全 文 :中国当代医药 2016 年 3 月第 23 卷第 7 期
CHINA MODERN MEDICINE Vol. 23 No. 7 March 2016
·论 著·
钩藤是茜草科钩藤属植物,主要分布于我国广东、
广西、四川、云南、贵州等地区。 《中国药典》2015年版
规定的钩藤为茜草科植物钩藤[Uncaria rhynchophylla
(Miq.)Miq.ex Havil.]、 大叶钩藤 [Uncaria macrophylla
Wall.]、毛钩藤[Uncaria hirsuta Havil.]、华钩藤[Uncaria
sinensis (Oliv.) Havil.]或无柄果钩藤 [Uncaria sessil-
ifructus Roxb.]的干燥带钩茎枝[1]。
钩藤为常用中药,药用历史悠久,具有息风定惊、
清热平肝的功效。但是钩藤药材在市场上的分类鉴定
比较混乱,影响了中药材用药的准确性和安全性。 因
此, 有必要运用 DNA 分子标记技术进一步对钩藤属
植物不同种间进行鉴定。 核糖体转录间隔区(rDNA
ITS)序列作为分子条形码的鉴定能力已经在药用植
物很多个科属基原植物及药材的鉴定中得到验证[2-12]。
本研究对采自广州中医药大学药王山的一种钩藤属
药用植物进行分子鉴定和遗传分析。 现报道如下。
1 材料与方法
1.1 材料来源与鉴定
实验用的钩藤样品于 2015 年 7 月采集于广州中
一种钩藤属植物的rDNA ITS序列分析
王业胜 1 李奇威 1 周 林 1 管润锋 1 曾常青 2 朱 爽 1▲
1.广东药学院生命科学与生物制药学院 广东省生物技术候选药物研究重点实验室,广州 510006;
2.广东药学院中药学院,广州 510006
[摘要] 目的 以核糖体转录间隔区(rDNA ITS)序列作为分子条形码,对一种常用中药材钩藤进行分子鉴定和遗传
分析,并阐明其在钩藤属内种间的分子系统发育关系。 方法 通过改良十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法对 2015年
7 月采集的钩藤进行总 DNA 提取,利用通用引物对 rDNA ITS 序列进行 PCR 扩增,经克隆、测序后,运用 MEGA
软件进行系统发育分析和构建系统发育树。 结果 测序得到该钩藤的 rDNA ITS区序列长度为 718 bp,序列分析
结果显示其与 GenBank 数据库中已有的钩藤(Uncaria rhynchophylla)rDNA ITS 区序列之间相似度达 99.8%,并且
在系统发育树中并排聚类成一支。 结论 基于 ITS区序列测定分析的分子生物学方法和构建系统发育树的分子
遗传学方法,可以对钩藤属药用植物进行分子鉴定和遗传分析,为钩藤属药用植物的种间分类地位以及种类鉴
定提供准确的分子证据。
[关键词] 钩藤;ITS序列;分子鉴定;系统发育树
[中图分类号] S567.239 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721(2016)03(a)-0004-04
The phylogenetic study of one Genus Uncaria plant based on rDNA ITS
WANG Ye-sheng1 LI Qi-wei1 ZHOU Lin1 GUAN Run-feng1 ZENG Chang-qing2 ZHU Shuang1▲
1.School of Biosciences and Biopharmaceutics,Guangdong Pharmaceutical University Key Laboratory for Biotechnology
Drug Candidates of Guangdong Province,Guangzhou 510006,China;2.School of Traditional Chinese Medicine,Guang-
dong Pharmaceutical University,Guangzhou 510006,China
[Abstract] Objective To clarify the phylogenetic relationship of one species of Uncaria,molecular identification and
genetic analysis were carried out by using the rDNA ITS sequence as molecular barcoding. Methods Molecular identi-
fication and genetic analysis were carried out with the rDNA ITS sequence as molecular marker.Total DNA was ex-
tracted with modified CTAB method and thereby rDNA ITS regions were amplified with universal primer,sequenced and
phylogenetic analysed with MEGA 6.0 at July 2015. Results The entire rDNA ITS sequence of Uncaria was 718 bp.Se-
quence analysis showed that the rDNA ITS sequence was closely related to Uncaria rhynchophylla available in Gen-
Bank and the similarity reached 99.8%. Conclusion Based on molecular biology methods of rDNA ITS region analysis,
molecular identification is available in accurate classification on traditional Chinese medicinal material plants in Genus
Uncaria and provide molecular evidence for taxonomy and identification of different species in Genus Uncaria.
