全 文 ：分子植物育种，2011年，第 9卷，第 4期，第 506-513页
Molecular Plant Breeding, 2011, Vol.9, No.4, 506-513
研究报告
A Letter
黄杨属植物 ITS序列分子进化特点分析
王晓锋 刘娜娜 季孔庶 *
林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室,南京林业大学,南京, 210037
*通讯作者, ksji@njfu.edu.cn
摘 要 黄杨属植物种类多，分类较为混乱，特别是中国特有种珍珠黄杨的分类地位和系统进化存有争议，
鉴于此，本文选取黄杨属 5种植物和珍稀濒危植物珍珠黄杨的 5个居群，对其 rDNA ITS序列分析，结合
GenBank中报道的黄杨属其它 9个种，以板凳果属顶花板凳果的 ITS序列为参照，用成对比较的方法对黄杨
属 18种植物的 ITS序列比较发现，黄杨属 ITS序列的碱基替换情况是转换数大于颠换数，ITS-1区间碱基
发生转换和颠换的数目基本相似，而 ITS-2区间碱基发生转换的数目大于颠换数，同样存在于 5.8S区。用朱
克斯和坎托一参数模型和木村两参数模型对黄杨属 ITS序列的替换率计算，无论是 ITS-1、ITS-2还是 5.8S
序列都未达到显著差异。但由于 ITS-2序列碱基的变化转换明显大于颠换，所以两参数模型计算所得结果大
于一参数模型；对黄杨属不同聚类群分子进化相对速率检测发现，该属不同聚类群的 ITS序列分子进化速率
存在明显差异。本研究从相对速率检测和分子系统进化分析发现，珍珠黄杨并非瓜子黄杨的变种，而是属于
姊妹种，并且发现珍珠黄杨与大花黄杨的亲缘关系相对较近。
关键词 黄杨属, ITS序列,分子进化,碱基替换
Analysis the ITS Sequences Characteristic of Molecular Evolution in Buxus
Wang Xiaofeng Liu Nana Ji Kongshu *
Key Laboratory of Forest Genetics & Biotechnology，Ministry of Education, Nanjing Forestry University, Nanjing, 210037
* Corresponding author, ksji@njfu.edu.cn
DOI: 10.3969/mpb.009.000506
Abs tract There are many species in genus Buxus and its taxonomy is confusion, especially for the endemic
Buxus sinica var. parvifolia which is a rare endangered species in China. In this paper, we analyzed molecular
evolution characteristics of ITS sequences from 18 examples by sequence comparison method. There are 14 genus
Buxus species and 5 plant populations of B. sinica var. parvifolia. Compared to the ITS sequence of Pachysandra
terminalis, it indicates there are more transition ratios than transversion ratios that come into being in those ITS
base substitution; In ITS-1 the numbers of base transition are almost same to base transversion; But there are more
base transition ratio than base transversion took place in ITS-2 and 5.8S. There is not distinct difference of base
substitutions in ITS-1, ITS-2 or 5.8S after calculated based on Juks & Cantor’s One Parameter Model and
Kimura’s Two Parameter Model in statistics. The numerical values calculated by Two Parameter Model are larger
than by One Parameter Model, due to more transition ratio than transvertion ratio in ITS-2. The results from
relative rate test showed that different clusters of Buxus had different base evolution rate based on different ITS
sequences regions analyzed. It’s found that the B. sinica var. parvifolia was not the variation of the B. sinica by
Relative Rate Test and Molecular phylogenetic analysised, but both are sister species, also we found that it has
closer genetic relationship between B. sinica var. parvifolia and B. henryi.
