药资源和质量研究，E-mail：359039820@qq.com；陈科力，教授，主要研究方向：中药资源和质
量研究，E-mail：kelichen@126.com；陈士林，研究员，本刊学术副主编，主要研究方向：中药资源学，E-mail: slchen@implad.ac.cn。
摘 要：目的：评价 DNA条形码候选序列对景天属药用植物及其混伪品的鉴别能力，探索景天属
药用植物鉴定的新方法。方法：使用 ITS2、rbcL、matK和 psbA-trnH序列的通用引物对景天属药用植
物进行 PCR扩增和测序，通过比较各序列的扩增效率、种内和种间变异的显著性，以及 Barcoding
gap，采取 BLAST 1和 Nearest Distance 方法评价不同序列的鉴定能力。结果: ITS2序列在采集的景天
属几种药用植物中扩增成功率为 100%，其种内种间变异差异、Barcoding Gap较 psbA-trnH、rbcL序列
具有更明显的优势，而且纳入网上 48个样品 33个种的数据后鉴定成功率仍达到 100%。结论：ITS2
序列能够准确鉴定景天属药用植物，并将其与常见混伪品区别开，ITS2可推荐为景天属首选的 DNA
条形码序列。
关键词：DNA条形码 景天属 ITS2 药用植物 鉴定
doi: 10.3969/j.issn.1674-3849.2010.03.031
中国医学科学院
北京协和医学院
（ 药用植物研究所 北京 100193）
景天属药用植物 DNA条形码研究＊
□李 妮＊＊ 陈科力＊＊ 刘 震 叶丛进 （湖北中医药大学 武汉 430065）
陈士林＊＊
景天属（Sedum L.）隶属于景天科，为一年生或多
年生草本。全属有 470种左右，主要分布在北半球，
一部分分布在南半球的非洲和拉丁美洲。在我国，有
124个种，1亚种，14变种以及 1亚型，在西南地区种
类繁多。景天属在国内多做药用，例如，垂盆草（Se－
dum sarmentosum Bunge）对治疗急慢性肝炎有很好疗
效，不仅在我国民间[1]使用广泛，且在美国[2]，韩国[3]等
国也有使用记载。由于景天属近缘植物多，形态上较
为相似，其干燥后的中药材及加工后的中药饮片在形
态上就更难鉴别[4~5]。目前，关于景天属物种的鉴别除
形态学分类方法以外，报道的有 RAPD分子标记法[6]，
化学成分分析法等 [7]，但 RAPD 法重现性较差，化学
法还只能作为辅助的鉴别信息。随着现代分子生物
学的发展，DNA 条形码技术以其对生物物种鉴别具
有高效、简便、客观的特点 [8]，为药用植物的鉴定提供
了新的视野。
DNA条形码概念由加拿大动物学家 Paul Hebert
在 2003 年首次提出 [9]，现已成为生物分类学研究的
热点 [10]，该技术是利用一段标准 DNA 片段对物种进
行快速准确的鉴定 [8]，其核心工作为通用条形码序列
的筛选。近年来，植物条形码研究者已经提出了许多
条形码候选序列及其组合 [11]，但尚未达成一致意见，
2009年国际生命条形码联盟（Consortium for the Bar－
code of Life）在最新的研究结果中[12]，提议 rbcL+matK
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的复合序列作为整个植物界的通用条形码序列，但
由于研究中涉及的物种数、鉴定效率等问题，业内仍
在进行植物通用条形码序列的筛选工作。2010 年，
陈士林等 [13]针对广泛药用植物类群的 4800 个物种
6600个样本进行研究，发现 ITS2 序列在物种水平的
鉴定成功率超过 90%，结果表明，ITS2 序列能够较好
用于植物物种的鉴定工作。
在此背景下，本文选取近年来几个热点推荐的
植物 DNA 条形码候选序列 ITS2、rbcL、matK，以及
psbA-trnH 序列对景天属药用植物物种的鉴别进行
比较研究，考察各候选序列对该属的适用性，试图寻
找到适合景天属的药用植物 DNA 条形码，以期建立
该属药用植物的数字鉴定方法。
一、材料与方法
1. 材 料
景天属实验材料 8 个物种 15 份样品采自江西
庐山和湖北神农架等地，由湖北中医药大学生药教
研室潘宏林教授和神农架药监局龚山美药师鉴定，
数字影像信息及凭证标本保存于湖北中医药大学标
本馆。实验材料详见表 1，GenBank 数据库(数据下载
日期为 2009年 6月 10号)下载数据详见表 2。研究
材料包括景天属 33 种 48 个样本，其中≥2 个样本
数的物种有 11 个，涵盖景天属常用药用植物超过
90%以上。
2. 方 法
（1）样品 DNA 的提取、PCR扩增和测序。
取经过硅胶干燥的植物叶片约 10mg，经液氮研
磨后 , 使用植物 DNA 提取试剂盒 (Tiangen Biotech
Co., China)提取总 DNA。各候选序列的 PCR 反应条
件、通用引物及扩增程序参考陈士林等 [13]的研究。
PCR 扩增产物经纯化后，使用 ABI 3730XL 测序仪
(Applied Biosystems Co., USA)进行双向测序。
（2）数据的处理方法。