[Key words] Uncaria;ITS sequence;Molecular identification;Phylogenetic tree
[基金项目 ] 国家自然科学基金资助项目(21207021);广东
省中山市科技计划项目(20101H017);广东大学生科技创新
培育专项资金项目(pdjh2015b0279)
[作者简介] 王业胜(1990-),男,2014 级分子生物学专业在
读硕士研究生,研究方向:中药分析与鉴定
▲通讯作者:朱爽(1977-),男,副教授,硕士生导师,主要从
事中药分析与鉴定研究工作
4
中国当代医药 2016 年 3 月第 23 卷第 7 期
CHINA MODERN MEDICINE Vol. 23 No. 7 March 2016
·论 著·
医药大学药王山。 常绿木质藤本; 小枝四棱柱形,褐
色,季净无毛;叶腋有成对或单生的钩,向下弯曲,先
端尖;叶对生,具短柄,叶片卵形,卵状长圆形或椭圆
形。本钩藤样品经广东药学院曾常青教授初步从形态上
鉴定为钩藤[Uncaria rhynchophylla (Miq.)Miq.ex Havil.]。
钩藤总 DNA的提取采用新鲜采集的叶片,或者使用密
封袋中已经用硅胶快速干燥过的新鲜采集的叶片。
1.2 仪器和试剂
BIO-RAD T100TM Thermal Cycler PCR 仪(美国
Bio-Rad公司),Thermo Scientific Heraeus Pico17 台式
离心机(美国赛默飞世尔科技公司),HHS-2S 电子恒
温不锈钢水浴锅(上海宜昌仪器纱筛厂),TP - 402 电
子分析天平 (美国丹佛仪器北京有限公司),SW-CJ-
1F 清洁工作台 (苏州安泰公司),BG-Sub MIDI 水平
电泳仪(北京永恒生物器材公司),天能-4100 数码凝
胶图像分析系统(上海天能公司),SPX 智能型生化培
养箱(广州深华公司)。
SYBR Green Ⅰ电泳染料购自北京百泰克生物技
术有限公司,DL2000 DNA Marker 购自 TIANGEN 生
化科技(北京)有限公司,pMD18-T Vector、Taq 酶以
及 DNA凝胶回收试剂盒均购自 TaKaRa大连宝生物工
程有限公司,通用引物合成由生工生物工程(上海)股份
有限公司完成,十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethyl
ammonium bromide,CTAB)、 乙二胺四乙酸(ethylene
diamine tetraacetic acid,EDTA)、 聚乙烯吡咯烷酮
(polyvinyl pyrrolidone,PVP)、 三羟甲基氨 基甲烷
(Tris)购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。 其
余试剂均为分析纯。
1.3 方法
1.3.1 钩藤植物基因组 DNA 的提取 钩藤植物基因组
DNA 的提取采用改良的 CTAB 法 [13]:称量约 1 g 新鲜
采集的叶片在液氮的低温条件下研磨成细粉末。将粉
末转移到 50 ml的离心管中,加入约 5 ml 65℃预热的
CTAB 裂解液 (4%CTAB,1.4 mol/L NaCl,100 mmol/L
Tris-Cl,25 mmol/L EDTA,2%β-巯基乙醇 ,1%PVP,
pH 8.0),65℃水浴 2 h (每隔 30 min 轻摇振荡 1 次)。
每 1 毫升混合液分装到 1.5 ml Eppendorf 管中 ,
12 000 r/min 离心 10 min,取上清液,用等体积的 Tris
饱和酚(pH 8.0),酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)和氯仿-
异戊醇(24∶1)各抽提 1次,12 000 r/min离心 10 min,取
上清液,加入 0.1倍体积 3 mol/L NaAc(pH 5.2)溶液,再
加入 2 倍体积无水乙醇,-20℃沉淀 1 h,12 000 r/min
离心 10 min,移去上清液,用 1 ml 70%冷乙醇洗涤
2次,干燥后用 50 μl无菌 1×三羟甲基氨基甲烷-乙二
