全 文 ：分子植物育种，2014年，第 12卷，第 3期，第 547-553页
Molecular Plant Breeding, 2014, Vol.12, No.3, 547-553
技术主题
Technology Feature
桤木属植物 AFLP反应体系的建立与优化
饶龙兵 1* 杨汉波 1,2 郭洪英 3 段红平 2 陈益泰 1
1中国林科院亚热带林业研究所,富阳, 311400; 2云南农业大学农学与生物技术研究所,昆明, 650201; 3四川林业科学研究院,成都, 610081
*通讯作者, raolb@163.com
摘 要 为了建立桤木属植物 AFLP体系，筛选扩增条带丰富的引物，本研究以欧洲桤木(A. glutinsoa)为材
料，对 AFLP反应过程中的关键因素(DNA质量和浓度,酶切,扩增体系等)进行了研究。结果表明：预扩增稀
释产物 3.0 μL，酶切时间以 5 h，连接 16 h，连接产物稀释 10倍用于预扩增，预扩增产物稀释 20倍为宜。确
定桤木 AFLP-PCR 20 μL的反应体系：模板 DNA 300 ng，10×Taq DNA聚合酶 Buffer (含Mg2+) 2.0 μL，dNTPs
0.3 μL，引物 1.0 μL，Taq DNA聚合酶 0.6 U，加 ddH2O至 20 μL，并利用建立的体系筛选出 7对扩增条带多、
条带清晰、多态性好的引物。本研究建立了适用于桤木属植物的 AFLP反应体系，并筛选出适合桤木属植物
的引物，为今后利用 AFLP标记技术进行桤木属遗传多样性分析提供了一定的实验依据。
关键词 AFLP,欧洲桤木,多态性
Establishment of the Optimized AFLP Analysis System for Alnus
Rao Longbing 1* Yang Hanbo 1,2 Guo Hongying 3 Duan Hongping 2 Chen Yitai 1
1 Institute of Subtropical Forestry, CAF, Fuyang, 311400; 2 School of Agriculture and Biological Technic, Yunnan Agricultural University, Kunming,
650201; 3 Sichuan Academy of Forestry, Chengdu, 610081
* Corresponding author, raolb@163.com
DOI: 10.13271/j.mpb.012.000547
Abstract The optimized AFLP analysis system was established for Alnus. A. glutinosa was used to comparatively
study and analysis their essential factors influencing the results of AFLP, including the quality and concentration of
the extracted DNA, digested time and amplification system that influenced the results of the AFLP. The results
indicated that the dosage of template DNA was 300 ng; The reaction time of enzyme digestion was 5 h; The
production of enzyme digestion copulation 16 h; 20 times of dilution for the products of pre-amplification was
suggested for selective amplification; The system of AFLP-PCR that diluted production of selective amplification
3.0 μL, 10×Taq DNA polymerase Buffer (include Mg2+) 2.0 μL, dNTPs 0.3 μL, primers 1.0 μL, Taq DNA polyme-
rase 0.6 U, mix in ddH2O to 20 μL。Selected 7 pairs by many amplified bands, screening repeatedly and high
polymorphism. By using the AFLP reaction system, primers suitable to Alnus were screened out. Those results
provide fundamentals for further molecular studies on Alnus using AFLP marker.