测序所得的峰图采用 CodonCode Aligner V 2.06
(CodonCode Co., USA) 校对拼接, 去除低质量序列及
引物区, 利用 ClustalX V2.0 (Higgins D.G.) 进行多序
列比对并查错，可用数据纳入后续分析。ITS2 序列依
照 Keller 等 [14]的方法处理，其他的序列采用 Codon－
Code Aligner 处理。利用实验材料考察各候选序列的
PCR 扩增效率的优劣，采选用罗焜 [15]、朱英杰 [16]等方
法，对不同序列种间、种内变异大小进行比较，并采
取 Wilcoxon Signed Rank Tests 检验 [17]对计算结果进
行检验，再通过 TAXON DNA软件[18]做出各候选序列
的 Barcoding Gap 图。最后纳入 GenBank 数据库，可
用数据采用相似性搜索算法（BLAST 1）和最近距离
法（Nearest Distance）考察序列的鉴定成功率[19]。
二、结 果
1. 各个候选序列 PCR 扩增成功率、长度、GC
含量
通过对实验样本的数据 PCR 扩增成功率考察，
发现 15 个样本的 ITS2、psbA-trnH 以及 rbcL 扩增效
率均为 100%，而 matK序列的 PCR扩增成功率仅为
5.9%，故在后续研究中排除 matK序列。其余 3 条序
列的长度不等，其中 ITS2 序列最短，为 230~242bp，
rbcL序列最长，为 688~690bp。各序列的 GC 含量也
有不同，ITS2的 GC含量最高，有 53.2%，psbA-trnH
的则最低，只有 31.5%，见表 3。
2. 不同候选 DNA条形码序列的种内、种间变异
的差异分析
表 1 实验实际采集样本的属种名称、采集地点信息
中文名 拉丁名 样本采集地
轮叶景天 Sedum chauveaudii 湖北神农架
大叶火焰草 Sedum drymarioides 湖北神农架
费菜 Sedum aizoon 江西庐山
凹叶景天 Sedum emarginatum 湖北神农架
小山飘风 Sedum filipes 湖北神农架
垂盆草 Sedum sarmentosum 湖北神农架
珠芽景天 Sedum bulbiferum 江西庐山
火焰草 Sedum stellariifolium 湖北神农架
表 2 GenBank数据上下载数据登录号信息
序列名称 GenBank登录号
ITS2
EF632174，AY545712，AY352897，AB088628，
FJ897738-FJ897740，AY545713，AY545714，
EF632175，AY545715，EU592006，AB088617
-AB088627，AY082100，AY082101，AB088629
-AB088632，AY545716，EF632176，AY545717，
EU592003
表 3 候选序列 PCR扩增成功率、长度、GC含量
psbA-trnH rbcL ITS2
PCR扩增成功率 (%) 100 100 100
序列长度(bp) 249~378 688~690 230~242
GC 含量 (%) 33.53 43.1 53.2
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考察种内种间差异时引入“种间变异”、“种内变
异”以说明各候选序列两者的大小，“种间最小变异”
和“种内最大变异”以判断两者差异的显著性。结果
（表 4）表明，ITS2序列的种间变异最大，rbcL序列最
小，种内变异的情况同样是 ITS2序列变异最大，rbcL
序列最小，但 ITS2、psbA-trnH 序列的种间最小变异
和种内最大变异存在显著性差异，而 rbcL序列两者
之间差异不明显。
通过 Wilcoxon Signed Rank Tests 检验对上述计
算结果进行检验，结果（见表 5~6）证明上述结果的正
确性。
3. 景天属不同 DNA条形码候选序列的 Barcod－
ing Gap检验
理想的条形码序列应该具有一定 Barcoding
Gap，即种间变异与种内变异两者之间应存在显著
差异，且种间变异应明显大于种内变异。使用
TAXON DNA 软件分析各候选序列, 并做出 Barcod－
ing Gap图（如图 1），结果显示 ITS2序列的 Barcoding
Gap 较为明显，psbA-trnH 也存在 Barcoding Gap，但
不及 ITS2序列显著，rbcL的 Barcoding Gap 中，种间
变异明显向种内倾斜，Barcoding Gap 不明显。
4. 景天属 DNA 条形码候选序列的鉴定效率
评价
由于实验采集样本数有限，故纳入网上景天属
ITS2可用数据，在更大样本量下（48个样本），考察其
鉴定成功率。结果表明，ITS2序列在样本量最大的情
况下，经 BLAST 1 和 Nearest Distance
两种不同方法评价，其在物种水平的鉴
定成功率依然为 100%，见表 7。
三、讨 论
1. 景天属筛选候序列的筛选
景天属植物具有较大的药用价值
但又具有较高的相似性，准确地鉴定物
