全 文 ：第 27卷 第 6期
2008 年　12 月
华　中　农　业　大　学　学　报
Journal o f Huazhong Ag ricultura l Unive rsity
Vo l.27　No.6
Dec.2008 , 782～ 786
收稿日期:2008-08-31
＊国家民委科研基金项目(05ZN011)和中南民族大学自然科学基金项目(YZY07006)资助
＊＊通讯作者.E-mai l:chenyan@mail.s cuec.edu.cn
吴华杰 ,男 , 1985年生 ,中南民族大学生命科学学院本科生 ,武汉 430074
景天属药用植物遗传多样性的 RAPD分析＊
吴华杰　徐　燃　万定荣　陈　雁＊＊
(中南民族大学生命科学学院 , 武汉 430074)
摘要　采用 RAPD 技术对景天科景天属(Sedum)的凹叶景天 、江南景天 、宽叶景天 、佛甲草和垂盆草等 6 种
药用植物进行分子水平鉴定 ,并初步分析其相互间的亲缘关系。 CTAB 法提取各药用植物总 DNA , 以 45 条随
机引物进行随机扩增 ,筛选出 10 条随机引物很好地区分了 11 个试样 ,扩增出 208 个位点 , 其中多态性位点 173
个(83.2%)。用 Popgen32 计算出各种间的 Nei s(1978)遗传距离和遗传相似性矩阵 , 采用 UPGMA 绘出了亲
缘关系聚类图。结果表明 RAPD 法能有效地鉴别景天属 6 种药用植物 ,探讨其种间亲缘关系和种内遗传多样
性 ,其结果还为同属待定种鉴定提供了 DNA 分子水平依据。
关键词　景天属;RAPD;指纹图谱;亲缘关系
中图法分类号　Q 78　　文献标识码　A　　　文章编号　1000-2421(2008)06-0782-05
　　景天科景天属植物(Sedum L.)在我国约有
150种 ,分布遍及全国[ 1] 。本属有垂盆草(S.sar-
mentosum Bunge.)、费菜(S .aizoon L.)等重要药用
植物 ,有广泛的药理活性 ,用于多种疾病的治疗 ,是
药用植物资源研究开发中较受人们关注的一个
属[ 2] 。由于本属植物种类很多 ,有许多近缘种在形
态上彼此极其相似 ,仅靠形态学性状难以鉴定或区
分 ,时有造成药用上的混乱。
随机扩增多态性 DNA(random amplified po ly-
morphic DNA , RAPD)是 20世纪 90年代发展起来
的 DNA 分子遗传标记技术 ,目前在近缘种的真伪
鉴定 、亲缘关系 、遗传多样性及农牧业的遗传育种等
研究方面得到了较多应用[ 3-8] 。
本研究将 RAPD 技术用于对不同产地的凹叶
景天 、江南景天 、宽叶景天 、佛甲草 、垂盆草等 6种药
用植物的鉴定分析 ,并探讨其种间亲缘关系及种内
遗传多样性。
1　材料与方法
1.1　材　料
供试材料为采自武汉市蛇山 、中南民族大学及湖
北省的罗田 、英山 、恩施 、宜昌 、秭归等地的 11份样
品 ,经万定荣教授鉴定 ,分别为景天属的佛甲草
S.lineare Thunb.、凹叶景天S.emarginatum Migo.、
宽叶景天 S.el lacombianum Praeger.、江南景天 S.ki-
angnanense D.Q.WANG [ 9] 、垂盆草 S.sarmentosum
Bunge.及一同属未知种 S .sp.。均种植于中
南民族大学实验基地 。由于形态学差异 , 最终
取 1 1 个 试样 进行分 析 , 试 样编 号 、产地 见
表 1 。
表 1　供试材料及来源
Table 1　Experimental materials and sources
编号 No. 名称 Name 产地 Origin 编号 No. 名称 Name 产地 Origin
A 佛甲草 S .lineare Thunb. 罗田 Luot ian G 垂盆草 S .sarmentosum Bunge. 中南民族大学1)
B 佛甲草 S .lineare Thunb. 蛇山 Sheshan H 垂盆草 S .sarmentosum Bunge. 秭归 Zigui
C 凹叶景天 S .emarginatum Migo. 蛇山 Sheshan I 宽叶景天 S .el lacombianum praeger. 罗田 Luotian
