全 文 :橐吾属药用植物 5S rRNA基因间隔区序列与
含HPAs植物的鉴别
张 勉* ,张达治 ,许翔鸿 ,张 婷 ,王峥涛
中国药科大学生药学研究室 ,南京 210038
【摘 要】 目的:对橐吾属 Ligularia 药用植物的 5S rRNA基因间隔区序列进行测定 ,为含肝毒吡咯里西啶
生物碱(HPAs)植物的鉴别提供分子依据。方法:对 12 种橐吾属植物的 5S rRNA 区序列进行 PCR扩增 、测序 , 并
运用 CLUSTAL、MEGA 等软件对所测序列进行了排序 、对比和分析。结果:建立了 12 种橐吾属药用植物的 5S
rRNA 区序列数据库 ,橐吾属植物在该区间具有显著的种间差异 ,替代数为 3 ~ 53 , 变异位点数 128 个 ,信息位点
数58 个。结论:含HPAs的橐吾属植物的 5S rRNA 区序列具有明显而稳定的特异性鉴别位点 , 可用作该类型植
物鉴别的分子标记。
【关键词】 橐吾属;5S rRNA区序列;含 HPAs植物;分子鉴别
【中图分类号】 R282.71 【文献标识码】 A 【文章编号】 1672-3651(2005)01-0000-03
【收稿日期】 2004-03-23
【基金项目】 国家自然科学基金项目(No.30270157)和国家杰出
青年基金项目(No.39825129)部分研究内容
【*通讯作者】 张勉:副教授 ,Tel:025-85391246 Email:mianzhang@
hotmail.com
在我国西南 、西北地区和东北部分地区 ,橐吾
属Ligularia Cass.植物常被用作中药紫菀(Aster
tataricus L.f的根及根茎)的代用品 , 统称为山紫
菀。橐吾属仅药用种类就有 40多种 ,植物和药材
形态较为相似 ,鉴别较困难 ,而且在橐吾属的部分
种类中含有肝毒吡咯里西啶生物碱(hepatotoxic
pyrrolizidine alkaloids ,HPAs),因此药用种类的正确
鉴别关系到临床用药的安全性。为此我们曾经报
道了 rDNA ITS 序列在该属植物鉴别中的应用[ 1] ,
本文报道 5S rRNA 基因间隔区序列的测定和分
析 ,以及对含HPAs橐吾属植物鉴别的意义 。
1 材料与方法
实验所用研究材料为采自四川 、云南 、甘肃的
原植物标本和药材 ,经作者鉴定 ,其种类 、来源和
GenBank检索号见表 1 ,凭证样品存放于中国药科
大学生药学研究室。
2 实验方法
2.1 总DNA提取
同文献1中“总 DNA提取”
Table 1 Taxa included in the study of Ligularia species
No.Plant name Herbarium No. Collected area GenBank No.
1 L.dentata 020004 Zhang County , Gansu AY494075
2 L.nelumbifolia 020003 Zhang County , Gansu AY494073
3 L.lapathifolia 990005 Li jiang County ,Yunnan AY494077
4 L.tongolensis 8025 Kangding ,Sichuan AY494076
5 L.narynensis 8049 Tianshan ,Xinjiang AY494078
6 L.subspicata 8022 Kangding ,Sichuan AY494067
7 L.przewalskii 8014 Ganzi , Sichuan AY494070
8 L.lankongensis 010001 YulongxueShan , Yunnan AY494072
9 L.kanaitzensis 990010 YulongxueShan , Yunnan AY494068
10 L.sagitta 020006 Zhang County , Gansu AY494069
11 L.pleurocaulis 8003 Zheduo Mountain, Sichuan AY494074
12 L.virgaurea 020002 Zhang County , Gansu AY494071
2.2 PCR扩增与产物纯化
根据 GenBank中有关菊科植物的 5S rRNA 序
列[ 3] ,设计了一对橐吾属植物 5S rRNA 基因间隔
区的扩增引物 5s1 和 5s2 , 5s1 为 5′-ACTGCG-
GAGTTCTGATG G-3′;5s2 为 5′-GTGCTTGGGCGA-
GAGTAG-3′。30 μl 反应体积含 10×PCR buffer 3
μl ,MgCl2(25mmol/L)2.0μl ,dNTP mix(2.5mmol/L)
1.5 μl ,两个引物各 1μl(10 pmol/L),Taq DNA poly-
merase(5 U/μl)0.2 μl ,模板溶液 0.9 μl(DNA 约 90
ng), ddH2O 适量。反应在 Eppendorf(r)Mastercycler
(r)Gradient型 PCR仪上进行 ,循环参数为 94 ℃预
变性 5 min ,然后经93 ℃变性 30 s ,58 ℃退火 30 s ,
72 ℃复性延伸 15 s(+1 s per cycle),共 30个循环
后 ,72 ℃延伸 10 min。以重蒸馏水为空白对照 ,进
