全 文 ：橐吾属药用植物 5S rRNA基因间隔区序列与
含HPAs植物的鉴别
张　勉＊ ,张达治 ,许翔鸿 ,张　婷 ,王峥涛
中国药科大学生药学研究室 ,南京 210038
【摘　要】　目的:对橐吾属 Ligularia 药用植物的 5S rRNA基因间隔区序列进行测定 ,为含肝毒吡咯里西啶
生物碱(HPAs)植物的鉴别提供分子依据。方法:对 12 种橐吾属植物的 5S rRNA 区序列进行 PCR扩增 、测序 , 并
运用 CLUSTAL、MEGA 等软件对所测序列进行了排序 、对比和分析。结果:建立了 12 种橐吾属药用植物的 5S
rRNA 区序列数据库 ,橐吾属植物在该区间具有显著的种间差异 ,替代数为 3 ～ 53 , 变异位点数 128 个 ,信息位点
数58 个。结论:含HPAs的橐吾属植物的 5S rRNA 区序列具有明显而稳定的特异性鉴别位点 , 可用作该类型植
物鉴别的分子标记。
【关键词】　橐吾属;5S rRNA区序列;含 HPAs植物;分子鉴别
【中图分类号】　R282.71　　【文献标识码】　A　　【文章编号】　1672-3651(2005)01-0000-03
【收稿日期】　2004-03-23
【基金项目】　国家自然科学基金项目(No.30270157)和国家杰出
青年基金项目(No.39825129)部分研究内容
【＊通讯作者】　张勉:副教授 ,Tel:025-85391246 Email:mianzhang@
hotmail.com
　　在我国西南 、西北地区和东北部分地区 ,橐吾
属Ligularia Cass.植物常被用作中药紫菀(Aster
tataricus L.f的根及根茎)的代用品 , 统称为山紫
菀。橐吾属仅药用种类就有 40多种 ,植物和药材
形态较为相似 ,鉴别较困难 ,而且在橐吾属的部分
种类中含有肝毒吡咯里西啶生物碱(hepatotoxic
pyrrolizidine alkaloids ,HPAs),因此药用种类的正确
鉴别关系到临床用药的安全性。为此我们曾经报
道了 rDNA ITS 序列在该属植物鉴别中的应用[ 1] ,
本文报道 5S rRNA 基因间隔区序列的测定和分
析 ,以及对含HPAs橐吾属植物鉴别的意义 。
1　材料与方法
实验所用研究材料为采自四川 、云南 、甘肃的
原植物标本和药材 ,经作者鉴定 ,其种类 、来源和
GenBank检索号见表 1 ,凭证样品存放于中国药科
大学生药学研究室。
2　实验方法
2.1　总DNA提取
同文献1中“总 DNA提取”
Table 1　Taxa included in the study of Ligularia species
No.Plant name Herbarium No. Collected area GenBank No.
1 L.dentata 020004 Zhang County , Gansu AY494075
2 L.nelumbifolia 020003 Zhang County , Gansu AY494073
3 L.lapathifolia 990005 Li jiang County ,Yunnan AY494077
4 L.tongolensis 8025 Kangding ,Sichuan AY494076
5 L.narynensis 8049 Tianshan ,Xinjiang AY494078
6 L.subspicata 8022 Kangding ,Sichuan AY494067
7 L.przewalskii 8014 Ganzi , Sichuan AY494070
8 L.lankongensis 010001 YulongxueShan , Yunnan AY494072
9 L.kanaitzensis 990010 YulongxueShan , Yunnan AY494068
10 L.sagitta 020006 Zhang County , Gansu AY494069
11 L.pleurocaulis 8003 Zheduo Mountain, Sichuan AY494074
12 L.virgaurea 020002 Zhang County , Gansu AY494071
2.2　PCR扩增与产物纯化
根据 GenBank中有关菊科植物的 5S rRNA 序
列[ 3] ,设计了一对橐吾属植物 5S rRNA 基因间隔
区的扩增引物 5s1 和 5s2 , 5s1 为 5′-ACTGCG-
GAGTTCTGATG G-3′;5s2 为 5′-GTGCTTGGGCGA-
GAGTAG-3′。30 μl 反应体积含 10×PCR buffer 3
μl ,MgCl2(25mmol/L)2.0μl ,dNTP mix(2.5mmol/L)
1.5 μl ,两个引物各 1μl(10 pmol/L),Taq DNA poly-
merase(5 U/μl)0.2 μl ,模板溶液 0.9 μl(DNA 约 90
ng), ddH2O 适量。反应在 Eppendorf(r)Mastercycler
(r)Gradient型 PCR仪上进行 ,循环参数为 94 ℃预
变性 5 min ,然后经93 ℃变性 30 s ,58 ℃退火 30 s ,
72 ℃复性延伸 15 s(+1 s per cycle),共 30个循环
后 ,72 ℃延伸 10 min。以重蒸馏水为空白对照 ,进
行扩增。PCR扩增产物用 Vitagene试剂盒纯化。
38　　Chin J Nat Med　Jan.2005　Vol.3　No.1 中国天然药物　2005年 1月　第 3卷　第 1期