胺四乙酸(Tris-ethylene diamine tetraacetic acid,TE)
缓冲液回溶。 取 2 μl回溶后的总 DNA溶液进行电泳
鉴定,记录凝胶成像结果。
1.3.2 钩藤植物 ITS 序列的 PCR 扩增以及扩增产物
的纯化 使用扩增 ITS序列全长的引物组[14-15]ITS4(5′-
TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)和 ITS5(5′-GGAA-
GTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)扩增药王山的钩藤植
物总 DNA的 ITS序列。 配制 20 μl 的 PCR 体系:10×
PCR Buffer (2.5 mmol/L,Mg2+ Plus)2 μl,dNTP Mixture
(2.5 mmol/L)1.6 μl,引物量为 8 pmol,Taq(5 U/μl)0.1 μl,
加入模板 DNA 约 50 ng, 剩下体积以无菌超纯水
补足。 PCR 扩增程序为:94℃预变性 5 min,94℃变性
30 s,52℃退火 30 s,72℃延伸 1 min,共循环 30 次,最
后在 72℃延伸 10 min。 PCR产物用 1%的琼脂糖凝胶
电泳鉴定,在凝胶成像系统下检测并记录结果。 PCR
扩增产物按照大连宝生物公司的 DNA 凝胶回收试剂
盒的具体操作进行割胶回收和纯化。
1.3.3 ITS 区片段的连接、 转化以及测序 使用 DNA
凝胶回收试剂盒纯化后的 PCR 扩增产物与 pMD18-
T-Vecter 连接,形成目的片段与载体构成的环形质粒
并采用热激法转化到 Escherichia coli JM109 感受态
细胞,在选择性培养基上进行氨苄西林的筛选。 从平
板上选取 3个阳性重组单克隆菌落,进行过夜摇菌后
各取 1 ml 菌液由华大公司进行 ITS 区序列测定,每
个样品均进行正反双向测序。
1.3.4 ITS 序列比对分析以及系统发育树的构建 将
测序得到的峰图采用 Bioedit 软件查看和校对, 去除
低质量序列后在 NCBI 上采用 Blast 进行比对分析,
得到国际基因数据上与其同源的序列片段以及序列
相似性程度。根据相似性程度初步确定药王山钩藤样
品的基源。 将得到的序列运用 MEGA 软件(Version
6.06) 进行分子系统发育分析 。 通过最大简约法
(maximum parsimony,MP)进行计算分析,建立药王山
钩藤植物的最大简约树。 用自展检验法 (Boot-strap
text)1000次检验 MP上各分支的置信水平。
2 结果
2.1 钩藤总 DNA的提取结果
药王山的钩藤样品总 DNA 经琼脂糖电泳后扫描
拍照并记录结果,可见总 DNA 电泳图谱呈现一条清
晰完整的主条带,没有明显降解(图 1),说明改良的
CTAB 法可以有效提取药王山钩藤样品的基因组
DNA。
2.2 药王山钩藤样品的 ITS序列 PCR扩增结果
以提取的药王山钩藤样品的总 DNA 为模板,从
模板原液开始分别稀释 5 个梯度浓度进行 ITS 区序
列的 PCR 扩增。 从 PCR 的扩增结果来看,模板 DNA
5
中国当代医药 2016 年 3 月第 23 卷第 7 期
CHINA MODERN MEDICINE Vol. 23 No. 7 March 2016
·论 著·
在 1×102~1×103的稀释倍数时,PCR 的扩增效果是最
理想的。 在模板浓度最佳的情况下,药王山钩藤样品
的 ITS 区序列的 PCR 扩增产物的电泳图谱呈现清晰
完整的条带,而且条带较亮,没有非特异扩增条带,大
小在 720 bp左右(图 2),说明在最佳的模板浓度条件
下能够有效扩增 ITS 区序列, 钩藤基因组 DNA 中的
抑制物对 PCR的影响达到最小。
图 2 最佳模板浓度下的 PCR 扩增产物的电泳图谱
M:DL2000 DNA Marker;1:钩藤样品
2.3 ITS序列分析
采用 Bioedit 软件查看和校对, 可知测序得到的
核糖体 ITS区序列的长度为 718 bp。为了获得与该序
列亲缘关系相近的钩藤属其他种的序列,把测序得到
的 ITS 序列与 GenBank 数据库中已有的 ITS 序列进
