全 文 ：第３９卷第６期
２０１２年１１月
浙　江　大　学　学　报（理学版）
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｚｈｅｊｉａｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｅｄｉｔｉｏｎ）
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊｏｕｒｎａｌｓ．ｚｊｕ．ｅｄｕ．ｃｎ／ｓｃｉ
Ｖｏｌ．３９Ｎｏ．６
Ｎｏｖ．２０１２
收稿日期：２０１１－０６－０９．
作者简介：蒋　明（１９７３－），男，博士，副教授，主要从事植物发育生物学及其分子调控研究．
ＤＯＩ：１０．３７８５／ｊ．ｉｓｓｎ．１００８－９４９７．２０１２．０６．０１７
１０种杓兰属植物ｒＤＮＡ　ＩＴＳ序列的克隆与分析
蒋　明，李温平，周　晶，陈贝贝
（台州学院 生命科学学院，浙江 临海３１７０００）
摘　要：以１０种杓兰属植物为材料，利用ＰＣＲ技术从叶片ＤＮＡ克隆ＩＴＳ序列．测序结果表明，１０种杓兰属植物
ＩＴＳ的长度为５２２－５７２ｂｐ，变异位点１９４个，其中信息位点９９个，单核苷酸变异位点９５个；５．８Ｓ序列的长度均为
１７０ｂｐ，但变异位点十分丰富，其中信息位点３０个，单核苷酸变异位点２０个，利用这些位点可将１０种杓兰属植物
完全分开．系统发育分析结果表明，所研究的植物可分为三组，绿花杓兰、西藏杓兰、黄花杓兰和紫点杓兰聚为一
组，高山杓兰、大花杓兰、褐花杓兰和杓兰聚为一组，斑叶杓兰和离萼杓兰聚为一组．序列已上传至ＮＣＢＩ，登陆号为
ＪＮ０１８０７０－ＪＮ０１８０７９．本研究克隆和分析了１０种杓兰属植物的ＩＴＳ序列，为遗传多样性和系统发育研究奠定了基础．
关　键　词：杓兰属；ＩＴＳ序列；克隆；分子鉴定
中图分类号：Ｒ　２８７．７　　　　文献标志码：Ａ　　　　文章编号：１００８－９４９７（２０１２）０６－６８９－０７
ＪＩＡＮＧ　Ｍｉｎｇ，ＬＩ　Ｗｅｎ－ｐｉｎｇ，ＺＨＯＵ　Ｊｉｎｇ，ＣＨＥＮ　Ｂｅｉ－ｂｅｉ（Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｔａｉｚｈｏｕ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌｉｎｈａｉ
３１７０００，Ｚｈｅｊｉａｎｇ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｃｈｉｎａ）
Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｒＤＮＡ　ＩＴＳ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｆｒｏｍ　ｔｅｎ　Ｃｙｐｒｉｐｅｄｉｕｍｐｌａｎｔｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｚｈｅｊｉａｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｅ－
ｄｉｔｉｏｎ），２０１２，３９（６）：６８９－６９５
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｅｎ　Ｃｙｐｒｉｐｅｄｉｕｍｐｌａｎｔｓ　ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ａｓ　ｍａｔｅｒｉａｌｓ　ｆｏｒ　ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ　ｓｐａｃｅｒ（ＩＴＳ）ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｂｙ
ＰＣＲ　ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｒｅｖｅａｌｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｆｕｌ　ｌｅｎｇｔｈ　ＩＴＳ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｃｙｐｒｉｐｅｄｉｕｍｒａｎｇｅｄ　ｆｒｏｍ　５２２ｔｏ
５７２ｂｐ　ｗｉｔｈ　１９４ｖａｒｉａｂｌｅ　ｓｉｔｅｓ，９９ｐａｒｓｉｍｏｎｙ－ｉｎｆｏｒｍａｔｉｖｅ　ｓｉｔｅｓ　ａｎｄ　９５ｓｉｎｇｌｅ　ｎｕｃｌｅｔｉｄｅ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ｓｉｔｅｓ．Ａｌ　ｔｈｅ
５．８Ｓｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｗｅｒｅ　１７０ｂｐ　ｉｎ　ｌｅｎｇｔｈ　ｗｉｔｈ　ｒｉｃｈ　ｖａｒｉａｂｌｅ　ｓｉｔｅｓ　ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　３０ｐａｒｓｉｍｏｎｙ－ｉｎｆｏｒｍａｔｉｖｅ　ｓｉｔｅｓ　ａｎｄ　２０ｓｉｎｇｌｅ
ｎｕｃｌｅｔｉｄｅ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ｏｎｅｓ．Ｔｈｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｓｉｔｅｓ　ｉｎ　ＩＴＳ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｉｄｅｎｔｉｆｙ　ｔｈｅｓｅ　ｔｅｎ　Ｃｙｐｒｉｐｅｄｉｕｍ
ｐｌａｎｔｓ．Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｐｌａｎｔｓ　ｓｔｕｄｉｅｄ　ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ　ｔｈｒｅｅ　ｇｒｏｕｐｓ：ｇｒｏｕｐ　１ｆｏｒ　Ｃ．ｈｅｎｒ－
ｙｉ，Ｃ．ｆｌａｖｕｍ，Ｃ．ｔｉｂｅｔｉｃｕｍａｎｄ　Ｃ．ｇｕｔｔａｔｕｍ，ｇｒｏｕｐ　２ｆｏｒ　Ｃ．ｈｉｍａｌａｉｃｕｍ，Ｃ．ｍａｃｒａｎｔｈｕｍ，Ｃ．ｓｍｉｔｈｉｉ　ａｎｄ　Ｃ．
ｃａｌｃｅｏｌｕｓ，ａｎｄ　ｇｒｏｕｐ　３ｆｏｒ　Ｃ．ｍａｒｇａｒｉｔａｃｅｕｍａｎｄ　Ｃ．ｐｌｅｃｔｒｏｃｈｉｌｕｍ．Ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ，ＩＴＳ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｔｅｎ　Ｃｙｐｒｉｐｅ－
ｄｉｕｍｗｅｒｅ　ｃｌｏｎｅｄ　ａｎｄ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ｐｒｏｖｉｄｉｎｇ　ｔｈｅ　ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ａｎｄ　ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ．