Keywords AFLP, A. glutinosa, Polymorphism
收稿日期：2013-09-09 接受日期：2014-01-23 网络出版日期：2014-05-11
URL: http://www.biopublisher.cn/index.php/mpbopa/article/view/1770
基金项目：本研究由十二五国家科技支撑项目桤木育种专题(2012BAD01B0604)和中央级公益性科研院所基本科研业务费专项
资金(RISF2013010)共同资助
桤木(Alnus)为桦木科(Betulaceae)植物，其地理
分布为欧洲、亚洲、和美洲，主要分布于北半球寒温
带、温带和亚热带地区，美洲最南达秘鲁。桤木属植
物为固氮树种，喜光、喜湿，根系发达，对土壤要求不
严，适应性强，在长江中下游地区防护林建设工程中
具有重要作用(卓仁英等, 2003)。自 20世纪 80年代
桤木在工业生产上的发现与应用，桤木在生态、经济
及遗传改良等方面的价值引起研究人员的极大关注
图 1欧洲桤木基因组 DNA琼脂糖电泳图
注: M: Lambda DNA/HindⅢ DNA marker; 1~4:不同样品基因
组 DNA
Figure 1 Agarose electrophoresis of DNA from A. glutinosa
Note: M: Lambda DNA/HindⅢ DNA marker; 1~4: DNA isolat-
ed from different pattern
图 2酶切效果图
注: M: DL2000 DNA marker; 1~4:不同 DNA酶切效果
Figure 2 The impacted of digestion
Note: M: DL2000 DNA marker; 1~4: The impacted of digestion
by EcoRⅠ and MseⅠ from different DNA patterns
(崔洪亮, 2012;张元法等, 2012;于东阳等, 2013)。对
桤木的研究包括固氮(Bostanci, 1985)、抗逆(Mackie
and Williams, 1984)及种间杂交 (Ewing, 1996)等。
Bouquet等(1987a; 1987b)采用 RFLP技术对 A. crisp
核糖体 DNA基因结构进行了研究、利用同工酶技术
研究桤木属植物遗传多样性，有学者以 RAPD研究
其遗传多样性(李洁, 2007;李洁等, 2008;马成涛, 2011;
夏勇 , 2012)。但到目前为止，未见桤木属植物的
AFLP研究报道。
DNA分子标记技术已发展有数十种，如 RFLP、
RAPD、SSR、ISSR等分子标记技术，广泛应用于遗传
育种、亲缘关系鉴别、基因库构建等方面。SSR标记
是共显性标记，在植物杂交鉴定上具有优势，但开发
新的引物具有一定的难度。ISSR标记虽然操作简单，
检测方便，但需筛选的引物较多，比较费力。RAPD
的操作简单，揭示的多态性高，但这类标记一般为显
性遗传，显性纯合和杂合基因型不能被识别，所提供
的信息量较少。AFLP是荷兰科学家 Vos等(1995)发
明的一项基于 PCR技术的新的分子标记技术，具有
覆盖率高、多态性强、可重复性好、可信度高等特点，
AFLP技术广泛应用于甲基化研究(边禹, 2010)、物种
遗传多样性研究(韩洁等 , 2007)、分类与进化研究
(Collado-Romero et al., 2008)、物种鉴别(廖振坤等 ,
2006)、构建遗传连锁图谱(Olukolu et al., 2009)、分子
标记辅助的轮回选择育种(周延清, 2005,化学工业出
版社, pp.162-182)等多个方面。
本研究以欧洲桤木(A. glutinosa)为试验材料，对
桤木属植物 AFLP分析过程中的影响因子(Taq DNA
聚合酶浓度,预扩增产物稀释倍数, dNTPs用量,镁
离子浓度和引物用量)进行研究，建立并优化了桤木
属植物 AFLP反应体系，并采用优化的体系筛选多
态性好的选择性扩增引物，为桤木属植物的分类及
遗传多性分析提供技术参考。
1结果与分析
1.1 DNA检测结果
由图 1可知，DNA大小在 23 000 bp左右，条带
清晰，无拖带情况，点样孔无污染，DNA完整无降
解。OD260/OD280=1.82，质量浓度为 435 ng/μL，符合
AFLP分析中的双酶切要求，表明提取的 DNA适合
AFLP分析。
1.2酶切及预扩增结果
由图 2可知，酶切效果良好，酶切产物弥散分布
于 100~1 000 bp之间，可以用于 AFLP试验分析。预
扩增的不仅为选择性扩增提供模板，而且通过 PCR
扩增对模板起到纯化的作用，使选择性扩增能产生
稳定、清晰的条带(孟淑春等, 2008)。将连接产物进行
PCR扩增，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测效果，结果显
示(图 3)：预扩增良好，预扩增产物片段主要集中于