种，对该属植物的遗传育种、种质资源
的深入研究、保护和利用都具有重要的
理论和实践价值。本文从当前植物学界
推荐的条 4个热点候选序列中，通过研
究发现 ITS2 序列是最适合景天属的
DNA 条形码序列，为鉴定景天属药用
植物奠定了基础。
理想的 DNA条形码序列应具有明
显的种间变异，同时又有足够小的种内变异，而且应
该能够使用单引物对进行扩增，通过双向测序得到
高质量的序列[20~21]。本文在研究中发现针对景天属药
用植物考察时，利用的 ITS2 标准序列长度只有
450bp左右，无论在新鲜或降解组织中都较容易扩增
和测序，具有很高的应用价值。而且 ITS2序列可基于
隐马尔可夫模型 [22]去除两端 5.8S 和 26S 区段，获得
完整 ITS2间隔区序列，使后续数据处理更准确可靠，
这也是目前其他候选条形码序列不具备的优势。针
对景天属的研究结果表明 ITS2序列具有良好的 PCR
效率和测序成功率（100%），在所考察的候选序列中
具有最大的种间变异和较小的种内变异，且两者存
在极显著性差异，同时在样本量最大的情况下物种
鉴定成功率仍然达到 100%，故推荐 ITS2序列作为景
天属药用植物研究的条形码序列。
国际条形码工作组 CBOL 在最新的研究中推
荐 rbcL+matK作为植物条形码序列 [12]。rbcL序列在
GenBank中有大量的数据，并具有通用、易扩增、易比
对的优点，但是其变异主要存在于种以上水平，物
种水平通常变异不够大 [11，17]。而 matK 片段相对于其
他编码区片段进化速率较快，但其引物在不同物种
间通用性差别较大 [10，13]。在景天属的 16 份样品中，
matK 序列的 PCR 扩增成功率仅为 5.9%，故在后续
研究中排除了 matK序列。而 rbcL序列，尽管 PCR效
率和鉴定成功率都达到 100%，但其涉及的样本数较
少，且种间、种内变异差异的不存在显著性差异，扩
表 4 景天属 3个候选序列的种内种间差异
psbA-trnH rbcL ITS2
种间变异 0.0127±0.0163 0.0013±0.0027 0.0493±0.0517
种内变异 0.0086±0.0171 0.0009±0.0018 0.0165±0.0193
种间最小变异 0.0057±0.0142 0.0010±0.0029 0.0452±0.0639
种内最大变异 0.0111±0.0230 0.0009±0.0018 0.0144±0.0179
表 5 两两序列种间差异的Wilcoxon检验
W+ W- 种内变异相关性, n, P值 结果
ITS2 rbcL W+=406.0, W-=0, n=28, P≤0.0094 ITS2> rbcL
psbA-trnH ITS2 W+=406.0, W-=0, n=28, P≤0.0095 psbA-trnH
表 6 两两序列种内差异的Wilcoxon检验
W+ W- 种内变异相关性, n, P值 结果
ITS2 rbcL W+=42.0,W-=3.0, n=9, P<0.0207 ITS2>rbcL
ITS2 psbA-trnH W+=50.0,W-=16.0, n=11, P<0.1307 ITS2=psbA-trnH
psbA-trnH rbcL W+=55.0,W-=0, n=10, P<0.0051 psbA-trnH>rbcL
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大样本量其鉴定结果可能会发生变化。非编码区的
psbA-trnH序列，其间隔区在被子植物中具有高度变
异性[23]，它的两端具有 75bp的保守区序列，便于设计
通用引物[23~25]，在景天属中的扩增效率达 100%，本文
研究中发现，psbA-trnH 序列物种的水平鉴定成功率
达到 100%，并且种间、内变异存在显著性差异，虽然
其种间、种内变异的差异较 ITS2序列小，但可视为景
天属潜在的或补充的植物条形码序。
2. ITS2序列对近缘种及混伪品的鉴别能力
DNA条形码的一个重要优势是能够鉴别在形态
上极为相似的近缘物种。在本文采集的样品以及从
GeneBank下载的数据中，有很多近缘的物种，例如大
叶火焰草和火焰草，用本文推荐的 ITS2 和 psbA-
trnH序列，都可将它们一一鉴别开。由于景天属是一
个药用植物很丰富的类群，市场上存在很多的混伪
品，例如具有解毒、止痛、止血之功的垂盆草常见的
混淆品及伪品有佛甲草、鼠曲草、鸭跖草、墨旱莲 [4]、
景天、凹叶景天 [5]等，本实验中我们通过实地采集和
纳入网上数据的方法，选取 ITS2 序列，利用 BLAST1
和 Nearest Distance 的方法进行分析，能完全成功地
区分该种植物及其混伪品。
DNA条形码从遗传学角度鉴定物种，以一段短的
基因片段作为通用序列实施鉴定，能够在大的分类类
群中形成统一的标准，具有高通量、自动化、可靠性高
等特点。DNA条形码技术已经在动物中得到广泛应
用，在植物中的研究也达到了极大的重视。这项工作这
将有助于非分类学专业工作者对物种进行快速、准确
的鉴定。虽然国际上已经推荐了几个较好的 DNA条形