Ｋｅｙ　Ｗｏｒｄｓ：Ｃｙｐｒｉｐｅｄｉｕｍ；ＩＴＳ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ；ｃｌｏｎｉｎｇ；ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
　　兰科（Ｏｒｃｈｉｄａｃｅａｅ）是有花植物的最大类群之
一，全世界约有８００个属，２５　０００个种，分布在亚洲、
中美洲和南美洲，多样性极其丰富［１］．在我国，约有
１　２４０种野生兰科植物，隶属１７３个属［２］．杓兰属
（Ｃｙｐｒｉｐｅｄｉｕｍ）植物隶属杓兰亚科，是兰科植物中
较为原始的种类，全世界约５０种，生长在热带和亚
热带地区，我国是杓兰属植物的分布中心，有３６个
种和１个变种［３，４］．杓兰属植物叶形奇特、花姿优美、
花色丰富，具有较高的观赏价值；杓兰属植物具有消
肿、利尿和镇痛功能，有较好的药用价值［５］．但是，随
着兰花热的兴起和人们对其药用价值的日渐重视，
采挖杓兰属植物的现象十分严重，不少种类已处于
严重濒危状态［６］．近年来，在杓兰属植物的传粉生物
学、生物多样性、形态发生、保育和化学成分等方面
进行了大量研究，并取得了一定进展［７－１６］．
高等植物核糖体ＤＮＡ内转录间隔区（Ｉｎｔｅｒｎａｌ
ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ　ｓｐａｃｅｒ，ＩＴＳ）位于１８Ｓ、５．８Ｓ和２６Ｓ基
因之间，在进化过程中，由于所受的自然选择压力
小，ＩＴＳ序列进化速度较快，不同物种在序列长度、
碱基组成等方面存在一定差异，是研究遗传多样性、
物种鉴定和系统发育的重要分子标记［１７］．分子标记
的种类很多，如限制性片段长度多态性（ＲＦＬＰ）、简
单序 列 重 复 （ＳＳＲ）、随 机 扩 增 多 态 性 ＤＮＡ
（ＲＡＰＤ）、相关序列扩增多态性（ＳＲＡＰ）和扩增片段
长度多态性（ＡＦＬＰ）等分子标记相比，ＩＴＳ标记具
有操作简单、重复性高和信息位点丰富等优点，近年
来被广泛用于植物属内、近缘属间的系统发育研
究［１８，１９］．本研究通过测定１０种杓兰属植物的ＩＴＳ
序列，用分子手段探讨它们之间的进化关系，并为杓
兰属植物的系统发育和遗传多样性研究提供参考．
１　材料和方法
１．１　材　料
绿花杓兰（Ｃ．ｈｅｎｒｙｉ）、杓兰（Ｃ．ｃａｌｃｅｏｌｕｓ）、斑叶
杓兰（Ｃ．ｍａｒｇａｒｉｔａｃｅｕｍ）、紫点杓兰（Ｃ．ｇｕｔｔａｔｕｍ）、
高山杓兰（Ｃ．ｈｉｍａｌａｉｃｕｍ）、大花杓兰（Ｃ．ｍａｃｒａｎ－
ｔｈｕｍ）、黄花杓兰（Ｃ．ｆｌａｖｕｍ）、离萼杓兰（Ｃ．ｐｌｅｃ－
ｔｒｏｃｈｉｌｕｍ）、褐花杓兰（Ｃ．ｓｍｉｔｈｉｉ）和西藏杓兰（Ｃ．ｔｉ－
ｂｅｔｉｃｕｍ）等均由本实验室栽植，于４月份采集新叶，
用自来水清洗后，ｄｄＨ２Ｏ冲洗数分钟备用．
１．２　基因组ＤＮＡ的提取
称取叶片约 １ｇ，用液氮研磨成粉末置于
１．５ｍＬ离心管，提取方法采用ＳＤＳ法．
１．３　ＩＴＳ序列的ＰＣＲ扩增
以ＩＴＳＵＰ：５′－ＡＡＣＡＡＧＧＴＴＴＣＣＧＴＡＧＧＴＧＡ－
３′和 ＩＴＳＤＮ：５′－ＴＡＴＧＣＴＴＡＡＡＴＴＣＡＧＣＧＧＧＴ －３′
为引物进行ＰＣＲ扩增．在２０μＬ反应体系中，加入２
μＬ　１０×ＰＣＲ缓冲液（含２０ｍｍｏｌ·Ｌ
－１　Ｍｇ２＋）、０．５
μＬ　１０ｍＭ　ｄＮＴＰｓ（上海生工），０．４μＬ　Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合
酶（北京鼎国）、各０．５μＬ上下游引物（２０μＭ），５０ｎｇ
ＤＮＡ模板，最后加ｄｄＨ２Ｏ至２０μＬ．反应在 ＢＩＯ－
ＲＡＤ　Ｃ１０００型 ＰＣＲ仪上进行，ＰＣＲ反应程序为：