100~1 000 bp之间，可以用于选择性扩增。
1.3 AFLP选择性扩增体系的优化
本研究以 E15/M09 (E15: 5-GACTGCGTACCA-
ATTCTAG-3; M09: 5-GATGAGTCCTGAGTAACA-
G-3)引物组合进行选择性扩增，对选扩中几个影响
因子(Mg2+浓度, 引物用量, Taq DNA聚合酶和预扩
增产物的稀释倍数和 dNTPs浓度)进行了优化。
1.3.1稀释倍数对扩增的影响
预扩增引物选择性能较差，预扩增产物 1.5%琼
脂糖凝胶电泳呈弥散状，多态性差，需进一步进行选
择性扩增。选择性扩增以预扩增产物稀释 10、20、40、
60和 80倍为模板(图 4)，在设定的 5个稀释倍数范
围内均能扩增出清晰的条带。虽然 AFLP对 DNA的
桤木属植物 AFLP反应体系的建立与优化
Establishment of the Optimized AFLP Analysis System for Alnus 548
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
图 3预扩增琼脂糖电泳检测效果图
注: M: DL2000 DNA marker; 1~4:不同样品预扩增效果
Figure 3 Agarose electrophoresis of pre-amplification
Note: M: DL2000 DNA marker; 1~4: The impacted of pre-ampli-
ficatio from different pattrns
图 4预扩增产物稀释倍数对选择性扩增的影响
注: M: DL2000 DNA marker; 1~5: 预扩增产物的稀释倍数分
别为 10, 20, 40, 60和 80倍
Figure 4 The impacted of selective amplification by the diluted
times of pre-amplification
Note: M: DL2000 DNA marker; 1~5: Optimization of dilutied
times of pre-amplification were 1/10, 1/20, 1/40, 1/60, 1/80
图 5 dNTP浓度对选择性扩增的影响
注: M: DL2000 DNA marker; 1~5: dNTP 用量分别为 0.2 μL,
0.4 μL, 0.8 μL, 1.2 μL, 1.6 μL
Figure 5 The impacted of selective amplification by dNTP con-
centration
Note: M: DL2000 DNA marker; 1~5: Optimization of dNTPs
were 0.2 μL, 0.4 μL, 0.8 μL, 1.2 μL, 1.6 μL
图 6引物用量对选择性扩增结果的影响
注 : M: DL2000 DNA marker; 1~5: 引物用量分别为 0.5 μL,
1.0 μL, 1.5 μL, 2.0 μL, 2.5 μL
Figure 6 The impacted of elective amplification by amount of
primer
Note: M: DL2000 DNA marker; 1~5: The amount of primers
were 0.5 μL, 1.0 μL, 1.5 μL, 2.0 μL, 2.5 μL
浓度要求不严格，但低于 1×10-12 g/μL时得到的 AFLP
指纹样式往往不可靠(Vos et al., 1995)。本研究以预
扩增产物稀释 20倍为模板 DNA。
1.3.2 dNTPs用量对扩增的影响
dNTP是 PCR反应中扩增合成新核苷酸的原料
和能量来源，因此 dNTP浓度对 PCR反应结果影响
很大。浓度过低则产率下降，浓度过高错配的概率加
大，并与 Mg2+竞争酶的活性中心。从图 5中可以看
出 dNTP (20 μmol/L)用量为 0.2~0.8 μL 时，扩增条
带逐渐增强，而超过 0.8 μL时条带逐渐变暗。说明
dNTP mixture用量太高或太低均会造成选择性扩增
产物减少，从而影响选择性扩增效果。因此在既不影
响扩增效果，又节约试剂的基础上，选择 0.3 μL为选
择性扩增 dNTPs的适宜用量。
1.3.3引物用量及Mg2+对扩增的影响
从图 6中可以看出引物用量为 0.5~2.5 μL时条
带亮度的差异不大，均能扩增出清晰的条带。Mg2+
的浓度不仅影响酶的活性，还能与反应中的 dNTP、
引物、模板结合，影响模板与引物的结合率，产生特
异性产物(韩洁等, 2007)。从图 7可以看出，Mg2+用
量为 1.0~3.0 μL时均能扩增出清晰的条带。因此，在
经济又不影响实验结果的前提下，选取 Mg2+用量
2.0 μL、引物用量 1.0 μL可达实验要求。