Keywords Buxus, ITS sequence, Molecular evolution, Substitution
黄杨属(Buxus)是黄杨科(Buxaceae)中最大的属， 约占其三分之二。本属植物材质细腻，致密美观，适于
基金项目:本研究由“十一五”国家科技支撑项目(2006BAD01A1403)资助
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
属(Pachysandra)顶花板凳果 (Pachysandra terminalis)
的 ITS序列，对序列进行成对比较，统计其碱基发生
转换和颠换的数目(表 1)。结果表明，在 ITS-1区发
生转换和颠换的碱基数目基本相同，而在 ITS-2区
则以转换为主，且明显大于颠换的数目，与史全良等
(2006)杨属(Poplus)植物结果一致，在 5.8S区间有同
样的情况出现，但碱基替换数只有 5~6个，少数几个
种发生明显变化，达到 10个以上。总的 ITS来看，黄
杨属转换数大于颠换数，但是碱基替换总数远远大于
杨属植物的碱基替换总数。说明黄杨属植物 ITS序
列碱基替换已有明显的提高，且碱基替换主要集中
在 ITS-1区，占到总替换数的60%左右。
1.2黄杨属植物的碱基替换率
序列比对发现，信息位点在黄杨属 ITS不同区
间分布不平衡，因此分别进行朱克斯-坎托的一参
数模型和木村的两参数模型计算，以更能反映真实
情况。参照序列采用顶花板凳果 ITS序列(表 2)。
碱基替换率比较发现，在 ITS-1区一参数模型与
两参数模型算得的结果相差很小，两组数据的平均值
相差 0.010 7，t检验得 P值为 0.637 (>0.05)，差异不显
著。同样，在 ITS-2区间两种方法计算结果得知，均
差为 0.006 3，t检验得 P值为 0.707 (>0.05)，说明两种
模型计算的结果差异不显著。5.8S区间用两种方法
得出的结果，均差仅为 0.000 4，进行 t检验得 P值为
0.970 (>0.05)，差异也不显著。整个 ITS区间比较发
现，一参数模型与两参数模型的结果均差为0.003 8，
与 ITS-2更为接近，是由于 ITS-2区碱基在转换和
颠换数上的明显差异导致一参数模型结果小于两参
数模型的结果，所以，采用两参数模型对黄杨属植物
分子进化分析更能反映真实情况。后面分析均采用
两参数模型计算的结果。从变异系数可知，黄杨属
ITS-1的变异系数为 12.4%，ITS-2为 19.3%，后者明
显大于前者，说明 ITS-1的序列变化程度小于 ITS-2。
5.8S序列的变异系数为 63.8%，明显高于前两者，原
因在于 B. glomerate、B. gonoclada、B. citrifolia这三个
种的 5.8S序列发生了明显的变化，它们的碱基转换数
和颠换数都明显增加，导致 5.8S序列变异系数过大。
1.3黄杨属植物相对速率检测
首先采用 phylip软件构建黄杨属植物系统进化
树，以顶花板凳果为外类群，采用 Kimura两参数模
型构建其最大简约树(图 1)。本研究可把黄杨属 18
种植物分成 3大分支，B. macowanii、B. glomerata、
做雕刻、美工及其他工艺品。常见栽培为观赏植物，具
有很强的耐寒性，是园林绿化的良好树种。有些种类
含有黄杨生物碱可用于治疗冠心病等，具有较高的药
用价值。但黄杨属内种的分类及系统进化关系比较混
乱，不同植物志中记载有所不同，有些种之间形态相
似，实际应用中很难区分，为科研工作和实际栽培带
来一定的困扰。对于中国特有种珍珠黄杨(Buxus
sinica var. parvifolia)的分类地位和系统进化关系存有
争议。珍珠黄杨是作为瓜子黄杨(B. sinica)的一个变种
被发表(郑勉, 1980)；林祁(2004)通过对珍珠黄杨的模
式标本研究发现，珍珠黄杨与瓜子黄杨的多种形状存
在明显不同，而珍珠黄杨与皱叶黄杨(B. rugulosa)极为
相似，认为二者是同一种植物。此外，闫双喜等(2002)
对中国黄杨属植物数量分类作了研究，并与形态分类
结果加以比较。近年来，分子分析方法在黄杨属系统
学的研究中应用越来越广泛。王玲玲等(2008)用聚丙
烯酰胺凝胶电泳技术分析了黄杨属三种植物的过氧
化物酶和酯酶同工酶及它们之间的亲缘关系。吕乐燕
和季孔庶(2009a; 2009b)采用同工酶和 ISSR对珍珠
黄杨无性系进行了指纹图谱分析。姜自红等(2008)使
用 RAPD标记对珍珠黄杨 2个天然群体遗传多样性
作了分析。Huang等(2008)利用 RAPD和 ISSR标记
研究了珍珠黄杨 5个天然群体和 1个栽培群体的遗
传结构及其多样性，并探讨了珍珠黄杨相关类群的等
级地位。ITS 是 rDNA 中位于 18S 和 26S 之间，被
5.8S分成两部分，即 ITS-1和 ITS-2的转录间隔区序
列，其具有长度保守性和核苷酸序列的高度变异性，
因此，含有丰富的变异位点和信息位点。ITS是探讨被
子植物属下水平的系统分类与进化研究的重要分子
标记，已在多种植物类群系统演化中得到应用。但通
过 ITS序列对黄杨属植物的系统演化及珍珠黄杨的
分类地位的研究尚未见报道。本实验将采用 PCR产
物直接测序的方式对黄杨属 5个种和中国特有的珍
稀濒危植物珍珠黄杨 5个居群的 rDNA ITS序列进行
分析，进一步探讨黄杨属 ITS序列的主要特点及变化
规律，结合 GenBank中已报道的黄杨属其它种的 ITS
序列，对黄杨属 18个种进行 ITS分析，研究该属 ITS
序列的分子进化规律，同时对珍珠黄杨分类地位和系
统进化关系有更深入的认识。
1结果与分析
1.1黄杨属植物的碱基替换数
参照序列选用与黄杨属亲缘关系较近的板凳果
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黄杨属植物 ITS序列分子进化特点分析
Analysis the ITS Sequences Characteristic of Molecular Evolution in Buxus 508
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
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7
0.