９４℃预变性５ｍｉｎ，共３２个循环（９４℃变性３０ｓ，
５５℃退火４５ｓ，７２℃延伸６０ｓ），７２℃最后延伸
１０ｍｉｎ．ＰＣＲ产物经电泳后拍照，在紫外灯下用洁净
刀片割取含目的条带的胶块．
１．４　ＰＣＲ产物的回收、连接和测序
电泳产物用ＤＮＡ凝胶回收试剂盒回收（碧云
天），根据说明书进行操作．各取２．５μＬ回收产物，
连接到ｐ－ＧＥＭ　Ｔ－ｅａｓｙ克隆载体（Ｐｒｏｍｅｇａ），置于４
℃冰箱约１０ｈ，全部连接产物用于转化ＤＨ５α大肠
杆菌感受态细胞（北京鼎国），经平板培养、液体培养
和ＰＣＲ验证，各取３个阳性克隆测序．
１．５　序列分析
多序列比对采用 ＣｌｕｓｔａｌＸ　１．８１软件，ＭＥＧＡ
３．１软件用于计算遗传距离和构建系统发育树．
２　结果与分析
２．１　ＩＴＳ和５．８Ｓ的特征
１０种杓兰属植物ＩＴＳ区域的长度在５２２－５７２
ｂｐ之间，杓兰的ＩＴＳ序列最长，达５７２ｂｐ，其次是褐
花杓兰，长度为５７１ｂｐ，大花杓兰的ＩＴＳ序列最短，
为５２２ｂｐ；ＩＴＳ１序列的长度在３３４～３８１ｂｐ间，ＧＣ
含量为４４．４％～５０．１％；ＩＴＳ２序列的长度在１８８～
１９２间，ＧＣ含量为４９．４％～５３．２％．１０种杓兰属
植物的５．８Ｓ序列相对保守，长度均为１７０ｂｐ，但
ＧＣ值存在差异，含量为５１．２％～５６．５％（详见
表１）．
表１　１０种杓兰属植物ＩＴＳ序列的长度及ＧＣ含量
Ｔａｂｌｅ　１　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｌｅｎｇｔｈ　ａｎｄ　ＧＣ　ｃｏｎｔｅｎｔｓ　ｏｆ　ＩＴＳ　ａｍｏｎｇ　ｔｅｎ　Ｃｙｐｒｉｐｅｄｉｕｍｐｌａｎｔｓ
植物名称 编号 登陆号
５．８Ｓ
长度／ｂｐ　 ＧＣ／％
ＩＴＳ／ｂｐ
ＩＴＳ１
长度／ｂｐ　 ＧＣ／％
ＩＴＳ２
长度／ｂｐ　 ＧＣ／％
绿花杓兰 ＬＨＳＬ　 ＪＮ０１８０７０　 １７０　 ５２．４　 ５６７　 ３７６　 ４６．８　 １９１　 ５２．４
杓兰 ＳＬ　 ＪＮ０１８０７１　 １７０　 ５４．１　 ５７２　 ３８０　 ４６．３　 １９２　 ５０．５
斑叶杓兰 ＢＹＳＬ　 ＪＮ０１８０７２　 １７０　 ５２．４　 ５６９　 ３８１　 ４４．４　 １８８　 ４９．４
紫点杓兰 ＺＤＳＬ　 ＪＮ０１８０７３　 １７０　 ５６．５　 ５４５　 ３５５　 ４７．４　 １９０　 ５１．５
高山杓兰 ＧＳＳＬ　 ＪＮ０１８０７４　 １７０　 ５４．１　 ５２６　 ３３６　 ４７．３　 １９０　 ５３．１
大花杓兰 ＤＨＳＬ　 ＪＮ０１８０７５　 １７０　 ５４．２　 ５２２　 ３３４　 ４５．８　 １８８　 ５２．２
黄花杓兰 ＨＨＳＬ　 ＪＮ０１８０７６　 １７０　 ５２．４　 ５６７　 ３７６　 ４７．０　 １９１　 ５２．９
离萼杓兰 ＬＥＳＬ　 ＪＮ０１８０７７　 １７０　 ５５．９　 ５６９　 ３７９　 ５０．１　 １９０　 ５２．１
褐花杓兰 ＨＥＳＬ　 ＪＮ０１８０７８　 １７０　 ５４．１　 ５７１　 ３８０　 ４５．３　 １９１　 ５０．８
西藏杓兰 ＸＺＳＬ　 ＪＮ０１８０７９　 １７０　 ５１．２　 ５６６　 ３７６　 ４６．８　 １９０　 ５３．２
０９６ 浙 江 大 学 学 报（理学版）　 第３９卷　
２．２　ＩＴＳ和５．８Ｓ序列的比较分析
利用ＣｌｕｓｔａｌＸ　１．８１软件对１０种杓兰属植物的
ＩＴＳ序列进行序列比对，借助 ＭＥＧＡ　３．１软件计算
５．８Ｓ、ＩＴＳ１和ＩＴＳ２的变异位点（Ｖａｒｉａｂｌｅ　ｓｉｔｅｓ）及
信息位点（Ｐａｒｓｉｍｏｎｙ－ｉｎｆｏｒｍａｔｉｖｅ　ｓｉｔｅｓ）．１０种杓兰