1.3.4 Taq DNA聚合酶用量对扩增的影响
Taq酶是 PCR反应中的一个重要因素，从图 8
可以看出随着 Taq酶浓度的提高，条带的亮度由低
到高，Taq酶 0.2 U条带相对较暗，0.4~0.6 U差异不
是很显著，0.8 U时条带开始弥散。酶量过低 PCR反
应敏感性较差，所能提供的信息少，酶量过高非特异
性条带会出现，因此选择 0.6 U为适宜 Taq NDA聚
合酶浓度。
1.4 AFLP反应体系稳定性鉴定及引物筛选
通过对以上 AFLP-PCR反应体系各因素的优化，
确定了桤木 AFLP-PCR 20μL的反应体系：模板 DNA
300 ng，10×Taq DNA聚合酶 Buffer (含 Mg2+) 2.0 μL，
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图 7 Mg2+浓度对选择性扩增结果的影响
注: M: DL2000 DNAmarker; 1~5: Mg2+用量分别 1.0 μL, 1.5 μL,
2.0 μL, 2.5 μL, 3.0 μL
Figure 7 The impacted of elective amplification by Mg2+ concen-
tration
Note: M: DL2000 DNA marker; 1~5: The amount of Mg2+ were
1.0 μL, 1.5 μL, 2.0 μL, 2.5 μL, 3.0 μL
图 8 Taq DNA聚合酶用量对选择性扩增的影响
注: M: DL2000 DNA marker; 1~5: Taq DNA聚合酶浓度分别
为 0.2 U, 0.4 U, 0.6 U, 0.8 U, 1.0 U
Figure 8 The effected of selective amplification by amount of Taq
DNA polymerase
Note: M: DL2000 DNA marker; 1~5: The concentration of Taq
DMA polymerase were 0.2 U, 0.4 U, 0.6 U, 0.8 U, 1.0 U
图 9不同引物组合选择性扩增琼脂糖凝胶电泳图谱
注: M: DL2000 DNA marker; 1~10引物组合分别为 E21/M15,
E09/M03, E20/M05, E18/M14, E21/M21, E12/M19, E10/M22,
E14/M20, E17/M17, E01/M11
Figure 9 The aogarose gel electrophoresis of select-amplification
by different combination primers
Note: M: DL2000 DNA marker; 1~10: E21/M15, E09/M03, E20/
M05, E18/M14, E21/M21, E12/M19, E10/M22, E14/M20, E17/
M17, E01/M11
dNTPs 0.3 μL，引物 1.0 μL，TaqDNA聚合酶 0.6 U，加
ddH2O至 20 μL。扩增程序：94℃预变性 4 min；94℃
30 s，65~56℃ (每个循环降 0.7℃) 30 s，72℃ 1 min (循
环 13轮)；394℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min (循环 30
轮)；72℃延伸 10 min；4℃保存。
引物不同对模板 DNA的结合力不同，模板不同
对引物的反应力也不同，这导致扩增产物的长度、分
布、紧密度等可能不一样(郑红梅等, 2008)。因此，在
进行 AFLP分析时，对引物进行筛选是十分有必要
的。以此优化的 AFLP反应体系对桤木属植物进行
引物筛选，以欧洲桤木 A. glutinosa实验材料，鉴定优
化的桤木属植物 AFLP反应体系的稳定性对 64 对
引物进行筛选，其中 10对引物扩增结果和琼脂糖凝
胶电泳结果如图 9。结果表明：6~10号引物组合能扩
增出特异性条带。采用上述体系，用 E12/M19 (E12:
5-GACTGCGTACCAATTCGCA-3; M19: 5-GAT-
GAGTCCTGAGTAAATC-3)引物组合对实验材料
进行选择性扩增，产物 6%聚丙烯酰胺凝胶电泳银染
结果见图 10。结果表明，优化的 AFLP体系能扩增出
清晰可辨别的条带，扩增的信号强度基本一致，片段
分布均匀，扩增条带数为 50条左右。说明优化后建
立的酶切、连接、预扩增、选择性扩增体系与银染体
系能够满足桤木 AFLP实验的要求。
2讨论
AFLP试验分析中，DNA模板限制性内切酶酶
切是否充分、酶切片段 T4 DNA连接酶的连接是否
成功是影响 AFLP试验成功与否的关键，限制性内
切酶及 T4 DNA连接酶的用量根据模板 DNA量而
定。双酶切反应中，限制性内切酶对 DNA的酶切必
须完全彻底，否则扩增后变性聚丙烯电泳会出现多
