全 文 ：北方园艺 2007(1):35～ 37 ·专题综述 ·
王小霞樊新民崔辉梅
芸薹属蔬菜花药培养研究进展
　　摘　要:花药培养是获得单倍体和纯合二倍体的主要方法之一 ,现主要从试验材料 、花药
预处理 、培养基 、培养条件等方面综述了芸薹属蔬菜花药培养的研究进展 ,并分析了花培存在
的问题和发展前景。
关键词:芸薹属蔬菜;花药培养;单倍体;研究进展
中图分类号:S 634　文献标识码:A　文章编号:1001-0009(2007)01-0035-03
　　芸薹属种质资源十分丰富 ,
是重要的叶菜类蔬菜。在芸薹
属上主要采用的是常规育种方
法 ,但是随着育种目标的不断推
进 ,仅仅依靠常规育种手段已不
能满足工作的需要。单倍体育
种技术为缩短育种年限 ,提高育
种效率提供了可能。花药培养
是单倍体育种的重要方法之一 ,
由于培养方法日趋完善 ,培养效
率逐年提高 ,这一技术已被广泛
应用于常规杂交育种 ,逐渐成为
作物改良和新品种培育工作的
一个重要手段。
1　研究概况
自 1964年由 Guha 和 Ma-
heshwari首次在毛叶蔓陀罗上
通过花药培养获得单倍体植株
以来 ,花药培养先后在许多重要
作物上获得成功。芸薹属蔬菜
中 ,国外在白菜型油菜(B.campestris var olei fera)[ 1] ,甘
蓝型油菜(B.napus var olei fera)[ 2 , 3] ,青花菜(B .olera-
cea var italica)[ 4] ,结球甘蓝(B .oleracea var copitata)[ 5]
等蔬菜中有成功的报道。国内也有很多成功的报道 ,如
油菜[ 6] 、甘蓝型黄籽油菜[ 7] 、羽衣甘蓝[ 8] 等。主要研究的
是如何提高花培的成胚率上。这是影响花培能否应用
于育种实践的重要因素。
2　花药培养的影响因素
2.1　试验材料
2.1.1　基因型　试验证明 ,花药对离体培养的反应在
很大程度上受基因型的影响 。曹鸣庆等[ 9] 报道 ,将 17
个用于大白菜常规育种的基因型在NLN -13液体培养
基中进行游离小孢子培养 ,有16个基因型经由小孢子
胚胎发生途径获得了小孢子胚 ,各基因型之间发生频
第一作者简介:王小霞 , 女, 1980 年生 ,硕士研究生 ,研究方向为
蔬菜种质与遗传育种。
通讯作者:崔辉梅 , E-mail:chm agr@shzu.edu.cn。
收稿日期:2006-08-10
率存在很大的差异。原玉香等[ 10] 对 20个基因型的人
工合成的甘蓝型油菜进行的花药培养中也发现基因型
不同 ,胚的诱导率也不同 ,且易诱导基因型与难诱导基
因型间诱导率差别相当悬殊 。由此可见基因型在花培
中起着关键的作用。Jacobsen和Sopory在做马铃薯的
花药培养时发现 ,通过把两个培养反应差的系杂交 ,有
可能将控制形成花粉胚的基因累积起来 ,从而选出花
粉植株形成频率显著高于亲本的新系。 Kuginuki
等[ 11]在大白菜上也进行了尝试 ,并获得成功。
2.1.2　生理状态　花培的效果还与植株的生长环境 、
生理状态等因素有关。Lo K H.等[ 12]进行油菜小孢子
培养的供体植株来源于光温等条件受到严格控制的人
工气候室 ,这样可获得高的基因型频率和产胚量。官
春云[ 13] 在油菜小孢子培养中 ,通过对植株两种生长状
态的研究表明 ,来自生长室的供体植株 ,花蕾中处于单
核期至双核期的小孢子同步化程度高 ,增长速度快 ,小
孢子成胚的百分率高 ,达 5.11%。
2.1.3　花粉发育时期　花粉的发育时期是影响培养
效果的重要因素。就多数植物而言 ,单核中期至晚期
的花粉最容易形成花粉胚或花粉愈伤组织。一般认为
花蕾的长度 、瓣药比是判断小孢子发育阶段的可靠指
标 。但邹金美等[ 14]在试验过程中观察到:处于始花期
的主花序上的花蕾长度较大而花瓣与花药的比值较
小;而在末花期的主花序上的花蕾长度较小而瓣药比
较大 ,盛花期则介于始花期和末花期之间。这说明在
开花的不同时期 ,花粉的发育速度不同 ,导致相同的花
蕾长度而花蕾中单核靠边期花粉细胞占总花粉细胞的
比例不同。
2.2　花药预处理