属植物中，除黄花杓兰和绿花杓兰外，其余物种
５．８Ｓ序列之间均存在一定差异，其中，西藏杓兰与
黄花杓兰和绿花杓兰的差异最小，仅存在２个碱基
的差异，而斑叶杓兰与其他物种之间的差异最大，存
在较多的转换和颠换现象（见图１）．尽管５．８Ｓ的序
列长度均为１７０ｂｐ，但变异十分丰富，含５０个变异
位点，其中信息位点３０个，单核苷酸位点２０个．
图１　１０种杓兰属植物５．８Ｓ序列的比对
Ｆｉｇ．１　Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　５．８Ｓｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ａｍｏｎｇ　ｔｅｎ　Ｃｙｐｒｉｐｅｄｉｕｍｐｌａｎｔｓ
　　相比５．８Ｓ序列，１０种杓兰属植物的ＩＴＳ１和
ＩＴＳ２序列的变异更大，除发生转换和颠换，还存在
碱基或片段缺失现象（见图２）．如紫点杓兰在＋８６
处存在２５ｂｐ的缺失，高山杓兰和大花杓兰在＋２９５
处缺失３个碱基，分别在＋３０３ｂｐ和＋３０４ｂｐ处存
在４５ｂｐ和４４ｂｐ的缺失，另外，与高山杓兰相比，
绿花杓兰、西藏杓兰、黄花杓兰、紫点杓兰、斑叶杓兰
和离萼杓兰在＋２６５处发生３ｂｐ的缺失．ＩＴＳ１和
ＩＴＳ２的变异位点十分丰富，ＩＴＳ１有１２２个变异位
点，其中信息位点６２个，单核苷酸变异位点６０个；
ＩＴＳ２有７４个变异位点，信息位点和单核苷酸变异
位点均为３７个．
２．３　系统发育分析
在序列比对的基础上，利用 ＭＥＧＡ　３．１软件计
算１０种杓兰属植物的 Ｋｉｍｕｒａ　２－ｐａｒａｍｅｔｅｒ遗传距
离．结果表明，它们的遗传距离为 ０．００６　２～
０．２２４　５，绿花杓兰与西藏杓兰的遗传距离最小，亲
缘关系最为接近；其次是黄花杓兰与西藏杓兰，遗传
距离为０．００８　３；高山杓兰与斑叶杓兰的遗传距离最
大，达０．２２４　５，两者关系最远（见表２）．
表２　１０种杓兰属植物的遗传距离
Ｔａｂｌｅ　２　Ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｓｔａｎｃｅ　ａｍｏｎｇ　ｔｅｎ　Ｃｙｐｒｉｐｅｄｉｕｍｐｌａｎｔｓ
ＬＨＳＬ　 ＸＺＳＬ　 ＨＨＳＬ　 ＺＤＳＬ　 ＢＹＳＬ　 ＬＥＳＬ　 ＧＳＳＬ　 ＤＨＳＬ　 ＨＥＳＬ　 ＳＬ
ＬＨＳＬ
ＸＺＳＬ　 ０．００６　２
ＨＨＳＬ　 ０．０１０　４　 ０．００８　３
ＺＤＳＬ　 ０．１５２　７　 ０．１５０　３　 ０．１５０　１
ＢＹＳＬ　 ０．１９０　０　 ０．１９３　１　 ０．１９２　８　 ０．１９７　５
ＬＥＳＬ　 ０．１６４　０　 ０．１６１　５　 ０．１５５　９　 ０．１４９　４　 ０．１７６　４
ＧＳＳＬ　 ０．１８９　３　 ０．１８６　７　 ０．１８６　４　 ０．１７５　０　 ０．２２４　５　 ０．１７７　４
ＤＨＳＬ　 ０．１６８　４　 ０．１６５　８　 ０．１６０　２　 ０．１５４　５　 ０．１９６　９　 ０．１６４　９　 ０．０５３　５
ＨＥＳＬ　 ０．１６６　１　 ０．１６３　６　 ０．１６３　３　 ０．１５１　８　 ０．１９４　５　 ０．１５９　８　 ０．０５１　３　 ０．０２５　２
ＳＬ　 ０．１７４　３　 ０．１７１　８　 ０．１６６　１　 ０．１５７　５　 ０．２０３　０　 ０．１５１８　 ０．０５８　０　 ０．０２９　６　 ０．０２５　３
１９６　第６期 蒋　明，等：１０种杓兰属植物ｒＤＮＡ　ＩＴＳ序列的克隆与分析
图２　１０种杓兰属植物ＩＴＳ１和ＩＴＳ２序列的比对