行扩增。PCR扩增产物用 Vitagene试剂盒纯化。
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2.3 DNA序列测定
纯化后的 PCR产物作为测序反应的模板 ,由
上海联合基因公司测定 5S rRNA 基因间隔区的序
列。
2.4 DNA序列数据分析和系统树的构建
测序所得序列先手工校对改正错读碱基 ,再
用Clustal X 1.8进行排序。排序结果输入MEGAV
2.1 软件进行统计分析得到替代数和遗传距离
(Kimura-2 parameter genetic distance)。
3 结果与讨论
3.1 橐吾属5S rRNA基因间隔区序列分析
橐吾属12种植物的 5S-rRNA基因间隔区序列
的长度分别在 274 ~ 335 bp之间 ,GC 含量在 40.1
~ 48.2%之间 ,变异位点 128个 ,信息位点 58个 ,
替代数在 3 ~ 53之间 ,平均值为 32.7 ,遗传距离在
1.10 ~ 17.9范围内 ,平均值为 11.5。从以上数据
来看 ,橐吾属植物 5S-rRNA 区序列的长度 、GC 含
量 、替代数和遗传距离的变异都较大 , 这可能与
5S-rRNA基因间隔区所受的选择压力较小有关。
5种含 HPAs的橐吾属植物(如表 2所示),其
替代数在 17 ~ 53 之间 ,平均值为 36.2 ,遗传距离
为 5.93 ~ 17.77 ,平均值为 12.77;不含 HPAs 的橐
吾属植物替代数在 3 ~ 43之间 ,平均值为 29.1 ,遗
传距离 1.10 ~ 14.17 ,平均值为 10.22。可看出 ,含
HPAs的植物其替代数和遗传距离的平均值 ,都高
于不含 HPAs的植物 ,说明两者间存在一定差异;
但从替代数和遗传距离的范围来看 ,两者是交叉
的 ,不能将两类型植物截然分开 ,说明这两类型植
物在分类系统中是混在一起的 ,没有明显的区别 。
Table 2 Numbers of substitutions(below diagonal)and percentage of the genetic distance(above diagonal)of 5S rRNA gene spacer sequences of
Ligularia plants
Sample* 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
1 L.subspicata 1.10 6.71 6.11 6.92 9.85 11.04 10.23 9.35 8.95 13.29 11.18
2 L.kanaitzensis 3 7.97 7.31 7.34 10.27 12.33 11.51 9.78 10.21 14.63 12.49
3 L.sagitta* 17 20 5.93 8.98 10.96 11.29 13.02 11.26 10.09 15.79 14.27
4 L.przewalski 16 19 18 9.89 10.66 10.60 12.80 11.70 10.99 15.14 14.77
5 L.virgaurea 18 19 27 30 11.18 11.79 13.81 10.37 9.94 14.24 13.89
6 L.lankongensis* 25 26 31 31 33 11.91 9.40 10.77 13.08 17.77 15.79
7 L.nelumbifolia 28 31 32 31 35 35 12.15 11.78 11.79 15.28 14.89
8 L.pleurocaulis 26 29 38 38 42 28 36 13.26 14.17 17.90 15.67
9 L.dentate * 24 25 32 34 31 32 35 39 11.82 15.67 15.27
10 L.lapathifolia 23 26 30 33 31 38 35 43 35 8.25 12.45
11 L.tongolensis* 33 36 45 44 43 50 44 53 45 26 15.39
12 L.narynensis* 28 31 41 43 42 45 43 47 44 38 46
*HPAs-contained species
Table 3 Diagnostic sites in 5S rRNA sequences of HPAs-containing plants of Ligularia
Species Diagnostic site Basic group of selected taxon Basic group of other taxa
L.dentat 57 , 59, 163 , 167 , 276 ,330, 333 A , C , G , G , A , T , T C , G , T , C or T , T or C , A , A
L.sagitta 37 , 212 , 281 , 323 T ,G ,C , G C , A , A , A
L.tongolensis 4 ,5 , 47, 65 ,66 ,97 , 112 , 148 , 183, 209,
223 , 249 ,265, 267
G , T ,A ,T ,T ,T , T , A , G , A , G , T , T ,C A ,G , C , C or A , C or T ,C , G ,C or T ,