D 江南景天 S .kiangnanense D.Q.WANG 英山 Yingshan J 宽叶景天 S .el lacombianum praeger 英山 Yingshan
E 垂盆草 S .sarmentosum Bunge. 宜昌 Yichang K 待定种 S .sp. 恩施 Enshi
F 垂盆草 S .sarmentosum Bunge. 罗田 Luot ian
　1)S outh-Cent ral University for Nat ionaliti es
DOI :10.13300/j.cnki.hnlkxb.2008.06.013
　第 6 期 吴华杰等:景天属药用植物遗传多样性的 RAPD 分析 　
1.2　方　法
1)DNA 样品的制备。 DNA 提取采用改良
CTAB法[ 10-12] ,具体为:取适量新鲜幼嫩叶片在预冷
研钵中 ,加入250μL CTAB抽提缓冲液 ,充分磨碎;
及时补充提取液 250 μL ,在 65 ℃水浴下保温 1 h ,
中间每间隔 10 min振荡 1次;样品室温冷却 10 m in
左右;加等体积(650 μL)的氯仿-异戊醇(24∶1),上
下温和颠倒摇动 2 m in , 12 000 r/min 离心(Eppen-
dorf )8 min;吸出上清液 ,加入 2 倍体积(约 700
μL)冰冻(-20 ℃)无水乙醇混匀 , 室温放置
10 min ,用枪头挑出析出的 DNA 或以 8 000 r/min
离心6 min沉淀出 DNA;75%乙醇铵洗至 DNA 呈
白色 ,并干燥 DNA;用 TE溶解 DNA , -20 ℃保存
待用 。
2)引物筛选和 RAPD-PCR反应体系。从45条
随机引物(北京三博远志)中共筛选出 10条位点清
晰 、重复性良好的引物对所有个体进行 PCR扩增 。
25 μL PCR反应体系为:2.5 μL 10×PCR Buf fer ,
2.5 mmol/ L MgCl2 , 0.1 mmo l/L dNTPs , 200
nmol/ L 引物 ,1.0 U Taq酶 ,20 ng 总 DNA;对照用
双蒸水代替总 DNA 。在 PTC-100(M J research)热
循环仪上扩增程序为:94 ℃, 4 min , 1 个循环;
94 ℃,45 s , 37 ℃, 45 s , 72 ℃, 1 min , 39 个循环;
72 ℃延伸 10 min;最后 12 ℃保温 。扩增产物于
1.0%加有 EB 的琼脂糖凝胶 、1.0×TA E 缓冲液
200 V 场强下电泳 30 ～ 35 min ,紫外灯下观察 ,照相
(kodak GEL-100)。
3)数据分析。对凝胶紫外成像系统中重复性好
且清晰的条带记数条带扩增产物。按条带有无分别
赋值 , 强反应带记“1” , 弱反应带重复出现 2次以上
记“1” , 弱反应带出现但不重复记“0” , 没有带记
“0” , 得 RAPD反应的原始数据 。用 Popgen32 分
析软件计算出各种间的 Nei s(1978)遗传距离和遗
传相似性矩阵[ 13] ,在遗传距离的基础上 ,采用 UPG-
MA (非加权配对算术平均法),绘出各种亲缘关系
聚类图。
2　结果与分析
2.1　RAPD多态性分析
10 条引物其代码 、序列和扩增带数 、多态 DNA
带数如表 2 所示 ,共扩增出 208 条清晰的条带 ,其
DNA 片段大小分布在 0.1 ～ 2.0 kb 之间 ,其中 173
个条带具有遗传多态性 ,约占总数的 83.2%;各引
物扩增的位点数从 18 ～ 25不等 ,平均每个引物扩增
的 DNA 带数为20.8条 。图 1分别为引物S4 、S28 、
S30 、S31 、S32和 S36对 11 个样品扩增得到的多态
性带结果(Marke r 为 TaKaRa DL 2000 ,片段大小
依次为:2 000 、1 000 、750 、500 、250 、100 bp)。
表 2　RAPD引物和其扩增位点数及每 1 个种的扩增位点数和单态种特征位点
Table 2　RAPD primers and their ampl ified numbers and mono-speci fic loci within each specie
引物 Primer 序列 Sequence 位点数 No.of loci A B C D E F G H I J K
S4 GGACTGGAGT 24 4 4 6 6 4 5 6 5 5 4 4