为了提高花培的成功率 ,需要在接种前对试验材
料进行预处理。低温预处理在花培上比较常用。芸薹
属蔬菜一般使用的预处理温度为 4℃[ 7 , 15 , 16] 。朱彦涛
等认为 ,若对花蕾冷藏处理时 ,一般适于 1 d 内取蕾培
养 ,超过1 d则花蕾发黄 ,小孢子的生活力迅速下降;
若对1 ～ 3 cm长的花序冷藏处理时 ,一般适于 4 d内取
蕾培养。
2.3　培养基
2.3.1　培养基类型　芸薹属蔬菜花药培养常用的培
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养基有 Nitch 、MS 、B5 、NLN , 较为常用的为 B5 和
NLN
[ 17] 。林呐等[ 7]比较了 Miller、MS 、B5 3种培养基
对愈伤组织诱导频率的影响 ,结果表明 B5培养基的效
果最好。邹金美等[ 14] 把不同基因型的羽衣甘蓝花药
分别接种到 Keller、MS和 Nitch 3 种基本培养基上 ,
Keller培养基诱导胚状体的能力最强 , Nitch培养基居
中 ,MS培养基诱导率最低。Keller的基本配方最适合
于羽衣甘蓝花药培养诱导胚状体 。此外 ,将 Keller培
养基的有机成份加倍 ,则可以明显提高胚状体的诱导
效率 ,甚至能够提高 2倍以上。由此说明培养基中的
谷氨酰胺 、肌醇 、VB1 和 VB6 等有机成份在诱导胚状
体中所起的重要作用。
2.3.2　激素　一般的花药培养都是通过培养基中加
入激素产生愈伤组织 ,再促使愈伤组织分化产生形成
植株的。培养基中激素种类 、浓度 、配比常常对诱导细
胞生长和分裂起重要作用 。花粉究竟是发育为胚还是
愈伤组织 ,在很大程度上取决于培养基中激素的种类
和浓度。调节激素成分还可以影响到是花药的二倍体
的体细胞组织生长增殖还是单倍体细胞花粉增殖[ 18] 。
油菜花培中 ,适当降低 2 ,4-D用量 ,能提高胚状体的
诱导频率 ,抑制花药体细胞形成愈伤组织和植株[ 19] 。
特别值得一提的是:寸守铣等(1997)在甘蓝型油菜花
药培养过程中 ,在不同时期 ,加入适量的多效唑 ,对胚
状体的形成具有明显的促进作用 ,其诱导率可从
71.5%提高到 411.1%。
2.3.3　无机及有机营养物质　培养基中无机及有机
营养物质对花药培养也有一定的影响。Dias&Martins
(1999)对甘蓝类蔬菜花药培养研究发现 ,诱导培养基
中添加 10 mg/ L的 AgNO 3 后 ,出胚率大大增加 ,而在
未加AgNO3 的培养基中 ,这些基因型几乎没有胚状体
形成。另外 ,对 AgNO 3的反应依基因型的不同而有差
别。戴林建[ 20]还认为AgNO3 的应用可能解决芸薹属
植物组织培养过程中由于根的产生而抑制不定芽形成
的关键问题。有时附加物对于花粉愈伤组织的生长是
有益的。常用的有维生素 、氨基酸 、核酸碱基 、糖类等。
氨基酸对花药培养十分重要。Olsen 将培养基中 20
mM NH4NO3 减至 2 mM ,同时补加5.1 mM 谷氨酰
胺 ,使大麦花药培养绿苗产量提高到464%。研究认为
采用谷氨酰胺或天冬酰胺代替高浓度的硝酸铵对花药
培养最有利 。关于氨基酸对花药培养的作用机理 ,研
究甚少。Zhang 等认为脯氨酸与含羟基脯氨酸的蛋白
质的合成有关 ,而这种蛋白质是花粉壁的组成成分。
而Zhu等[ 21]报道了不同的氨基酸补加到培养基中 ,能
影响愈伤组织中同工酶的酶谱及过氧(化)物酶的活
性 ,并且表现出一定的相关性 ,从而提出氨基酸与过氧
(化)物酶基因的表达相关 ,而这种酶的活性似乎与植
株再生能力有关。因为随着愈伤组织继代次数的增
加 ,则绿苗分化率逐渐降低 ,而对应的过氧(化)物酶的
活性也逐渐降低 。
2.3.4　蔗糖　蔗糖是作为碳源和渗透压调节剂加在
培养基中。不同植物细胞渗透压差异很大 ,因此各种
植物花培要求不同的蔗糖浓度。芸薹属蔬菜花药培养
使用的浓度一般为10%[ 14 , 22] 。
2.3.5　活性炭　近年来活性炭作为一种有效的因子
被加入到培养基中。Anognostakis将 1%的活性炭加