Ｆｉｇ．２　ＩＴＳ１ａｎｄ　ＩＴＳ２ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ　ｏｆ　ｔｅｎ　Ｃｙｐｒｉｐｅｄｉｕｍｐｌａｎｔｓ
　　
　　根据１０种杓兰属植物的ＩＴＳ序列，采用邻近
（Ｎｅｉｇｈｂｏｒ－Ｊｏｉｎｉｎｇ，ＮＪ）法构建系统发育树，自举检
测１　０００次（见图３）．结果表明，１０种植物可分为３
组，绿花杓兰（ＬＨＳＬ）、西藏杓兰（ＸＺＳＬ）、黄花杓兰
（ＨＨＳＬ）和紫点杓兰（ＺＤＳＬ）聚为一组，其中的绿花
杓兰和西藏杓兰关系最近，处于同一分支；高山杓兰
（ＧＳＳＬ）、大花杓兰（ＤＨＳＬ）、褐花杓兰（ＨＥＳＬ）和杓
兰（ＳＬ）聚为一组；另外，斑叶杓兰（ＢＹＳＬ）和离萼杓
兰（ＬＥＳＹ）与其余８种植物的遗传距离较远，单独
聚为一组．
图３　基于ＩＴＳ１和ＩＴＳ２序列构建的系统发育树
Ｆｉｇ．３　Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒｅｅｓ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ｂａｓｅｄ　ｕｐｏｎ
ＩＴＳ１ａｎｄ　ＩＴＳ２ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
２９６ 浙 江 大 学 学 报（理学版）　 第３９卷　
３　讨　论
核糖体ＤＮＡ由编码基因和与之相邻的间隔区
组成，５．８Ｓ基因将内转录区分成ＩＴＳ１和ＩＴＳ２，
５．８Ｓ基因序列相对比较保守，ＩＴＳ１和ＩＴＳ２为非编
码区，在进化过程中所承受的选择压力较小，序列变
化较大，可用于遗传多样性研究、种群分析和物种鉴
定等．通过扩增和比对９种柴胡属（Ｂｕｐｌｅｕｒｕｍ）药
用植物ｒＤＮＡ　ＩＴＳ序列，发现与外类群的同源性均
小于７５％，同属植物的同源性均大于８８％，同种植
物则大于９９％，表明ＩＴＳ序列作为柴胡类药材鉴定
依据具有一定实用性和可靠性［２１］；以采自全国的２６
个不同产地的牛蒡子药材和４种伪品为材料，扩增
到各自的ＩＴＳ全长，结果表明，ＩＴＳ序列可完全将牛
蒡子与伪品分开［２２］；利用克隆测序法测定了龙眼
（Ｄｉｍｏｃａｒｐｕｓ　ｌｏｎｇａｎ）品种及其近缘种龙荔（Ｄ．
ｃｏｎｆｉｎｉｓ）的核糖体ＤＮＡ，发现龙眼品种间ＩＴＳ序
列变异位点比较丰富，单个或组合变异位点可作为
品种鉴别依据［２３］；在测定１５种苋属植物的ｎｒＤＮＡ
ＩＴＳ序列的基础上进行系统发育分析，可将分布于
中国的苋属植物分成三组，认为雄蕊的数目比花被
片的数目以及胞果是否开裂在苋属分组上更有意
义［２４］．ＩＴＳ序列在兰科植物中也有应用，通过测定、
比较细叶石斛（Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ　ｈａｎｃｏｃｋｉｉ）、线叶石斛
（Ｄ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｍ）、长苏石斛（Ｄ．ｂｒｙｍｅｒｉａｎｕｍ）和
鼓槌石斛（Ｄ．ｃｈｒｙｓｏｔｏｘｕｍ）等１４个石斛属植物的
ＩＴＳ序列后发现，石斛种内ＩＴＳ十分保守，种间存在
较大差异，ＩＴＳ序列可作为分子鉴定的依据［２５］；通
过ＰＣＲ和直接测序法，对兰属植物的ＩＴＳ序列进行
分析，表明兰属的３个亚属均可能不是自然类群，大
花亚属和兰亚属为复系群，而建兰亚属为并系
群［２６］．
ＩＴＳ序列进化速率较快，已广泛用于植物属及
属下系统的分类研究［２７］．多数杓兰属植物的叶片形
态十分相似，如黄花杓兰、绿花杓兰、大花杓兰和褐
花杓兰等，仅凭叶片很难鉴别，需要在花期或者利用