而密、中下部扩增带稀少的现象，EcoRⅠ较 MseⅠ敏
感，更容易受 DNA质量和体系中各成分的影响，因
此本研究在酶切反应中，采用 EcoRⅠ酶切缓冲液作
为双酶切的缓冲液。本研究优化的桤木属植物基因
组 DNA酶切(EcoRⅠ和 MseⅠ)以模板 300 ng、5 h为
宜。酶切产物的连接要充分，若连接时间过短，在进
行预扩增产物时会因缺少目的片段导致试验失败，
因此连接时间不可过短，可适当延长。本研究结果表
明：连接的时间对酶切产物的连接效果影响不大，酶
切产物 16℃过夜连接为桤木 DNA酶切产物连接较
好的时间。
PCR扩增中对各种反应条件灵敏，要得到好的、
可重复的 AFLP试验结果，必须严格控制 PCR的扩
增条件(Skov, 1998)。高质量的 Taq酶是决定扩增成
败的关键，为保证预扩增特异性，试验时应考虑使用
高保真酶和适当提高退火温度；Mg2+是 DNA聚合酶
桤木属植物 AFLP反应体系的建立与优化
Establishment of the Optimized AFLP Analysis System for Alnus 550
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
图 10 E12/M19引物组合选择性扩增产物银染图谱
注: M: DL2000 DNA marker; 1~29:欧洲桤木; 29~39:东北亚灰桤木
Figure 10 Polyacrylamide gel electrophoresis of different elective amplification primers E12/M19
Note: M: DL2000 DNA marker; 1~29: A. glutinosa; 29~39: A. hirsuta
催化剂，激活 DNA聚合酶；dNTP的用量和浓度与
PCR扩增效率关系密切，dNTP为 Taq DNA聚合酶
的反应提高底物，使得扩增反应的顺利进行，dNTP
浓度过高导致 DNA聚合酶掺入错误，扩增的准确性
低，dNTP浓度过低直接影响扩增效率，甚至导致产
物单链化。可能由于预扩增退火温度较低、引物较短
的原因，在预扩增过程中我们发现，预扩增反应过程
对体系中各成分(如 dNTP浓度, Mg2+浓度和 TaqDNA
聚合酶的用量)的要求不高，各反应成分的浓度对实
验结果没有太大的影响。在取得良好试验结果和节
约试剂的双重考虑下，本研究确定桤木属植物 AFLP
反应体系中 dNTP、Taq DNA聚合酶 Buffer (含Mg2+)、
Taq DNA聚合酶最适用量分别为 0.3 μL、2.0 μL和
0.6 U。预扩增产物的量是影响选择性扩增成效的关
键因素，本研究对预扩增产物进行稀释 10~80倍后
的扩增结果进行比较，发现预扩增产物稀释倍数对
电泳条带结果不会产生较大的影响，预扩增产物稀
释 10~80倍均能扩增出清晰的条带，这与顾翠花等
(2008)等研究结果一致。赵宏等(2002)、张美霞和林多
(2012)认为预扩增产物的稀释倍数对选择性扩增至
关重要，稀释倍数过小，选择性扩增产物聚丙烯酰胺
凝胶电泳银染出现显带弱或不出带的现象，难以检
测多态性；稀释倍数过大，易发生拖带现象，导致银
染结果条带模糊，不利于多态性检测；这可能是由于
材料、仪器设备、试验条件等的不同造成的差异。银
染过程中，洗涤步骤是关键，切忌时间过长，应少量
多次。显影液应冷却至 10℃~12℃，以减少背景杂色。
综上所述，本研究成功建立了适用于桤木属植
物的 AFLP体系，以此体系进行 AFLP扩增，可以获
得清晰的 AFLP指纹图谱，并以此优化体系对桤木属
植物 AFLP选择性扩增引物进行筛选，筛选出 7对扩
增条带清晰、分布均匀、分辨率高的桤木属植物遗传
多样性分析较好的引物组合，为以后利用 AFLP技术
对桤木属植物进行遗传多样性研究以及对桤木属植
物进行辅助育种提供了标准化的程序。
3材料与方法
3.1材料
试验材料为浙江富阳中国林科院亚热带林业研
究所大棚内培养的 4种 3~4年生植物幼苗临近茎尖
端嫩叶，取材后立即放入冰盒中保存，带回实验室，
提取植物组织 DNA。
3.2方法
3.2.1扩增体系优化
酶切片段的扩增在 AFLP分析过程中尤其重要。
本次研究针对 AFLP反应中影响选择性扩增的 5个
关键因子：dNTPs浓度、预扩增产物稀释倍数、引物
用量、Taq DNA聚合酶浓度和 Mg2+浓度进行单因素
优化试验(表1)。
3.2.2模板制备、酶切片段扩增及凝胶电泳分析
采用北京鼎国生物技术公司植物组织 DNA提
取试剂盒提取试验所需 DNA。
取 5 μL提取的 DNA 样品，0.8% Agarose 电泳
检测 DNA分子的完整性；紫外分光光度计检测浓
度和纯度，DNA浓度(μg/mL)=OD260×50×稀释倍数，
OD260/OD280的值应该为 1.7~2.0。
酶切反应体系为 20 μL，各组分为：模板 DNA
300 ng，10×NEB Buffer 2.0 μL，EcoRⅠ (2 000 U/mL)