码候选序列，但对每一个科，一个属还要具体问题具体
分析。本研究为 DNA条形码技术在景天科药用植物中
的应用进行了新的探索，也为该属植物亲缘关系的研
究提供了新的方法和思路。由于采样条件的限制，有些
物种缺乏重复个体，相信随着全世界研究人员集中对
该属植物材料的 ITS2和 psbA-trnH序列进行研究，汇
集和整合相关数据，将能够提供
更多有效的信息和建立较完整的
景天属 DNA数字鉴别信息库。
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图 1 候选序列的 Barcoding Gap图
表 7 比对法和最小距离法分析 5条候选序列的鉴定效率
序列 鉴定方法 物种数
鉴定成功率(%) 鉴定错误率(%) 模糊鉴定率(%)
物种水平 属水平 物种水平 属水平 物种水平 属水平
ITS2 比对法 32 100.0 100.0 0 0 100.0 100.0
最小距离法 32 100.0 100.0 0 0 100.0 100.0
psbA-trnH 比对法 15 100.0 100.0 0 0 100.0 100.0
最小距离法 15 100.0 100.0 0 0 100.0 100.0
rbcL 比对法 15 100.0 100.0 0 0 100.0 100.0
最小距离法 15 100.0 100.0 0 0 100.0 100.0
ITS2序列
psbA-trnH序列
rbcL序列
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〔World Science and Technology/Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica〕
（责任编辑：王 瑀，责任译审：张立崴）
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Identification of Medicinal Plants from Genus Sedum Based on DNA Barcoding
Li Ni1，Chen Keli1，Liu Zhen1, Ye Congjin1, Chen Shilin2
(1. Hubei University of Chinese Traditional Medicine, Wuhan 430065, China;
2. Institute of Medicinal Plant Development, Peking Union Medical College & Chinese Academy of Medical
Sciences, Beijing 100193, China)
Abstract: This study aimed to test and evaluate different DNA barcoding sequences and develop a new method for
identification of the medicinal plants in genus Sedum. Using universal primers, three chloroplast sequences, psbA-
trnH, rbcL, matK and nuclear ribosomal DNA ITS2, were amplified and sequenced. PCR amplification and sequenc-
ing efficiency, intra- and inter-specific divergence, barcoding gap and identification efficiency were used to evaluate
different loci. The ITS2 of all samples of Sedum studied was amplified and sequenced. Analysis of the intra- and
inter-specific divergence and barcoding gap showed that ITS2 was superior to other loci. 48 samples of 32 species
of Sedum were identified by ITS2. Taken together, medicinal plants in genus Sedum can be identified correctly us-
ing ITS2 sequence, which may be a potential DNA barcode for identifying other medicinal plants.
Keywords: DNA barcoding, Sedum, ITS2, Medicinal plants, Identification
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