行比较分析。 应用 Bioedit软件对 DNA序列之间进行
比较分析发现,该钩藤样品与 GenBank数据库中已有
的钩藤 (Uncaria rhynchophylla,KF881265)的相似度
最高, 达到 99.8%, 故将该钩藤植物归类为钩藤[Un-
caria rhynchophylla (Miq.)Miq.ex Havil.]。
2.4 分子系统发育分析
采用 MEGA 软件将测序得到的 ITS 序列与其亲
缘关系相近的钩藤属的其他种的 ITS 序列进行序列
比对后用 MP 计算和分析,并以 Nauclea xanthoxylon
(AJ346877)为外类群构建一棵药王山钩藤植物的系
统发育树(图 3),评估各物种之间的亲缘性。 通过对
14个物种 ITS序列的简约性分析发现,发育树的枝长
为 107,一致性指数为 0.739 130,保留指数为 0.796 610,
所有位点复合指数和简约性信息位点分别为 0.707 271
与 0.588 799。
图 3 钩藤样品的系统进化树
3 讨论
有文献表明, 生物碱是钩藤的主要化学成分 [16],
而生物碱主要是以钩藤碱和异钩藤碱为主。钩藤生物
碱的主要功效是抗血栓形成、抗惊厥作用、抗血小板
聚集以及降血压等 [17],但是对于钩藤的药效成分,钩
藤属内不同种的钩藤中药材还是有明显的差别[18]。 再
者市场上销售的钩藤中药材种类比较混乱,仅靠形态
学等传统的分析方法难以鉴别,经常出现以次充好的
现象,严重影响了中药材用药的准确性和安全性。 因
此,有必要利用一种快速的、高灵敏的方法进一步鉴
定钩藤属植物的种间关系。随着分子生物学的快速发
展, 应用 DNA 分子标记技术对药用植物进行鉴定已
逐渐成为研究的热点[19-20]。而 ITS序列作为 DNA条形
码的分析技术具有技术简单、结果准确、重复性好等
优点,广泛应用于药用植物的鉴定。 依靠 ITS 序列标
记能够作为钩藤中药材种内和种间鉴别的有效分子
标志,利用该方法的原理,对钩藤属中药材进行分子
鉴定和遗传分析,有利于正本清源。
ITS序列的分析方法很好地弥补了中药材鉴定的
图 1 药王山钩藤植物基因组 DNA 的电泳图谱
M:DL2000 DNA Marker;1:药王山钩藤基因组 DNA
6
中国当代医药 2016 年 3 月第 23 卷第 7 期
CHINA MODERN MEDICINE Vol. 23 No. 7 March 2016
·论 著·
传统分析方法(依据形态学、组织学和化学成分等)的
不足,可以从分子遗传角度对钩藤等药用植物的种间
分类地位以及种类鉴定提供分子生物学证据,从而增
加中药材用药的准确性和安全性。本研究对采集自广
州中医药大学药王山的一种钩藤植物进行基因组
DNA 提取,ITS 区序列扩增,序列测定与分析,以及采
用 MP 构建该钩藤样品在其近缘种之间的系统发育
树,从树图可以看出,该钩藤样品与 GenBank 数据库
中已有的钩藤(U.rhynchophylla,KF881265)聚类成为
一枝,支持率达到 84%;然后又与钩藤属其他种的常
用钩藤植物,分别是华钩藤(U.sinensis,FJ980386)、毛
钩藤(U.hirsute,GU937110)、北越钩藤(U.homomalla,
KF881255)、白钩藤 (U.sessilifructus,GU937111)以及
攀茎钩藤(U.scandens,KF881275)聚类成一枝。 由此
可见,从分子生物学和遗传学的角度分析,该钩藤样品
与 GenBank数据库中钩藤(U.rhynchophylla,KF881265)
的亲缘关系最近,并且与之序列的相似度高达 99.8%,
而与 GenBank 数据库中已有其他种常用钩藤植物的
亲缘关系较远,并不直接与这些种的钩藤植物聚类成
为一枝,所以从分子系统发育水平上支持了根据形态
特征把该钩藤属中药材植物鉴定为钩藤 [Uncaria
rhynchophylla (Miq.)Miq.ex Havil.]的初步结果,表明
基于 rDNA ITS序列分析和构建系统发育树的分子生
物学方法可以快速准确地对钩藤等药物植物进行分
子鉴定和遗传分析。
[参考文献]
[1] 国家药典委员会.中国药典(一部)[M].北京:中国医药科
技出版社,2015.