入烟草花药的培养基中 ,从而使花粉植株的产量提高
了 1 ～ 2倍。卢钢等[ 23] 试验发现加活性炭可以克服毒
性物质的危害 ,由于不同的基因型早期释放的有毒物
质不同 ,活性炭的作用效果有很大的差异。低胚胎发
生率的基因型往往释放有毒物质的能力比胚胎发生率
高的基因型要强得多 ,所以加活性炭的效果明显。活
性炭处理对胚产量的影响在不同基因型上表现不同 ,
但对成熟胚的发育有明显的促进作用。而 Zhang D S
等[ 24]在花椰菜上的试验表明 ,部分基因型加入活性炭
后 ,胚胎发生率反而下降。原玉香等[ 10] 也在人工合成
甘蓝型油菜的花药培养中发现 0.5 g/L 活性炭的加入
降低了胚状体的诱导。而 GLANG等在油菜不同基因
型的游离小孢子培养中发现加入质量分数为 1%的活
性炭虽不提高胚产量 ,但却促进胚的发育 ,有利于植株
再生。究竟加不加活性炭和加多少还有待进一步
研究。
3　再生植株的移栽
再生植株长至 4 ～ 5片叶大小时可以进行移栽。
移栽时洗净试管苗所带培养基 ,然后移入装有培养基
质的塑料钵中进行练苗 ,数天后栽入大田。在这个过
程中 ,练苗是关键 ,练苗所用的培养基质配方是否合
适 ,是否消过毒 ,培养基质透气保水性能如何 ,以及培
养室中的温 、湿度及光照等是否适宜都将影响再生植
株的成活率。
4　花粉植株倍性鉴定及染色体加倍
4.1　倍性鉴定
花药培养所得到的再生植株虽是由单雄生殖产
生 ,但再生植株并不象期望的那样全是单倍体 ,其倍性
是混杂的。Stipic M 在花椰菜的花药培养中获得的再
生植株中单倍体∶二倍体∶多倍体为 6 ∶79 ∶15。
Cao M Q对芜菁游离小孢子培养获得的再生植株的倍
性分析 ,2个品种中单倍体的比例分别为 25%和83%。
如何确定再生植株的倍性水平是值得研究的。长期以
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来都是通过显微观察来鉴定个体的染色体倍性 ,主要
方法有:花粉粒大小判别法 、根尖染色体记数法 、气孔
保卫细胞叶绿体记数法 、保卫细胞长度测量法等 ,这些
显微方法技术难度大。目前最快速且有效地鉴别花培
苗染色体倍性的方法是采用倍性分析仪或称 DNA流
式细胞仪测定法(DNA flow cytometry),它可以直接测
定细胞的 DNA 含量 ,从而快速鉴别植株的染色体倍性
水平 ,并已被成功地用于花椰菜(B.oleracea uar .bot-
rytis)和青花菜(B .oleracea uar .italica)花培苗倍性
鉴别上。
4.2　染色体加倍
单倍体植株如何加倍成纯合的二倍体植株 ,对于
将花培技术真正用于实际的育种工作至关重要 ,目前
加倍的途径有自然加倍和人工加倍。
4.2.1　自然加倍　花粉植株群体中自发加倍的频率
在不同植物上是不同的 ,自然加倍可能来源于未减数
的配子或最初几次原胚的核内有丝分裂 ,自然加倍的
优点是不会出现畸变。
4.2.2　人工加倍　人工加倍的方法通常有 2种 ,一是
先移栽后加倍 ,Polsoni等在开花时根据花的形态判断
植株倍性 ,然后将单倍体植株根洗净 , 用 0.1%～
0.34%的秋水仙素浸泡 ,砍去植株上部 ,任其重新生
长。二是先加倍后移栽 ,将具有 3 ～ 4叶 ,1 ～ 3根的植
株通过无菌操作转入 B5 培养基中 , 附加 10 ～ 100
mg/L 秋水仙碱 ,加倍后移栽入土 ,开花时 ,根据花的形
态和花粉发育情况判断倍性。
5　展望
花药培养难度大的原因主要是花粉来源 、植株的
基因型及其所处的生理状态 ,培养基的物理状态及其
成分 、培养方式等 ,这些必要的因素尚有待进一步深入
研究。同时还应关注这方面的基础性研究 ,并通过遗
传手段创造适合培养的基因型。另外 ,培养基也是一
个重要的影响因素 ,应该加强筛选工作来找出合适的
培养基。随着这些方面的改进 ,芸薹属蔬菜的花药培
养效率可能会得到很大的提高 ,为芸薹属蔬菜育种做
出更大的贡献。
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