S9 TGGGGGACTC 19 9 8 4 4 8 6 7 7 3 3 6
S11 GT AGACCCG T 19 8 7 5 5 6 5 5 6 2 3 6
S28 G TGACGTAGG 18 7 9 4 4 8 7 7 8 6 5 7
S29 GGGTAACGCC 25 4 5 7 3 5 2 3 4 3 5 5
S30 GTGAT CGCAG 19 6 6 4 5 5 4 5 4 4 4 6
S31 CAATCGCCGT 19 5 3 8 7 4 9 7 7 2 2 4
S32 T CGGCGAT AG 22 9 8 3 4 7 8 6 6 3 2 7
S35 T TCCGAACCC 21 6 5 5 5 5 8 7 6 3 3 5
S36 AGCCAGCGAA 22 8 7 7 7 6 6 5 6 3 3 7
多态位点数
No.of polymorphic loci 18 17 9 8 17 18 20 21 14 15 16
种内总位点数
No.of loci wi thin species 66 62 53 50 58 60 58 59 33 34 57
种内多态位点百分比/ %
Percentage of interspeci fic polym orphic loci
27.3 27.4 17.0 16.0 29.3 30.0 34.5 35.6 42.4 44.1 28.1
属内多态位点百分比/ %
Percentage of intergeneric polymorphic loci
8.65 8.17 4.33 3.84 8.17 8.65 9.62 10.10 6.73 7.21 7.69
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　　 华 中 农 业 大 学 学 报 第 27 卷　
图 1　景天属植物在 RAPD标记位点上的物种特征位点
Fig.1　Specific locus among Sedum species based on RAPD loci
表 3　11个样品之间的 Nei s(1978)遗传一致度(上)和遗传距离(下)
Table 3　Nei s genetic identi ty(above diagonal)and genetic distance(below diagonal)among eleven samples
编号 No. A B C D E F G H I J K
A ＊＊＊＊ 0.969 9 0.695 5 0.730 4 0.818 6 0.802 8 0.802 9 0.807 1 0.584 5 0.598 4 0.719 6
B 0.030 6 ＊＊＊＊ 0.698 7 0.733 4 0.859 9 0.843 7 0.844 1 0.821 9 0.541 8 0.595 7 0.735 2
C 0.363 1 0.358 5 ＊＊＊＊ 0.987 0 0.738 1 0.748 0 0.706 0 0.781 4 0.613 6 0.692 3 0.740 3
D 0.314 1 0.310 0 0.013 1 ＊＊＊＊ 0.766 9 0.771 9 0.739 6 0.799 8 0.653 5 0.693 8 0.762 5
E 0.200 2 0.151 0 0.303 7 0.265 4 ＊＊＊＊ 0.945 8 0.988 4 0.904 5 0.560 8 0.570 6 0.787 6
F 0.219 6 0.169 9 0.290 4 0.258 9 0.055 8 ＊＊＊＊ 0.952 3 0.931 0 0.554 1 0.572 6 0.730 2
G 0.219 5 0.169 4 0.348 2 0.301 6 0.011 6 0.044 8 ＊＊＊＊ 0.876 1 0.550 6 0.553 0 0.780 8
H 0.214 3 0.196 1 0.246 7 0.223 4 0.100 3 0.071 5 0.132 3 ＊＊＊＊ 0.640 7 0.655 4 0.783 7
I 0.536 9 0.612 9 0.488 4 0.425 4 0.578 4 0.590 4 0.596 8 0.445 2 ＊＊＊＊ 0.822 5 0.690 8