[2] Alvarez L,Wendel JF.Ribosomal ITS sequences and plant
phylogenetic inference[J].Mol Phylogenet Evol,2003,29(3):
417-434.
[3] Chen SL,Yao H,Han JP,et al.Validation of the ITS2 re-
gion as a novel DNA barcode for identifying medicinal
plant species [J].PLoS One,2010,5(1):e8613.
[4] Yao H,Song JY,Liu C,et al.Use of ITS2 Region as the u-
niversal DNA barcode for plants and animals [J].PLoS One,
2010,5(10):e13102.
[5] Pang XH,Song JY,Zhu YJ,et al.Applying plant DNA bar-
codes for Rosaceae species identification [J].Cladistics,
2011,27(2):165-170.
[6] Han JP,Liu C,Li MH,et al.Relationship between DNA
barcoding and chemical classification of Salvia medicinal
herbs [J].Chin Herb Med,2010,2(1):16-29.
[7] 陈贝贝,宋经元,姚辉,等.基于 ITS2 条形码的两面针药
材及其混伪品的鉴别 [J].中草药 ,2013,44(15):2150-
2153.
[8] 李栎,肖憬,苏振宇,等.ITS2 条形码序列对茜草科黎药
植物的鉴定[J].中草药,2013,44(13):1814-1818.
[9] 叶子,卢叶,王峥涛,等.基于 ITS序列鉴别石斛类药材[J].
中国中药杂志,2014,39(20):3928-3935.
[10] 贺海波,熊超,郭力城,等.ITS2序列鉴定多基原药材老
鹳草[J].中国药学杂志,2015,50(17):1505-1511.
[11] 吴波,李永波,饶建波,等.基于 ITS2 条形码的桔梗药
材遗传多样性研究[J].中国中药杂志,2015,40(6): 1075-
1078.
[12] 张文娟,康帅,魏锋,等.基于 ITS 序列分析鉴别冬虫夏
草与古尼虫草 [J].药物分析杂志 ,2015,35(9):1551-
1555.
[13] Doyle JJ,Doyle JL.A rapid DNA isolation procedure for
small quantities of fresh leaf tissue[J].Phytochem Bull,
1987,19(1):11.
[14] Innis MA,Gelf and DH,Sninsky JJ,et al.PCR Protocols:
a guide to methods and applications[M].San Diego:Aca-
demic Press,Inc.CA.1990.
[15] Chou SJ,Yen JH,Fang CL,et al.Authentication of medici-
nal herbs using PCR -amplified ITS2 with spectific
primers [J].Planta Med,2007,73(13):1421-1426.
[16] 宋欣濛,薛睿,季宇彬.钩藤中吲哚类生物碱化学成分
及药理活性研究进展 [J].亚太传统医药,2014,10(5):
64-68.
[17] 王章姐,孙维矿.钩藤的化学成分及药理作用研究进展[J].
现代企业教育,2010,(24):197-198.
[18] 许丹丹,莫志贤.钩藤与绒毛钩藤的化学成分及药理作
用[J].中药新药与临床药理,2005,6(4):311-314.
[19] Gu W,Song J,Cao Y,et al.Application of the ITS2 re-
gion for barcoding medicinal plants of Selaginellaceae in
pteridophyta [J].PLoS One,2013,8(6):e67818.
[20] Li DZ,Liu JQ,Chen ZD,et al.Plant DNA barcoding in
China [J].J Syst Evol,2011,49(3):165-168.
(收稿日期:2015-12-16 本文编辑:卫 轲)
7