27
4
5
0.
27
6
6
0.
26
5
2
0.
26
9
5
0.
26
3
4
0.
24
2
4
0.
27
5
9
0.
28
7
2
0.
29
4
8
0.
29
4
8
0.
30
0
7
0.
24
3
2
0.
24
2
4
0.
35
1
9
0.
33
0
7
0.
33
1
0
0.
26
6
2
IT
S-
1
IT
S-
2
5.
8S
IT
S
509
图 1黄杨属植物系统发育树
注: *:外类群
Figure 1 Phylogenetic tree of Buxus based on the ITS sequences
Note: *: Outgroup
B. gonoclada 和 B. citrifolia 为一支；锦熟黄杨 (B.
sempervirens)、雀舌黄杨(B. bodinieri)和西班牙黄杨
(B. balearica)为一支；其余则构成第三支。然后将这
三大支分为 7 个聚类群，分别为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、
Ⅵ、Ⅶ，进行相对速率检测，采用 Sarich和Wilson
(1973)提出的相对速率检测法(relative rate test)，结果
见表 3。分析可知，黄杨属不同聚类群的 ITS序列分
子进化速率有差异。黄杨属各聚类群的 ITS-1序列
比较发现，Ⅰ类群进化速率最快，与Ⅲ、Ⅳ差异均极
显著(P<0.01)，其次是Ⅲ类群，进化速率最慢的是Ⅳ
类群，但与Ⅱ、Ⅲ类群差异不显著(P>0.05)；ITS-2序
列分析发现Ⅰ类群进化速率最快，与Ⅲ类群差异显
著，其次是Ⅳ类群，进化速率最慢的是Ⅲ类群，但差
异均不显著；总的 ITS序列分析是Ⅰ类群进化速率
最快，其次是Ⅲ类群，进化速率最慢的是Ⅳ类群，均
达到极显著差异。
2讨论
黄杨属植物 ITS序列碱基转换数和颠换数存在
差异，转换数明显大于颠换数，碱基替换率计算发
现，一参数模型的计算结果小于两参数模型。因此，
在构建系统发育树时采用两参数模型更为合理，结
果更加可靠。这与杨属 ITS序列变化情况(史全良等,
2006) 相似，但是黄杨属碱基总替换数明显增加，且
5.8S碱基转换数增加，可能是选择的参照序列与黄
杨属植物遗传距离较远，ITS序列间差异太大导致碱
基替换数显著增加，或者是黄杨属不同种之间分歧
时间较远，遗传距离过大造成的。相对速率检测发
现，黄杨属 ITS序列在不同聚类群间进化速率明显
不同，只有类群Ⅴ与Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ未达到显著水平，其余
类群间均达到显著性差异水平。目前，针对珍珠黄杨
和瓜子黄杨的亲缘关系及珍珠黄杨的分类地位存有
较大争议。郑勉(1980)认为二者属同一种植物，并认
为前者是后者的变种。本研究发现珍珠黄杨并非瓜
子黄杨的变种，而是属于姊妹种，分子进化速率检测
发现它们的进化速率不同，瓜子黄杨的进化速率明
显高于珍珠黄杨。本实验室同时从染色体核型研究，
结果也表明二者非同种植物，并且发现前者比后者
进化。与此相比，大花黄杨(B. henryi)和珍珠黄杨的
关系更加接近，这也得到核型方面研究结果的支持。
因此，笔者认为，珍珠黄杨并非瓜子黄杨的变种，但
是否可将珍珠黄杨上升为种，还有待通过 matK、rbcL
等基因进行验证。
黄杨属植物种类很多，我国仅有 17种，且主要
分布于西南部地区，因此，植物材料的获取是构建完
整的黄杨属系统进化关系的难度所在，本实验室将
加紧进行该项工作。作者认为，黄杨属不同类群之间
划分的难度与该属植物的种间杂交和形状变异的连
续性有关，如直接从 DNA水平研究该属植物的系统
进化关系，对克服属内同物异名或异物同名的现象，
黄杨属植物的选种、育种和生物多样性研究及园林
应用等将起到极大的推动作用。
分子系统学是根据生物大分子的信息推断生物
进化历史、重建系统发育关系的研究，它的理论基础
是生物大分子在各进化谱系中的进化速率相对恒
定，即“分子钟假说”(唐先华等, 2002)。该假说提出
以来，在高等生物分子系统进化研究中争论较多
黄杨属植物 ITS序列分子进化特点分析
Analysis the ITS Sequences Characteristic of Molecular Evolution in Buxus 510
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
(Muse, 2000)，尤其是在同一生物不同聚类群之间分
子进化速率是否相对一致。有不少学者一直怀疑这
个假说的合理性，以及在实验方面得到了一些证据，