J 0.513 6 0.518 0 0.367 8 0.365 6 0.561 0 0.557 5 0.592 5 0.422 6 0.195 4 ＊＊＊＊ 0.643 5
K 0.329 0 0.307 6 0.300 7 0.271 1 0.238 8 0.314 4 0.247 4 0.243 7 0.369 9 0.440 8 ＊＊＊＊
2.2　遗传相似性系数和聚类分析
在属水平所有位点的遗传多样性水平从3.84%
(D)到 10.1%(H),平均 7.56%,而种水平的遗传
多样性则从 16.0%(D)到 44.1%(J), 平均为
30.2%,虽然种 、属 2个水平的最小遗传多样性所属
物种一致 ,但其他物种遗传多样性水平在 2个水平
的顺序由于种内总位点数不同而有较大变化
(表 2)。Nei s 遗传距离(D)在种内和种间变化从
0.011 6(E与 G)到 0.612 9(B与 I)(表 3),显示种
内变异较小 ,而种间一般具有较大的物种差异 。11
个样品的聚类图中(图 2),同种不同产地的植株均
先聚为一类。在种间 ,凹叶景天与江南景天聚为一
类 ,且遗传距离十分相近 ,表明二者具有密切的亲缘
关系;其次佛甲草与垂盆草亲缘关系也较近 ,宽叶景
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　第 6 期 吴华杰等:景天属药用植物遗传多样性的 RAPD 分析 　
天与上述各种植物呈独立分支状态 ,表明与它们的
亲缘关系相对较远 ,且其种内遗传变异较大 ,可能主
要受地理位置及气候的长期影响 ,这与上述植物种
间及种内居群形态学上的相似程度或差异程度是
高度一致的。同时待定种与垂盆草及佛甲草聚为
一大类 ,提示与二者具有相近的亲缘关系 ,而与宽
叶景天 、凹叶景天 、江南景天的关系较疏远 ,这不
仅与彼此间植物形态上的相似程度一致 , 也为该
待定种的属下分类提供了一定的 DNA 分子水平
的依据 。
图 2　11 个样品之间的遗传距离 UPGMA聚类图
Fig.2　UPGMA dendrogram based on the Nei s genetic distance among eleven Sedum samples
3　讨　论
通过对景天属 6种药用植物样品 DNA 的多态
性进行聚类分析 ,显示各种间的遗传相似系数变化
较大 ,说明景天属植物具有较高的遗传多样性 ,初步
证实 RA PD 技术能有效地检测所选取物种间的遗
传变异 ,且这种变异与各物种的形态学性状紧密
联系 。
RAPD标记在物种鉴定和系统学上的应用 ,早
期有着不同的看法 ,主要集中在位点的可重复性和
同源性上 。经国内外科学工作者验证 ,严格标准化
实验条件 ,重复性是完全可以保证的 ,而且近缘种共
迁移位点多是同源的[ 14] 。目前 RAPD标记主要用
于种内不同居群间和种间亲缘关系研究 。
由于 RAPD扩增的结果只能从相似性系数或
遗传距离去做表征分析 ,所得树状图不一定能真
正反应种属间系统发育关系 ,同时在种间的 DNA
变异水平很高 ,用一个或几个个体代表一个种可
能造成研究结果的较大偏差 , 尤其是药用植物是
针对有药用价值的分类单元进行分析 。因此 ,有
学者认为在应用 RAPD方法对药用植物种间亲缘
关系的研究 ,尤其是在对类似景天属这样的大属
分类时 ,要考虑形态学的差异以及前人的观点以
便进行全面评价[ 7] 。
本属药用植物中 ,鄂西民间将垂盆草与佛甲草
作为同一种药物应用 ,凹叶景天与其疗效应用也有
部分相同 ,同时作者也曾研究了三者全草粉末的红
外光谱 ,结果表明垂盆草与佛甲草 IR图几乎一致 ,
而与凹叶景天有一定差异 ,这均反应了三者所含化
学成分的相似程度 ,与本项研究结果所反映的相互
间关系是一致的。
由于不同批次 、不同厂家试剂和实验条件的限
制 ,对于特定具体的 RAPD标记位点产物的长久稳
定保持 ,目前在时间和空间上还存在一定困难[ 15] 。
为尽量减小这种误差 ,笔者采用在同样条件下对
PCR产物电泳 2次 ,2次结果对比分析 ,以确定模糊
条带是否真正存在。若把 RAPD种单态特征位点
标记转化为 SCAR(sequence characterized ampli-
fied regions)标记 ,则可以得到更精确的结果 。
参 考 文 献
[ 1] 　傅立国 ,洪涛 ,陈潭清 ,等.中国高等植物(6 卷)[ M] .青岛:青
岛出版社 , 2003:355.