2.3　DNA序列测定
纯化后的 PCR产物作为测序反应的模板 ,由
上海联合基因公司测定 5S rRNA 基因间隔区的序
列。
2.4　DNA序列数据分析和系统树的构建
测序所得序列先手工校对改正错读碱基 ,再
用Clustal X 1.8进行排序。排序结果输入MEGAV
2.1 软件进行统计分析得到替代数和遗传距离
(Kimura-2 parameter genetic distance)。
3　结果与讨论
3.1　橐吾属5S rRNA基因间隔区序列分析
橐吾属12种植物的 5S-rRNA基因间隔区序列
的长度分别在 274 ～ 335 bp之间 ,GC 含量在 40.1
～ 48.2%之间 ,变异位点 128个 ,信息位点 58个 ,
替代数在 3 ～ 53之间 ,平均值为 32.7 ,遗传距离在
1.10 ～ 17.9范围内 ,平均值为 11.5。从以上数据
来看 ,橐吾属植物 5S-rRNA 区序列的长度 、GC 含
量 、替代数和遗传距离的变异都较大 , 这可能与
5S-rRNA基因间隔区所受的选择压力较小有关。
5种含 HPAs的橐吾属植物(如表 2所示),其
替代数在 17 ～ 53 之间 ,平均值为 36.2 ,遗传距离
为 5.93 ～ 17.77 ,平均值为 12.77;不含 HPAs 的橐
吾属植物替代数在 3 ～ 43之间 ,平均值为 29.1 ,遗
传距离 1.10 ～ 14.17 ,平均值为 10.22。可看出 ,含
HPAs的植物其替代数和遗传距离的平均值 ,都高
于不含 HPAs的植物 ,说明两者间存在一定差异;
但从替代数和遗传距离的范围来看 ,两者是交叉
的 ,不能将两类型植物截然分开 ,说明这两类型植
物在分类系统中是混在一起的 ,没有明显的区别 。
Table 2　Numbers of substitutions(below diagonal)and percentage of the genetic distance(above diagonal)of 5S rRNA gene spacer sequences of
Ligularia plants
Sample＊ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
1 L.subspicata 1.10 6.71 6.11 6.92 9.85 11.04 10.23 9.35 8.95 13.29 11.18
2 L.kanaitzensis 3 7.97 7.31 7.34 10.27 12.33 11.51 9.78 10.21 14.63 12.49
3 L.sagitta＊ 17 20 5.93 8.98 10.96 11.29 13.02 11.26 10.09 15.79 14.27
4 L.przewalski 16 19 18 9.89 10.66 10.60 12.80 11.70 10.99 15.14 14.77
5 L.virgaurea 18 19 27 30 11.18 11.79 13.81 10.37 9.94 14.24 13.89
6 L.lankongensis＊ 25 26 31 31 33 11.91 9.40 10.77 13.08 17.77 15.79
7 L.nelumbifolia 28 31 32 31 35 35 12.15 11.78 11.79 15.28 14.89
8 L.pleurocaulis 26 29 38 38 42 28 36 13.26 14.17 17.90 15.67
9 L.dentate ＊ 24 25 32 34 31 32 35 39 11.82 15.67 15.27
10 L.lapathifolia 23 26 30 33 31 38 35 43 35 8.25 12.45
11 L.tongolensis＊ 33 36 45 44 43 50 44 53 45 26 15.39
12 L.narynensis＊ 28 31 41 43 42 45 43 47 44 38 46
＊HPAs-contained species
Table 3　Diagnostic sites in 5S rRNA sequences of HPAs-containing plants of Ligularia
Species Diagnostic site Basic group of selected taxon Basic group of other taxa
L.dentat 57 , 59, 163 , 167 , 276 ,330, 333 A , C , G , G , A , T , T C , G , T , C or T , T or C , A , A
L.sagitta 37 , 212 , 281 , 323 T ,G ,C , G C , A , A , A
L.tongolensis 4 ,5 , 47, 65 ,66 ,97 , 112 , 148 , 183, 209,
223 , 249 ,265, 267
G , T ,A ,T ,T ,T , T , A , G , A , G , T , T ,C A ,G , C , C or A , C or T ,C , G ,C or T ,
A ,G or T , A , A , A , G
L.lankongensis 297 , 298 ,301, 305 C , G , A , G T ,T , C ,T
L.narynensis 51 , 66 , 77 , 82 , 88, 90 , 139 , 147 , 168,