如 Hartl和 Clark (1997)与 Vawter和 Brown (1986)分
别提出不同基因的分子进化速率不同；Zhang 和
Ryder (1993)发现同一基因在不同的生物类群间进
化速率有显著差异。因此同一基因的分子异速进化
现象成为分子钟假说的主要挑战之一 (罗静和张亚
平, 2000)。本试验结果表明黄杨属 ITS基因在碱基
替换速率上具有较大的差异，不同聚类群之间的进
化速率呈现明显差异，这为分子异速进化现象提供
新的证据，同时也是对黄杨属植物系统进化关系有
了更深入的认识。
3材料与方法
3.1实验材料
本实验对中国分布较广泛的黄杨属内 5 种植
物，其中珍珠黄杨选取 5个居群(4个野生种, 1个是
栽培种)进行分子进化研究。此外，还有 9种黄杨属
的植物来自 Genbank，参照序列选用与黄杨属亲缘
关系较近的板凳果属顶花板凳果的 ITS序列(表 4)。
3.2 DNA提取
采用改良的 CTAB 法提取黄杨属植物基因组
组 1/组 2
Group1/Group2
Ⅲ/Ⅰ
Ⅲ/Ⅱ
Ⅳ/Ⅰ
Ⅳ/Ⅱ
Ⅳ/Ⅲ
Ⅳ/Ⅶ
Ⅴ/Ⅰ
Ⅴ/Ⅱ
Ⅴ/Ⅲ
Ⅴ/Ⅳ
Ⅴ/Ⅶ
表 3黄杨属不同聚类群 ITS序列分子进化相对速率检测结果
Table 3 The results of molecular evolution relative ratio test in different clusters of Buxus based on ITS sequences
注:以顶花板凳果的 ITS为参照序列,△K是比较两组总核苷酸替换数的差值,正值表示组 1替换数大于组 2,负值表示组 1替
换数小于组 2; *表示 P<0.05, **表示 P<0.01
Note: Taked Pachysandra terminalis ITS sequence as comparison, △K is the margin of two groups substitution numbers relatively,
positive means that group 1 evolution rate is faster than group 2, negative is reverse; * means P<0.05, ** means P<0.01
△K
-0.0763±0.0185
0.0202±0.0061
-0.1652±0.0343
-0.0687±0.0350
-0.0889±0.0348
-0.1133±0.0337
-0.0610±0.0423
0.0355±0.0468
0.0153±0.0467
0.1042±0.0549
0.0170±0.0410
P
0.009**
0.030*
0.005**
0.121
0.063
0.006**
0.200
0.483
0.756
0.116
0.684
ITS-1
△K
-0.0094±0.0024
-0.0004±0.0026
-0.0051±0.0184
0.0039±0.0184
0.0044±0.0185
0.0005±0.0185
0.1007±0.0238
0.1097±0.0281
0.1102±0.0281
0.1058±0.0320
0.1061±0.0240
P
0.011*
0.877
0.809
0.851
0.825
0.982
0.024*
0.011*
0.011*
0.021*
0.019*
ITS-2
△K
-0.0191±0.0033
0.0092±0.0019
-0.0517±0.0033
-0.0234±0.0018
-0.0326±0.0007
-0.0375±0.0042
0.0256±0.0188
0.0539±0.0220
0.0447±0.0220
0.0773±0.0220
0.0485±0.0140
P
0.002**
0.009**
0.000**
0.000**
0.000**
0.000**
0.223
0.058
0.098
0.017*
0.003**
ITS
DNA，具体参照吕乐燕等(2007)方法提取。
3.3 ITS序列 PCR扩增
PCR反应采用 50 μL体系：双链 DNA模板 50~
100 ng，MgCl2 (25 mmol/L) 4 μL，dNTP (2.5 mmol/L)
6 μL，Taq DNA聚合酶(TaKaRa) 1.75 U，正、反向引
物 0.75 μL (5-AGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTA
GG-3, 20 μmol/L, 5-TCCTCCGCTTATTGATATGC
-3, 20 μmol/L)，加 ddH2O至 50 μL。PCR扩增程序：