[ 2] 　万定荣.垂盆草及其同属(景天属)药用种的民族医疗应用[ J] .
时珍国医国药 , 2007 , 18(8):1853-1855.
[ 3] 　喻晓 ,文涛 ,丰先红.RAPD 在植物研究中的应用[ J] .生物技术
通报 , 2005(5):68-71.
[ 4] 　林文芳 ,陈林姣 ,朱学艺.用分子标记技术分析不同生态型芦苇
的遗传多样性[ J] .植物生理与分子生物学学报 , 2007 , 33(1):
77- 84.
[ 5] 　樊斌 ,刘榜 ,余梅 ,等.中国小型猪品种遗传多样性的 RAPD研
究[ J] .华中农业大学学报 , 2003 , 22(3):240-242.
[ 6] 　樊冬丽 ,牛西午 ,马小军 ,等.苦叶七种质资源的随机扩增多态
性 DNA 分析[ J] .时珍国医国药 , 2006 ,17(12):2471-2473.
785
　　 华 中 农 业 大 学 学 报 第 27 卷　
[ 7] 　胡挺松 ,陆一鸣 ,马兰青 ,等.红景天属 4种植物 RAPD 分析与
分类鉴定[ J] .中草药 , 2004 , 35(11):1286-1289.
[ 8] 　冉鸿昌 ,肖炎农 ,姜道宏 ,等.湖北省棉花黄萎病菌致病力分化
和遗传多样性分析[ J] .华中农业大学学报 , 2005 , 24(5):442-
447.
[ 9] 　王德群 ,武祖发 ,叶根火.安微景天属新分类群[ J] .植物研究 ,
1990 , 10(3):45-50.
[ 10] FANG G , HAMM AR S , G RUMET R.A quick and in expen-
sive method for removing polys accharides f rom plant genomic
DNA [ J] .Bio-f eedback and Self-regulation , 1992 , 13:52-57.
[ 11] CHENG F S , BROWN S K ,WEEDEN N F.A DNA ex tract ion
protocol f rom various t is sues in w oody species [ J] .Hort-
s cien ce , 1997 , 32(5):921-922.
[ 12] COUCH J A.Isolat ion of DNA from plan t high polyphenolic
[ J] .Plan t Molecular Biology Reproter , 1990, 8:8-12.
[ 13] YEH F C , YANG R C , BOYLE T .Microsof t w indow s-based
f reew are for populat ion genet ic analysi s[ M] .Edmonton:Uni-
versity of Alberta , 1999.
[ 14] 邹喻苹 ,葛颂 ,王小东.系统与进化植物学中的分子标记[ M] .
北京:科学出版社 , 2001:263-266.
[ 15] 余艳 ,崔国华 ,李忠超 ,等.广东省十种卷柏属植物 RAPD 初步
分析[ J] .广西植物 , 2007 , 27(1):48-52.
Genetic Diversity Analysis on the Medicinal Plants of Sedum L.by RAPD
WU Hua-jie　XU Ran　WAN Ding-rong　CHEN Yan
(College o f L i f e S ciences ,South-Central Univ ersity f or Nationali ties ,Wuhan 430074 ,China)
Abstract　To identify the medicinal plants of Sedum L., including Sedum emarginatum M igo ., S.
kiangnanense D.Q.WAN ,S .ellacombianum Praeger., S.lineare Thunb.and S.sarmentosum Bunge.,by
RAPD in molecular level , and preliminari ly analy ze the relationship among those species.Isolating gener-
al DNA from fresh leaves by CTAB and 45 random primers w ere used to identify them .10 random prim-
ers amplified 208 loci w hich have 173 polymo rphic loci , namely 83.2%.The matrix o f genetic distance
and genetic identity in species w as calculated through using Popgen32 by Nei s(1978).Dendrog ram was
const ructed by using UPGMA.RA PD is an effective me thod to ident ify the medicinal plants of Sedum
L., and can explore the relationship among species and genet ic diver sity wi thin the species.The results
also pro vide a basis of DNA molecular level fo r the identification o f the species to be authenticated.
Key words　Sedum L .;RAPD;fingerprint;relat ionship
(责任编辑:杨锦莲)
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