0.5 μL，MseⅠ (10 000 U/mL) 0.5 μL，BSA 0.2 μL，加
ddH2O补足 20 μL。37℃保温 5 h，65℃ 20 min。
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桤木属植物 AFLP反应体系的建立与优化
Establishment of the Optimized AFLP Analysis System for Alnus
连接反应体系为：12 μL 酶切产物，MseⅠ
(30 pmol/μL)接头 /EcoRⅠ(30 pmol/μL)接头 1.0 μL，
T4 DNA 连接酶(400 U/L) 0.8 μL，T4 DNA 连接酶
Buffer 2.0 μL，ddH2O补足 20 μL。16℃连接 16 h，连
接反应结束后，65℃灭活 20 min，-20℃保存。连接产
物稀释 10倍用于下一步预扩增反应。
欧洲桤木 AFLP初始反应体系为：反应总体积
20 μL，内含 10×Taq DNA聚合酶 Buffer 2.0 μL，Taq
DNA 聚合酶 0.4 μL，dNTP Mixture 0.4 μL，E00 和
M00各 1.0 μL，模板 DNA 5.0 μL，双蒸水补足 20 μL。
预扩增程序为 94℃预变性 4 min；94℃ 30 s，56℃
1 min，72℃ 1 min (扩增 20轮)；72℃延伸加时 10 min；
4℃保存。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测效果(图 3)。
选择性扩增程序为：94℃预变性 4 min；94℃
30 s，65℃~56℃ (每个循环降 0.7℃) 30 s，72℃ 1 min
(扩增 10轮)；然后 94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min
(扩增 30轮)；72℃ 10 min；4℃保存。
扩增结束后，PCR扩增产物(10 mmol/L EDTA,
98%甲酰胺, 0.25%溴酚蓝) 2:1比例混合，95℃变性
5 min，立即冰浴，6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 2 h
(60 W恒功率)。电泳结束后，固定、银染、显影、拍照。
3.2.3AFLP引物的筛选
以优化的 AFLP体系对 64对选择性扩增引物组
合进行筛选。扩增后的样品取 5 μL在 0.8%琼脂糖凝
胶电泳检测扩增效果。选择琼脂糖电泳效果较好的
引物组合对不同的桤木样品(欧洲桤木 A. glutinosa和
东北亚灰桤木 A. hirsuta)进行扩增，6%聚丙烯酰胺
凝胶电泳，银染后观察其扩增结果的优劣。
作者贡献
杨汉波、饶龙兵是本研究的实验设计和实验研
究的执行人；杨汉波、饶龙兵完成数据分析，论文初
稿的写作，郭洪英、段红平及陈益泰参与实验设计，
试验结果分析；饶龙兵是项目的构思者及负责人，指
导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者
都阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究由十二五国家科技支撑项目桤木育种专
题(2012BAD01B0604)和中央级公益性科研院所基
本科研业务费专项资金(RISF2013010)共同资助。
参考文献
Bian Y., 2010, Analysis on genetic variation and DNA methyla-
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表 1 PCR反应体系中处理因素和水平
Table 1 Dispose factors and levels of PCR
水平
Level
1
2
3
4
5
模板 DNA稀释倍数(倍)
Template DNA dilution (times)
10
20
40
60
80
2.5 mmol/L
dNTP (μL)
0.2
0.4
0.8
1.2
1.6
25 mmol/L
Mg2+ (μL)
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
10 μmol/L引物(μL)
10 μmol/L primer (μL)
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
5 U/μL Taq DNA聚合酶(U)
5 U/μL Taq DNA polymerase (U)
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
552
分子植物育种
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