94℃预变性 4 min；94℃变性 30 s，57℃退火 30 s，72℃
延伸 1min，进行 30个循环；72℃延伸 7min，最后放置
4℃保存。PCR产物经纯化试剂盒(AxyPrep DNAGel
Extraction Kit)纯化后直接作为测序模板进行测序。
3.4 ITS序列测定
测序由上海英骏生物技术公司完成。采用所报
道的 4 条经典测序引物中位于 5.8S 上的两条 P2
(5-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3)和 P3 (5-CT
GCGTTCTTCATCGATGC-3) (王建波等, 1999)为测
序引物。该引物由上海英骏生物技术公司合成。
3.5统计方法
以板凳果属顶花板凳果 ITS序列为参照，采用
成对比较的原则，统计出所测黄杨属 ITS 的碱基
替换数。采用朱克斯-坎托的一参数模型(Jukes和
511
Cantor, 1969)和木村的两参数模型(Kimura, 1968)对
碱基替换数据进行计算。
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DNA extraction methods and optimization of ISSR-PCR
表 4植物材料及来源
Table 4 The materials used in the research and their source
序号
No.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
名称
Name
珍珠黄杨 A
Buxus sinica var. parvifolia A
珍珠黄杨 B
Buxus sinica var. parvifolia B
珍珠黄杨 C
Buxus sinica var. parvifolia C
珍珠黄杨 D
Buxus sinica var. parvifolia D
珍珠黄杨 E
Buxus sinica var. parvifolia E
锦熟黄杨
Buxus sempervirens
瓜子黄杨
Buxus sinica
大花黄杨
Buxus henryi
雀舌黄杨
Buxus bodinieri
匙叶黄杨
Buxus harlandii
来源
Source
安徽清凉峰(野生)
Qingliangfeng Anhui (wild)
安徽万佛山(野生)
Wanfoshan Anhui (wild)
安徽鹞落坪(野生)
Yaoluoping Anhui (wild)
安徽天柱山(野生)
Tianzhushan Anhui (wild)
江苏如皋(栽培)
Rugao Jiangsu (cultivated)
福建武夷山
Wuyishan Fujian
南京林业大学
Nanjing Forestry University
南京市中山植物园
Zhongshan botanical garden Nanjing
南京市中山植物园
Zhongshan botanical garden Nanjing
Genbank
AF245410
序号
No.
11
12
13
14
15
16
17
18
19
名称
Name
Buxus macowanii
日本黄杨
Buxus microphylla var. japonica
Buxus riparia
西班牙黄杨
Buxus balearica
Buxus glomerata
Buxus gonoclada
琉球黄杨
Buxus liukiuensis
Buxus citrifolia
顶花板凳果 *
Pachysandra terminalis*
来源
Source
Genbank
AF245411
Genbank
AF245412
Genbank
AF245413
Genbank
AF245423
Genbank
AF245426
Genbank
AF245427
Genbank
AF245428
Genbank
AF245433
Genbank
AF245430
注:*:外类群
Note: *: Outgroup
黄杨属植物 ITS序列分子进化特点分析
Analysis the ITS Sequences Characteristic of Molecular Evolution in Buxus 512
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
reaction systems for Buxus sinica var. parvifolia, Fenzi
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