A ,G or T , A , A , A , G
L.lankongensis 297 , 298 ,301, 305 C , G , A , G T ,T , C ,T
L.narynensis 51 , 66 , 77 , 82 , 88, 90 , 139 , 147 , 168,
195 , 213 ,218, 254 , 257 , 259 ,260, 266
C ,A , G , T , A , C , T , T , T , T , C , C , G ,
C , C ,T ,T
T , C or T ,A ,A ,C , T ,C , C , C , C, T , A ,
A or T , T , A or T , A or C , C or G
中国天然药物 2005年 1月 第 3卷 第 1期 Chin J Nat Med Jan.2005 Vol.3 No.1 39
3.2 含HPAs植物的鉴别
对橐吾属药用植物的 5S rRNA基因间隔区序
列进行比对 ,比对后的碱基总长度为 342bp ,通过
对比分析 ,找出了上述 5种含 HPAs植物的特异性
鉴别位点 ,如表 3所示 。
参 考 文 献
[ 1] 张达治(Zhang DZ),张 勉(Zhang M),许翔鸿(Xue XH),等.
含吡咯里西啶生物碱的山紫菀类药材的分子鉴别[ J] .中国
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[ 4] 中国科学院中国植物志编委会.中国植物志 77卷(第 2分
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[ 5] 刘尚武(Liu SW),邓德山(Deng DS),刘建全(Liu JQ).橐吾属
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5S rRNA Gene Spacer Sequences from Ligularia Medicinal
Plants and the Identification of HPAs-containing Species
ZHANG Mian* ,ZHANG Da-Zhi ,XU Xiang-Hong ,ZHANG Ting ,WANG Zheng-Tao
Department of Pharmacognosy ,China PharmaceuticaUniversity , Nanjing 210038
【ABSTRACT】 AIM:Sequencing the 5S rRNA gene spacer of Ligularia medicinal plants(named “ Shanziwan” in Chinese)in order to
establish a molecular method to distinguish the HPAs(hepatotoxic pyrrolizidine alkaloids)-containing Ligularia herbs from the
others.METHOD:The genome DNAs from 12 species of Ligularia were extracted by CTAB method , amplified by PCR method and then
sequenced.The obtained data were analyzed by Clustal X 1.8 andMega V 2.1 software.RESULT:A database of the 5S rRNA gene spacer
sequences of 12 species of Ligularia were established.The differences among the 12 species of the 5S rRNA gene spacer were demonstrat-
ed , the numbers of substitutions among 12 species were 3~ 53 , variable sites 128 and informative site 58.CONCLUSION:The characteris-
tic distinguishing sites of 5S rRNA sequences from HPAs-containing plants of Ligularia were obvious and stable , and it means that this frag-
ment is a good molecular marker for authentication of this type herbs.
【KEY WORDS】 Ligularia;5S rRNA gene spacer sequences;HPAs-containing plants;Molecular identification
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40 Chin J Nat Med Jan.2005 Vol.3 No.1 中国天然药物 2005年 1月 第 3卷 第 1期