分子手段加以鉴定．本研究以１０种杓兰属植物为材
料，克隆了各自的ＩＴＳ序列，序列长度差异较大，达
５０ｂｐ，而且变异位点十分丰富，存在较多的碱基颠
换、转换和缺失现象，高山杓兰和大花杓兰的片段缺
失现象尤其明显，这些位点可作为１０个物种分子鉴
定的依据．５．８Ｓ序列通常比较保守，变异位点和信
息位点少．朱颖等在对２０种忍冬属（Ｌｏｎｉｃｅｒａ）植物
的５．８Ｓ序列进行比对发现，变异位点为２７个，其中
信息位点仅１个［２８］；１１种丁香属（Ｓｙｒｉｎｇａ）的５．８Ｓ
序列变异位点为９个，仅２个位点发生转换［２９］．本
研究中，１０种杓兰属植物５．８Ｓ序列的长度均为１７０
ｂｐ，但变异十分丰富，含５０个变异位点，其中信息
位点３０个，说明在系统发育过程中，杓兰属植物
５．８Ｓ序列承受的进化压力小，发生了较多的转换和
颠换现象．本研究克隆和分析了１０种杓兰属植物的
ＩＴＳ序列，为这些植物的遗传多样性和系统发育研
究奠定了基础．
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ｓｈｉｐｓ　ｉｎ　Ｃｙｍｂｉｄｉｕｍ （Ｏｒｃｈｉｄａｃｅａｅ）ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｎｒＩＴＳ
４９６ 浙 江 大 学 学 报（理学版）　 第３９卷　
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ＺＨＵ　Ｙｉｎｇ，ＤＯＮＧ　Ｙｕ－ｚｈｉ，ＺＡＮ　Ｓｈａｏ－ｐｉｎｇ，ｅｔ　ａｌ．
Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ　ｏｆ　Ｌｏｎｉｃｅｒａ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｓｅ－
ｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｒｉｂｏｓｏｍａｌ　ＤＮＡ［Ｊ］．Ａｃｔａ　Ｂｏｔ　Ｂｏｒｅ－
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ＬＩ　Ｙａｎ－ｐｉｎｇ，ＷＥＩ　Ｊｉ－ｃｈｅｎｇ，ＨＥ　Ｍｉａｏ，ｅｔ　ａｌ．Ｐｈｙｌｏ－
ｇｅｎｅｔｉｃ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｇｅｎｕｓ　Ｓｙｒｉｎｇａｉｎ　ｎｏｒｔｈ－
ｅａｓｔ　Ｃｈｉｎａ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｎｒＤＮＡ　ＩＴＳ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ　Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２０１０，３８（８）：４５－４７．
（上接第６７０页）
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ｈｅａｖｙ　ｍｅｔａｌ　ｐｏｌｕｔｉｏｎ　ｓｏｉｌｓ［Ｊ］．Ｒｕｒａｌ　Ｅｃｏ－Ｅｎｖｉｒｏｎ－
ｍｅｎｔ，２０００，１６（２）：３９－４４．
［６］　李法云，臧树良，罗义．污染土壤生物修复技术研究
［Ｊ］．生态学杂志，２００３，２２（１）：３５－３９．
ＬＩ　Ｆａ－ｙｕｎ，ＺＡＮＧ　Ｓｈｕ－ｌｉａｎｇ，ＬＵＯ　Ｙｉ．Ｂｉｏｒｅｍｅｄｉ－
ａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｅｄ　ｓｏｉｌｓ：ａ　ｒｅｖｉｅｗ［Ｊ］．Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒ－
ｎａｌ　ｏｆ　Ｅｃｏｌｏｇｙ，２００３，２２（１）：３５－３９．
［７］　崔德杰，张玉龙．土壤重金属污染现状与修复技术研究
进展［Ｊ］．土壤通报，２００４，３５（３）：３６６－３７０．
ＣＵＩ　Ｄｅ－ｊｉｅ，ＺＨＡＮＧ　Ｙｕ－ｌｏｎｇ．Ｃｕｒｒｅｎｔ　ｓｉｔｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｏｉｌ
ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ　ｂｙ　ｈｅａｖｙ　ｍｅｔａｌ　ａｎｄ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ａｄｖａｎｃｅｓ　ｏｎ
ｔｈｅ　ｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ　ｔｅｃｈｉｑｕｅｓ［Ｊ］．Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓｏｉｌ
Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００４，３５（３）：３６６－３７０．
［８］　徐良将，张明礼，杨浩．土壤重金属镉污染的生物修复
技术研究进展［Ｊ］．南京师大学报：自然科学版，２０１１，
３４（１）：１０４－１０５．
ＸＵ　Ｌｉａｎｇ－ｊｉａｎｇ，ＺＨＡＮＧ　Ｍｉｎｇ－ｌｉ，ＹＡＮＧ　Ｈａｏ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ
ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｏｆ　ｂｉｏｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｃａｄｍｉｕｍ　ｐｏｌｕｔｅｄ
ｓｏｉｌ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｎａｎｊｉｎｇ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ：Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉ－
ｅｎｃｅ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１１，３４（１）：１０４－１０５．
［９］　吴月燕，刘秀莲，洪丰．３种植物对重金属富集能力的比
较［Ｊ］．科技通报，２００８，２４（２）：２７０－２７１．
ＷＵ　Ｙｕｅ－ｙａｎ，ＬＩＵ　Ｘｉｕ－ｌｉａｎ，ＨＯＮＧ　Ｆｅｎｇ．Ｃｏｍｐａｒｉ－
ｓｏｎ　ｔｏ　ａｄｓｏｒｐｔｉｖｅ　ａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｈｅａｖｙ　ｍｅｔａｌｓ　ｂｙ　ｔｈｒｅｅ
ｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．Ｂｕｌｅｔｉｎ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００８，２４
（２）：２７０－２７１．
５９６　第６期 蒋　明，等：１０种杓兰属植物ｒＤＮＡ　ＩＴＳ序列的克隆与分析