195 , 213 ,218, 254 , 257 , 259 ,260, 266
C ,A , G , T , A , C , T , T , T , T , C , C , G ,
C , C ,T ,T
T , C or T ,A ,A ,C , T ,C , C , C , C, T , A ,
A or T , T , A or T , A or C , C or G
中国天然药物　2005年 1月　第 3卷　第 1期 Chin J Nat Med　Jan.2005　Vol.3　No.1　39　
3.2　含HPAs植物的鉴别
对橐吾属药用植物的 5S rRNA基因间隔区序
列进行比对 ,比对后的碱基总长度为 342bp ,通过
对比分析 ,找出了上述 5种含 HPAs植物的特异性
鉴别位点 ,如表 3所示 。
参 考 文 献
[ 1] 　张达治(Zhang DZ),张　勉(Zhang M),许翔鸿(Xue XH),等.
含吡咯里西啶生物碱的山紫菀类药材的分子鉴别[ J] .中国
天然药物(Chin J Nat Med), 2003, 1(4):207-209.
[ 2] 　Clark MS.主编 ,顾红雅(Gu HY), 瞿礼嘉(Qu LJ)主译.植物
分子生物学-实验手册[M] .北京:高等教育出版社 ,施普林
格出版社 , 1998.3-7.
[ 3] 　Nalaskowska M , Opiola T , Barciszewski J.The nucleot ide sequence of
ribosomal 5S RNA from let tuce seeds[ J] .Nucleic Acids Research ,
1991 ,19(6):1345
[ 4] 　中国科学院中国植物志编委会.中国植物志 77卷(第 2分
册)[M] .北京:科学出版社 , 1989.1-115.
[ 5] 　刘尚武(Liu SW),邓德山(Deng DS),刘建全(Liu JQ).橐吾属
的起源 、演化与地理分布 [ J] .植物分类学报(Acta phytotaxon
Sin),1994 , 32(6):514-524.
5S rRNA Gene Spacer Sequences from Ligularia Medicinal
Plants and the Identification of HPAs-containing Species
ZHANG Mian＊ ,ZHANG Da-Zhi ,XU Xiang-Hong ,ZHANG Ting ,WANG Zheng-Tao
Department of Pharmacognosy ,China PharmaceuticaUniversity , Nanjing 210038
【ABSTRACT】　AIM:Sequencing the 5S rRNA gene spacer of Ligularia medicinal plants(named “ Shanziwan” in Chinese)in order to
establish a molecular method to distinguish the HPAs(hepatotoxic pyrrolizidine alkaloids)-containing Ligularia herbs from the
others.METHOD:The genome DNAs from 12 species of Ligularia were extracted by CTAB method , amplified by PCR method and then
sequenced.The obtained data were analyzed by Clustal X 1.8 andMega V 2.1 software.RESULT:A database of the 5S rRNA gene spacer
sequences of 12 species of Ligularia were established.The differences among the 12 species of the 5S rRNA gene spacer were demonstrat-
ed , the numbers of substitutions among 12 species were 3～ 53 , variable sites 128 and informative site 58.CONCLUSION:The characteris-
tic distinguishing sites of 5S rRNA sequences from HPAs-containing plants of Ligularia were obvious and stable , and it means that this frag-
ment is a good molecular marker for authentication of this type herbs.
【KEY WORDS】　Ligularia;5S rRNA gene spacer sequences;HPAs-containing plants;Molecular identification
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40　　Chin J Nat Med　Jan.2005　Vol.3　No.1 中国天然药物　2005年 1月　第 3卷　第 1期